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URN: urn:nbn:de:bvb:20-opus-45967
URL: http://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/volltexte/2010/4596/

Cre-loxP based mouse models to study prionpathogenesis in the motor nervous system

Hochgräfe, Katja

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SWD-Schlagwörter:		Prionkrankheit , Pathogenese , Maus , Motoneuron
Freie Schlagwörter (Englisch):		Prion, pathogenesis
Institut:		Institut für Virologie und Immunbiologie
Fakultät:		Fakultät für Biologie
DDC-Sachgruppe:		Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart:		Dissertation
Erstgutachter:		Klein, M. (Prof.)
Sprache:		Englisch
Tag der mündlichen Prüfung:		17.02.2010
Erstellungsjahr:		2009
Publikationsdatum:		17.02.2010
Kurzfassung auf Englisch:		Prion diseases such as scrapie in sheep, bovine spongiform encephalopathy (BSE) in cattle or Creutzfeldt-Jakob disease (CJD) in humans are fatal neurodegenerative disorders characterized by brain lesions and the accumulation of a disease-associated protein, designated PrPSc. How prions proceed to damage neurons and whether all or only subsets of neurons have to be affected for the onset of the clinical disease is still elusive. The manifestation of clinical prion disease is characterized by motor dysfunctions, dementia and death. Furthermore loss of motor neurons (MN) in the spinal cord is a constant finding in different mouse models of prion disease, suggesting that MN are vulnerable cells for triggering the onset of clinical symptoms. To determine whether the protection of MN against prion induced dysfunctions is an approach for holding the disease at the sub-clinical level, we established a novel conditional model for Cre-mediated expression of a dominant-negative PrP mutant (PrPQ167R) in the cells of interest. Dominant-negative PrP mutants provide protection of prion induced dysfunctions by inhibiting prion replication. Transgenic mice were generated carrying a floxed LacZ marker gene followed by the coding sequence of PrPQ167R under control of the human ubiquitin C promoter. Two Cre strains have been used to direct PrPQ167R expression either to a subset of MN of the spinal cord (Hb9-Cre) or to various neuronal cell populations of the spinal cord and brain (NF-L-Cre). Transgenic mice were infected with mouse-adapted prions via different inoculation routes (intranerval, intracerebral and intraperitoneal) and monitored for effects on incubation time and pathology. Tg floxed LacZ-PrPQ167R/NF-L-Cre mice showed about 15% prolonged survival upon intraperitoneal low dose prion infection, whereas survival of Tg floxed LacZ-PrPQ167R/Hb9-Cre mice was comparable to control littermates. The results suggest that the protection of spinal MN prolongs the incubation period but is not sufficient to completely inhibit clinical prion disease. In a second approach, Cre was transferred into the hind limb muscles of transgenic mice via a double-stranded adeno-associated virus vector (dsAAV2-Cre). The goal of this strategy was to target a broader cell population and thus to enhance expression levels of protective PrPQ167R in the spinal cord of Tg floxed-LacZ-PrPQ167R mice. After intramuscular (i.m.) application of dsAAV2-Cre, exhibiting a physical titer of 5x1010 GP/ml, recombinant transgenic DNA was detected only in the muscle tissue, pointing out that functional Cre-recombinase was expressed at the side of virus application. However, dsAAV2-Cre did neither induce recombination of transgenic DNA in the spinal cord or brain nor expression of dominant-negative PrPQ167R. In conclusion the dsAAV2-Cre vectors system needs further improvement to achieve efficient transport from muscle tissue to the central nervous system (CNS). 105 7 SUMMARY The lymphoreticular system (LRS) is an early site of prion replication. In splenic tissue prion infectivity is associated with follicular dendritic cells (FDC) as well as with Band T-lymphocytes. However, it is still unknown if those cell types are able to replicate the infectious agent or if other PrP-expressing cell types are engaged. To investigate if neurons and in particular MN are involved, transgenic mice carrying one allele of floxed Prnp (lox2+=��) and either one allele of Hb9-Cre or NF-L-Cre were generated on a Prnp0=0 background. Therefore a conditional PrP knockout was established in a subset of MN of the spinal cord (Hb9-Cre) or in various neuronal populations of the spinal cord and brain (NF-L-Cre). Transgenic mice were inoculated with prions to study the accumulation of PrPSc and prion infectivity in spleen and spinal cord at an early time point after infection. The findings show that PrPSc accumulation in mice with MN-specific PrP depletion (lox2+=��/ Hb9-Cre) was comparable to control littermates, while pan-neuronal PrP deficient mice (lox2+=��/NF-L-Cre) were not able to accumulate PrPSc in splenic tissue until 50 days post inoculation. Moreover spleens of lox2+=��/NF-L-Cre mice exhibited a clearly reduced prion infectivity titer, suggesting that accumulation of prions in the spleen is dependent on PrP expression in the nervous tissue.
