@phdthesis{Ivanov2005,
  author    = {Ivanov, Konstantin},
  title     = {Charakterisierung der Helikase- und Endonukleaseaktivit{\"a}ten des Humanen Coronavirus 229E und des SARS-Coronavirus},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-15863},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2005},
  abstract  = {Humane Coronaviren sind wichtige Pathogene, die vor allem mit respiratorischen (z.B. SARS) und enteralen Erkrankungen assoziiert sind. Coronaviren besitzen das gr{\"o}ßte gegenw{\"a}rtig bekannte RNA-Genom aller Viren (ca. 30 Kilobasen). Die Replikation des Genoms und die Synthese zahlreicher subgenomischer RNAs, die die viralen Strukturproteine und einige akzessorische, vermutlich virulenzassoziierte, Proteine kodieren, erfolgt durch die virale Replikase. Die coronavirale Replikase ist ein Multienzym-Komplex, der durch die proteolytische Prozessierung großer Vorl{\"a}uferproteine (Polyproteine pp1a und pp1ab) entsteht und 16 virale Nichtstrukturproteine (nsp), aber auch einige zellul{\"a}re Proteine, beinhaltet. Obwohl die Charakterisierung der Funktionen der einzelnen Proteine und das Verst{\"a}ndnis der molekularen Grundlagen der coronaviralen Replikation noch in ihren Anf{\"a}ngen stecken, ist bereits jetzt klar, dass die an der Replikation beteiligten Mechanismen deutlich komplexer sind als bei den meisten anderen RNA-Viren. Man hofft, dass aus der Untersuchung der einzelnen an der Replikation beteiligten Proteine Erkenntnisse zu den Besonderheiten des Lebenszyklus dieser ungew{\"o}hnlich großen RNA-Viren abgeleitet werden k{\"o}nnen und dass sich daraus auch Ansatzpunkte f{\"u}r die Entwicklung von Inhibitoren einzelner Proteine/Enzyme ergeben, die f{\"u}r eine zuk{\"u}nftige antivirale Therapie genutzt werden k{\"o}nnten. In der vorliegenden Arbeit wurden zwei enzymatische Aktivit{\"a}ten von Coronaviren, eine Helikase und eine Endonuklease, die Teil der coronaviralen Nichtstrukturproteine nsp13 bzw. nsp15 sind, in vitro untersucht. Zur Etablierung allgemeing{\"u}ltiger Prinzipien coronaviraler Enzymaktivit{\"a}ten wurden die homologen Proteine von HCoV-229E und SARS-CoV, also von Vertretern unterschiedlicher serologischer und genetischer Coronavirus-Gruppen, parallel untersucht und ihre Eigenschaften miteinander verglichen. Die nsp13-Helikase des SARSCoronavirus wurde als bakterielles Fusionsprotein exprimiert, und die nsp13-Helikase des humanen Coronavirus 229E wurde in Insektenzellen mittels baculoviraler Vektoren exprimiert. Beide Proteine zeigten Polynukleotid-stimulierbare NTPase- und 5'-3'-Helikase-Aktivit{\"a}ten. Dar{\"u}ber hinaus besaßen sie vergleichbare Hydrolyseaktivit{\"a}ten gegen{\"u}ber den 8 getesteten Ribound Desoxyribonukleosidtriphosphaten. Die Anwesenheit von poly(U) f{\"u}hrte zu einer 3-fachen Erh{\"o}hung der katalytischen Effizienz (kcat/Km) und einer etwa 100-fachen Steigerung der Hydrolysegeschwindigkeit (kcat). Es wurde am Beispiel von HCoV-229E-nsp13 gezeigt, dass Nukleins{\"a}uresubstrate mit hoher Affinit{\"a}t (K50 \&\#8776; 10-8 M), jedoch ohne erkennbare Pr{\"a}ferenz f{\"u}r einzel- oder doppelstr{\"a}ngige DNA- oder RNA-Substrate gebunden werden. Solch eine feste Bindung ist typisch f{\"u}r Enzyme, die prozessiv mit Nukleins{\"a}uren interagieren. Sie korreliert dar{\"u}ber hinaus mit der beobachteten effizienten Entwindung (Trennung) von RNA- und DNADuplexen mit langen, doppelstr{\"a}ngigen Bereichen von 500 Basenpaaren und mehr. Dies legt eine Funktion als replikative Helikase nahe, wie sie beispielweise bei der effektiven Entwindung doppelstr{\"a}ngiger replikativer Intermediate ben{\"o}tigt werden k{\"o}nnte. In dieser Arbeit wurde dar{\"u}ber hinaus eine neue enzymatische Aktivit{\"a}t coronaviraler Helikasen entdeckt. Die gefundene RNA-5'-Triphosphatase-Aktivit{\"a}t nutzt das aktive Zentrum der NTPase-Aktivit{\"a}t und katalysiert wahrscheinlich die erste Reaktion innerhalb der Synthese der Cap-Struktur am 5'- Ende viraler RNAs. Die sehr {\"a}hnlichen biochemischen Eigenschaften der HCoV-229E- und SARS-CoV-Helikasen lassen vermuten, dass die Enzymologie der viralen RNA-Synthese (trotz relativ geringer Sequenzidentit{\"a}t der beteiligten Enzyme) unter den Vertretern unterschiedlicher Gruppen von Coronaviren konserviert ist. Der zweite Teil der Arbeit besch{\"a}ftigte sich mit der biochemischen Charakterisierung des Nichtstrukturproteins nsp15, f{\"u}r das eine Endonuklease-Aktivit{\"a}t vorhergesagt worden war. Auch in diesem Fall wurden die entsprechenden Proteine von HCoV-229E und SARS-CoV charakterisiert. Beide (bakteriell exprimierten) Enzyme zeigten identische enzymatische Eigenschaften. In-vitro-Experimente best{\"a}tigten, dass diese Proteine eine Mn2+-abh{\"a}ngige RNA- (jedoch nicht DNA-) Endonukleaseaktivit{\"a}t besitzen. Sie spalten doppelstr{\"a}ngige RNA deutlich effektiver und spezifischer als einzelstr{\"a}ngige RNA. Die Enzyme spalten an Uridylat-Resten und erzeugen Produkte mit 2', 3'-Zyklophosphat-Enden. Bei doppelstr{\"a}ngigen RNA-Substraten wurde eine Spezifit{\"a}t f{\"u}r 5'-GU(U)-3' gefunden. Die Tatsache, dass diese Sequenz in den nidoviralen transkriptionsregulierenden Sequenzen (TRS) der Minusstr{\"a}nge konserviert ist und auch die Endonuklease bei allen Nidoviren konserviert ist, unterst{\"u}tzt die Hypothese, dass die Endonukleaseaktivit{\"a}t eine spezifische Funktion innerhalb der coronaviralen (nidoviralen) diskontinuierlichen Transkription besitzt.},
  subject      = {Coronaviren},
  language  = {de}
}