TY  - THES
A1  - Ruf, Franziska
T1  - The circadian regulation of eclosion in \(Drosophila\)  \(melanogaster\)
T1  - Die zeitliche Steuerung des Adultschlupfes in \(Drosophila\)  \(melanogaster\)
N2  - Eclosion is the emergence of an adult insect from the pupal case at the end of development. In the fruit fly Drosophila melanogaster, eclosion is a circadian clock-gated event and is regulated by various peptides. When studied on the population level, eclosion reveals a clear rhythmicity with a peak at the beginning of the light-phase that persists also under constant conditions. It is a long standing hypothesis that eclosion gating to the morning hours with more humid conditions is an adaption to reduce water loss and increase the survival. Eclosion behavior, including the motor pattern required for the fly to hatch out of the puparium, is orchestrated by a well-characterized cascade of peptides. The main components are ecdysis-triggering hormone (ETH), eclosion hormone (EH) and crustacean cardioactive peptide (CCAP). The molt is initiated by a peak level and pupal ecdysis by a subsequent decline of the ecdysteroid ecdysone. Ecdysteroids are produced by the prothoracic gland (PG), an endocrine tissue that contains a peripheral clock and degenerates shortly after eclosion. Production and release of ecdysteroids are regulated by the prothoracicotropic hormone (PTTH). 
Although many aspects of the circadian clock and the peptidergic control of the eclosion behavior are known, it still remains unclear how both systems are interconnected. The aim of this dissertation research was to dissect this connection and evaluate the importance of different Zeitgebers on eclosion rhythmicity under natural conditions. 
Potential interactions between the central clock and the peptides regulating ecdysis motor behavior were evaluated by analyzing the influence of CCAP on eclosion rhythmicity. Ablation and silencing of CCAP neurons, as well as CCAP null-mutation did not affect eclosion rhythmicity under either light or temperature entrainment nor under natural conditions.
To dissect the connection between the central and the peripheral clock, PTTH neurons were ablated. Monitoring eclosion under light and temperature entrainment revealed that eclosion became arrhythmic under constant conditions. However, qPCR expression analysis revealed no evidence for cycling of Ptth mRNA in pharate flies. To test for a connection with pigment-dispersing factor (PDF)-expressing neurons, the PDF receptor (PDFR) and short neuropeptide F receptor (sNPFR) were knocked down in the PTTH neurons. Knockdown of sNPFR, but not PDFR, resulted in arrhythmic eclosion under constant darkness conditions. PCR analysis of the PTTH receptor, Torso, revealed its expression in the PG and the gonads, but not in the brain or eyes, of pharate flies. Knockdown of torso in the PG lead to arrhythmicity under constant conditions, which provides strong evidence for the specific effect of PTTH on the PG. These results suggest connections from the PDF positive lateral neurons to the PTTH neurons via sNPF signaling, and to the PG via PTTH and Torso. This interaction presumably couples the period of the peripheral clock in the PG to that of the central clock in the brain.
To identify a starting signal for eclosion and possible further candidates in the regulation of eclosion behavior, chemically defined peptidergic and aminergic neurons were optogenetically activated in pharate pupae via ChR2-XXL. This screen approach revealed two candidates for the regulation of eclosion behavior: Dromyosuppressin (DMS) and myo-inhibitory peptides (MIP). However, ablation of DMS neurons did not affect eclosion rhythmicity or success and the exact function of MIP must be evaluated in future studies.
To assess the importance of the clock and of possible Zeitgebers in nature, eclosion of the wildtype Canton S and the clock mutant per01 and the PDF signaling mutants pdf01 and han5304 was monitored under natural conditions. For this purpose, the Würzburg eclosion monitor (WEclMon) was developed, which is a new open monitoring system that allows direct exposure of pupae to the environment. A general decline of rhythmicity under natural conditions compared to laboratory conditions was observed in all tested strains. While the wildtype and the pdf01 and han5304 mutants stayed weakly rhythmic, the per01 mutant flies eclosed mostly arrhythmic. PDF and its receptor (PDFR encoded by han) are required for the synchronization of the clock network and functional loss can obviously be compensated by a persisting synchronization to external Zeitgebers. The loss of the central clock protein PER, however, lead to a non-functional clock and revealed the absolute importance of the clock for eclosion rhythmicity. To quantitatively analyze the effect of the clock and abiotic factors on eclosion rhythmicity, a statistical model was developed in cooperation with Oliver Mitesser and Thomas Hovestadt. The modelling results confirmed the clock as the most important factor for eclosion rhythmicity. Moreover, temperature was found to have the strongest effect on the actual shape of the daily emergence pattern, while light has only minor effects. Relative humidity could be excluded as Zeitgeber for eclosion and therefore was not further analyzed.