Kurzfassung auf Deutsch:		Prionenerkrankungen, wie Scrapie beim Schaf, die bovine spongiforme Enzephalopathie (BSE) beim Rind oder die Creutzfeldt-Jakob-Krankheit (CJD) beim Menschen sind letale, neurodegenerative Erkrankungen des zentralen Nervensystems (ZNS). Typische Merkmale der Erkrankung sind neben Neuronenverlust die Akkumulation des mit der Krankheit assoziierten Proteins PrPSc im Gehirn infizierter Individuen. Wie die Akkumulation von Prionen zu Neurodegeneration führt und welche Regionen des ZNS für die klinische Erkrankung verantwortlich sind, ist bisher unbekannt. Charakteristische, klinische Symptome von Prionenkrankheiten sind motorische Störungen sowie Demenz in einem späten Stadium der Erkrankung. Außerdem ist der Verlust von Motoneuronen (MN) im Rückenmark ein konstanter Befund im Tiermodell, was eine Rolle des motorischen Nervensystems bei der Prionpathogenese vermuten lässt. In dieser Arbeit sollte daher untersucht werden, ob der Schutz von MN vor Prionen induzierten Dysfunktionen den Ausbruch der klinischen Erkrankung verzögern kann. Dazu wurde ein konditionales Mausmodell mit Cre-induzierbarer Expression einer dom- inant-negativen PrP-Mutante (PrPQ167R) hergestellt. Dominant-negative PrP Mutanten schützen vor Prionen induzierten Schädigungen, indem sie die Replikation von Prionen inhibieren. Das Transgen besteht aus dem humanen Ubiquitin C Promoter, einem „gefloxten” LacZ Markergen und der kodierenden Sequenz von PrPQ167R. Die Kreuzung von Tg floxed LacZ-PrPQ167R Mäusen mit der Hb9-Cre Linie bewirkt eine MNspezifische Expression von PrPQ167R im Rückenmark, während das Einkreuzen eines NF-L-Cre Allels die Expression von PrPQ167R in den meisten Neuronen des Rückenmarks sowie in verschiedenen motorischen Kerngebieten des Gehirns zur Folge hat. Transgenen Mäuse wurden auf verschiedenen Routen (intranerval, intrazerebral und intraperitoneal) mit Maus-adaptierten Prionen infiziert und der Effekt von PrPQ167R auf die Inkubationszeit und Pathologie der Tiere untersucht. Während Tg floxed LacZPrP Q167R/NF-L-Cre Mäuse eine um 15% verlängerte Inkubationszeit aufwiesen, war bei Tg floxed LacZ-PrPQ167R/Hb9-Cre Mäusen kein Überlebensvorteil zu beobachten. Somit verlängert der Schutz von MN des Rückenmarks zwar die Inkubationszeit, ist aber nicht ausreichend, um den klinischen Ausbruch der Erkrankung zu verhindern. Um eine größere Zellpopulation im Rückenmark von Tg floxed LacZ-PrPQ167R Mäusen und so eine stärkere Expression von PrPQ167R zu erreichen, wurde ein viraler Gentransfer von Cre-Rekombinase durchgeführt. Dazu wurden doppelsträngige, Creexprimierende Adeno-assoziierte Virus Vektoren (dsAAV2-Cre) bilateral in die Muskulatur der Hinterbeine von Tg floxed LacZ-PrPQ167R Mäusen injiziert. Die Applikation von dsAAV2-Cre, mit einem physikalischen Virus-Titer von 5x1010 GP/ml, führte ausschließlich im Muskelgewebe zur Expression von enzymatisch aktiver Cre-Rekombinase und folglich zur Rekombination der transgenen DNA. Im Rücken- 107 8 ZUSAMMENFASSUNG mark oder Gehirn war keine rekombinante DNA detektierbar. Auch auf Protein-Ebene konnte die Expression von PrPQ167R weder im Muskel noch im Rückenmark oder Gehirn nachgewiesen werden. Um den Transport von dsAAV2-Cre vom Applikationsort bis in das ZNS zu gewährleisten und Cre stabil zu exprimieren, ist demnach eine weitere Optimierung des dsAAV2-Cre Vektorsystems notwendig. Prionen replizieren im lymphoretikulären System (LRS) bereits in einem frühen Stadium der Erkrankung. In der Milz ist Prionen-Infektiosität in follikulär dendritischen Zellen (FDC) sowie in B- und T-Lymphozyten lokalisiert. Ob noch andere PrP exprimierende Zellen an der Prionen-Replikation im LRS beteiligt sind, ist unklar. Um die Beteiligung von Neuronen und MN an der Akkumulation von Prionen im LRS zu untersuchen, wurden transgene, neuronal PrP defiziente Mäuse generiert. Ein Neuronen-spezifischer bzw. MN-spezifischer Knockout von PrP wurde durch Kreuzung von transgenen lox2+=�� Mäusen, welche ein „gefloxtes“ Prnp Allel Prnp auf einem Prnp0=0 Hintergrund tragen, mit NF-L-Cre oder Hb9-Cre Mäusen erreicht. Nach Prionen-Infektion von lox2+=��/NF-L-Cre und lox2+=��/Hb9-Cre Mäusen wurde die Akkumulation von PrPSc und Prionen-Infektiosität in der Milz und im Rückenmark am Tag 50 nach der Infektion analysiert. Während die Replikation von PrPSc in der Milz von Mäusen mit MN-spezifischem PrP Knockout (lox2+=��/Hb9-Cre) nicht beeinträchtigt war, war in pan-neuronal PrP defizienten Mäusen (lox2+=��/NF-L-Cre) keine Akkumulation von PrPSc nachweisbar. Zudem war die Prionen-Infektiosität in der Milz von lox2+=��/NF-L-Cre Mäusen deutlich reduziert. Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass die Akkumulation von PrPSc und Prionen-Infektiosität in der Milz abhängig von neuronaler PrP Expression ist.