TY  - THES
A1  - Maier, Sophia Edith
T1  - Mapping membrane receptor distribution on resting platelets combining Expansion Microscopy and fluorescence confocal microscopy
T1  - Kartierung der Membranrezeptorverteilung auf nicht-aktivierten Blutplättchen mithilfe der Kombination aus Expansionsmikroskopie und konfokaler Fluoreszenzmikroskopie
N2  - Stroke and myocardial infarction are the most prominent and severe consequences of pathological thrombus formation. For prevention and/or treatment of thrombotic events there is a variety of anti-coagulation and antiplatelet medication that all have one side effect in common: the increased risk of bleeding. To design drugs that only intervene in the unwanted aggregation process but do not disturb general hemostasis, it is crucial to decipher the exact clotting pathway which has not been fully understood yet. Platelet membrane receptors play a vital role in the clotting pathway and, thus, the aim of this work is to establish a method to elucidate the interactions, clustering, and reorganization of involved membrane receptors such as GPIIb/IIIa and GPIX as part of the GPIb-IX-V complex. The special challenges regarding visualizing membrane receptor interactions on blood platelets are the high abundancy of the first and the small size of the latter (1—3µm of diameter). The resolution limit of conventional fluorescence microscopy and even super-resolution approaches prevents the successful differentiation of densely packed receptors from one another. Here, this issue is approached with the combination of a recently developed technique called Expansion Microscopy (ExM). The image resolution of a conventional fluorescence microscope is enhanced by simply enlarging the sample physically and thus pulling the receptors apart from each other. This method requires a complex sample preparation and holds lots of obstacles such as variable or anisotropic expansion and low images contrast. To increase ExM accuracy and sensitivity for interrogating blood platelets, it needs optimized sample preparation as well as image analysis pipelines which are the main part of this thesis. The colocalization results show that either fourfold or tenfold expanded, resting platelets allow a clear distinction between dependent, clustered, and independent receptor organizations compared to unexpanded platelets.Combining dual-color Expansion and confocal fluorescence microscopy enables to image in the nanometer range identifying GPIIb/IIIa clustering in resting platelets – a pattern that may play a key role in the clotting pathway
N2  - Schlaganfall und Myokardinfarkt sind die wohl bekanntesten und schwerwiegendsten Folgen von pathologischer Thrombenbildung. Zur Vorbeugung und/oder Behandlung thrombotischer Ereignisse gibt es eine Vielzahl von Antiplättchen-Medikamenten wie Aspirin oder Plavix, denen allerdings eine Nebenwirkung gemein ist: das unerwünschte, erhöhte Blutungsrisiko. Um Medikamente zu entwickeln, die tatsächlich nur den Aggregationsprozess unterbinden, die generelle Blutstillung jedoch nicht unterbinden, ist es entscheidend, eine detaillierte Vorstellung der Signalkaskade der Plättchenadhesion und -aktivierung zu bekommen. Da diese bisher noch nicht vollständig verstanden wurde, soll eine Methode zur Aufklärung schneller Wechselwirkungen, Clusterbildung und Reorganisation von Plättchenrezeptoren wie GPIIb/IIIa und GPIX, als Teil des Rezeptorkomplex GPIb-IX-V, etabliert werden. Die besonderen Herausforderungen bei der Visualisierung von Wechselwirkungen von Membranrezeptoren auf Blutplättchen sind sowohl ihre hohe Dichte als auch die geringe Größe der Blutplättchen (1–3μm Durchmesser). Die Auflösungsgrenze der konventionellen Fluoreszenzmikroskopie sowie der superhochauflösenden-Mikroskopie ist nicht in der Lage dicht gepackte Rezeptoren voneinander zu unterscheiden. Eine kürzlich entwickelte Technik namens Expansionsmikroskopie (ExM) bietet hierfür einen Lösungsansatz: Die Bildauflösung von einem herkömmlichen Fluoreszenzmikroskop wird dadurch verbessert, dass Proben physikalisch vergrößert werden, sodass markierte Rezeptoren auseinanderdriften und besser voneinander unterschieden werden können. Dieses Verfahren erfordert eine komplexe Probenvorbereitung und birgt viele Unsicherheiten wie die Variabilität des Expansionsfaktors, die Isotropie des Expansionsprozesses sowie das niedrige Signal-Rausch-Verhältnis in den mikroskopischen Bildern. Um die Genauigkeit und Empfindlichkeit des Ansatzes auf seine Tauglichkeit zur Untersuchung nicht-aktivierter Blutplättchen zu überprüfen, wurde ein Arbeitsablauf für die optimale Probenvorbereitung entwickelt sowie auf wichtige Analysekriterien für die Kolokalisationsanalyse hingewiesen, welches den Hauptteil dieser Arbeit darstellt. Die Ergebnisse der Kolokalisationsanalyse zeigen, dass die vier– beziehungsweise zehnfache Expansion ruhender Blutplättchen eine eindeutige Unterscheidung zwischen abhängigen, geclusterten und unabhängigen Rezeptororganisationen im Vergleich zu nicht expandierten Blutplättchen erlaubt. Die Kombination aus ExM und konfokaler Fluoreszenzmikroskopie ermöglichte die Identifizierung von Clustern der GPIIb/IIIa-Rezeptoren in ruhenden Blutplättchen – ein Vorgang, der möglicherweise eine Schlüsselrolle in der Plättchenaggregation spielt.
KW  - Expansion Microscopy
KW  - platelets
Y1  - 2023
UR  - https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/frontdoor/index/index/docId/30031
UR  - https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:bvb:20-opus-300317
ER  -