Taken together, the present dissertation identified the so far unknown connection between the central and peripheral clock regulating eclosion. Furthermore, a new method for the analysis of eclosion rhythms under natural conditions was established and the necessity of a functional clock for rhythmic eclosion even in the presence of multiple Zeitgebers was shown.
N2  - Der Schlupf adulter Fliegen aus dem Puparium wird in der Taufliege Drosophila melanogaster zum einen von der inneren Uhr und zum anderen von Peptiden gesteuert. Beobachtet man den Schlupf auf der Populationsebene, lässt sich erkennen, dass die meisten Fliegen zu Beginn der Lichtphase schlüpfen. Diese Rhythmizität im Schlupfverhalten von Fliegenpopulationen hält auch unter konstanten Bedingungen an. Seit langer Zeit wird angenommen, dass der Schlupf am Morgen eine Anpassung an feuchte Bedingungen ist, wodurch der Wasserverlust verringert und die Überlebenswahrscheinlichkeit erhöht werden könnte. Das stereotype motorische Schlupfverhalten, mit dem sich die Fliege aus der Puppenhülle befreit, wird durch das gut untersuchte Zusammenspiel zahlreicher Peptide gesteuert. Die wichtigsten Peptide sind hierbei das ecdysis-triggering hormone (ETH), das Schlupfhormon (EH) und das crustacean cardioactive peptide (CCAP). Wie bei jedem Schlupf wird die Häutung durch eine stark erhöhte Produktion des Ecdysteroids Ecdyson ausgelöst. Der anschließende Abfall der Ecdyson-Titer löst dann den Adultschlupf aus. Ecdysteroide werden in der Prothorakaldrüse (PD) gebildet, die eine periphere Uhr besitzt und kurz nach dem Adultschlupf zurückgebildet wird. Das prothorakotrope Hormon (PTTH) reguliert sowohl die Produktion als auch die Freisetzung der Ecdysteroide aus der PD.
Obwohl bereits viel über den Aufbau und die Funktionsweise der inneren Uhr und der Kontrolle des Adultschlupfes durch Peptide bekannt ist, weiß man bisher nicht, wie beide Systeme miteinander interagieren. Das Hauptziel der vorliegenden Arbeit war es, einerseits diese Verbindung zu untersuchen und andererseits die Gewichtung verschiedener Zeitgeber für den Adultschlupf unter natürlichen Bedingungen zu bewerten.
Um eine mögliche Verbindung zwischen der zentralen Uhr und den Peptiden, die das motorische Verhalten während des Schlupfes steuern, zu untersuchen, wurde der Einfluss von CCAP auf die Schlupfrhythmik betrachtet. Hierzu wurden die CCAP-exprimierenden Neurone genetisch ablatiert oder elektrisch stillgelegt, sowie zusätzlich eine CCAP-defiziente Mutante getestet. Weder unter künstlichen Licht- oder Temperaturzyklen, noch unter natürlichen Bedingungen wurden Effekte auf den Schlupfrhythmus bei veränderter CCAP Verfügbarkeit beobachtet.
Die Verbindung zwischen der zentralen und der peripheren Uhr der PD wurde untersucht,  indem die PTTH-exprimierenden Neurone in Fliegen ablatiert wurden. Dies führte sowohl unter konstanten Licht- als auch Temperaturbedingungen zu arrhythmischem Schlupf der Populationen. Die Analyse der Expression von Ptth mRNA mittels qPCR lieferte keine Hinweise auf eine zyklische Regulation des Ptth Transkripts in pharaten Tieren. Um eine Verbindung zu pigment-dispersing factor (PDF)-exprimierenden Uhrneuronen nachzuweisen, wurden die Rezeptoren von PDF (PDFR) und dem short Neuropeptide F (sNPFR) in den PTTH- Neuronen herunterreguliert. Nur der Verlust von sNPFR führte unter konstanten Bedingungen zu arrhythmischem Schlupf. RT-PCR-Analyse der mRNA Expression des Rezeptors von PTTH, Torso, ergab, dass torso mRNA in pharaten Fliegen nur in der PD und in den Gonaden exprimiert wird, nicht jedoch im Gehirn. Das Herrunterregulieren der torso mRNA in der PD führte unter konstanten Bedingungen zu arrhythmischem Schlupf und lieferte deutliche Hinweise zur spezifischen Funktion von PTTH in der PD. Diese Ergebnisse zeigen eine sNPF-vermittelte Verbindung zwischen den PDF-positiven lateralen Neuronen und den PTTH-Neuronen, welche über PTTH und Torso weiter bis in die PD reicht. Durch diese Verbindung wird vermutlich die Periode der peripheren Uhr in der PD an die Periode der zentralen Uhr im Gehirn angepasst.
Um ein Startsignal für den Adultschlupf und weitere mögliche Kandidaten, die eine Rolle in der Steuerung des Schlupfes spielen, zu identifizieren, wurden chemisch definierte kleine Gruppen peptiderger und aminerger Neurone optogenetisch durch das Kanalrhodopsin ChR2-XXL aktiviert. In dieser Testreihe wurden Dromyosuppressin (DMS) und myoinhibitorisches Peptid (MIP) als mögliche Kandidaten ermittelt. Eine Ablation der DMS-Neurone hatte jedoch keine Auswirkungen auf Schlupfrhythmik und -erfolg. Die genaue Funktion von MIP sollte in zukünftigen Experimenten untersucht werden.
Um die Gewichtung der Uhr und möglicher Zeitgeber für das natürliche Verhalten zu bestimmen, wurde der Schlupf des Wildtyps Canton S, der Uhrmutante per01 sowie der PDF-Signalwegsmutanten pdf01 und han5304 (han codiert für den PDFR) unter natürlichen Bedingungen beobachtet. Hierfür wurde ein neues und offenes Aufzeichnungssystem entwickelt: der Würzburger Schlupfmonitor (WEclMon), der einen direkten Kontakt der Puppen mit den sie umgebenden abiotischen Bedingungen ermöglicht.
Im Vergleich zu Laborbedingungen war die Rhythmizität des Schlupfes unter natürlichen Bedingungen in allen getesteten Fliegenlinien weniger ausgeprägt. Während der Wildtyp sowie die pdf01 und han5304 Mutanten weiterhin schwach rhythmisch schlüpften, schlüpfte die per01 Mutante hauptsächlich arrhythmisch. Das Zusammenspiel zwischen PDF und seinem Rezeptor synchronisiert das Uhrnetzwerk, und der Verlust dieser Interaktion kann durch tägliches neues Ausrichten an den Zeitgebern ausgeglichen werden. Der Verlust des Uhrproteins PER unterbindet jedoch die komplette Funktionsfähigkeit der Uhr. Dadurch wird die Notwendigkeit der Uhr für einen rhythmischen Schlupf unterstrichen. Um den Einfluss der Uhr und abiotischer Faktoren auf den Schlupfrhythmus zu untersuchen, wurde im Rahmen einer Kooperation mit Oliver Mitesser und Thomas Hovestadt ein statistisches Modell entwickelt. Die Ergebnisse der Modellierung unterstützen die Hypothese, dass die Uhr der wichtigste Faktor für einen rhythmischen Schlupf auch unter Zeitgeber-Bedingungen ist. Die Umgebungstemperatur übt hingegen den stärksten Einfluss auf die Form des täglichen Schlupfmusters aus, während Licht hier nur einen schwachen Einfluss hat. Es konnte gezeigt werden, dass sich relative Luftfeuchtigkeit nicht als Zeitgeber für den Schlupf eignet, weshalb sie in weiteren Untersuchungen nicht berücksichtigt wurde.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass mit der vorliegenden Arbeit die Verbindung zwischen der zentralen und peripheren Uhr in der Steuerung des Schlupfes identifiziert werden konnten, die bisher nicht bekannt war. Außerdem wurde eine neue Methode der Untersuchung des Adultschlupfes unter natürlichen Bedingungen etabliert und die Notwendigkeit einer intakten Uhr für einen rhythmischen Adultschlupf selbst in Anwesenheit mehrerer Zeitgeber konnte herausgestellt werden.
KW  - Taufliege
KW  - Tagesrhythmus
KW  - Adultschlupfes
Y1  - 2016
UR  - https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/frontdoor/index/index/docId/14626
UR  - https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:bvb:20-opus-146265
ER  -