@phdthesis{Vicik2004,
  author    = {Vicik, Radim},
  title     = {Synthese und Eigenschaften N-Acylierter Aziridin-2,3-dicarboxylate als selektive, peptidomimetische Inhibitoren von Cystein-Proteasen der Cathepsin-L-Subfamilie},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-11127},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2004},
  abstract  = {Die Cystein-Proteasen der S{\"a}uger und Parasiten wurden erst in den letzten zwei Jahrzehnten als pharmazeutisch/medizinisches Target erkannt. Die genauen Aufgaben der einzelnen Enzyme dieser sehr umfangreichen und st{\"a}ndig wachsenden Protease-Familie bleiben zwar teilweise noch unbekannt, es ist jedoch klar, dass ihre Aufgabe nicht nur der unspezifische Protein-Abbau ist. Das Ziel der vorliegenden Arbeit waren die Synthese einer Reihe peptidomimetischer Inhibitoren mit elektrophilem Aziridin-2,3-dicarbons{\"a}ure-Baustein und deren Testung an den Proteasen Cathepsin B (human), Cathepsin L (Paramecium tetraurelia), Falcipain-2 (Plasmodium falciparum) und Rhodesain (Trypanosoma brucei rhodesiense). Die Verbindungen sind als irreversible Inhibitoren der Proteasen konzipiert. Der Aziridin-Baustein als Elektrophil wird durch den Cystein-Rest des aktiven Zentrums der Proteasen angegriffen, es erfolgt eine nucleophile Ring{\"o}ffnung und damit die irreversible Alkylierung der Proteasen. Die Aziridin-Bausteine wurden entweder stereoselektiv aus Tartraten oder als Racemate aus Fumaraten dargestellt. Durch NMR-spektroskopische Versuche wurde der Mechanismus der Epimerisierung der als Intermediate der stereoselektiven Synthese auftretenden Azidoalkohole aufgekl{\"a}rt. Die N-Acylierung des Aziridin-Bausteins mit den Aminos{\"a}uren bzw. Dipeptiden erfolgte {\"u}ber Segmentkopplungen oder {\"u}ber eine schrittweise Ankn{\"u}pfung der Aminos{\"a}uren. Es wurden dabei verschiedenste Methoden der Peptidchemie eingesetzt. Die Hemmkonstanten der synthetisierten Substanzen wurden in einem kontinuierlichen fluorimetrischen Mikrotiterplatten-Assay bei Inhibitor-Konzentrationen von 0.35 - 140 µM ermittelt. Als Substrat diente f{\"u}r alle Enzyme Z-Phe-Arg-AMC. Der Nachweis der Irreversibilit{\"a}t der Hemmung wurde durch Dialyse-Versuche und die Affinit{\"a}tsmarkierung von Cathepsin L und Falcipain 2 mit Hilfe eines Biotin-markierten Inhibitors erbracht. Bei Inhibitoren, die eine zeitabh{\"a}ngige Hemmung aufweisen, wurden die Alkylierungskonstanten (ki -Werte) ermittelt. Diese sind im Vergleich zu den Konstanten der Epoxysuccinyl-Peptide ca. 1000x kleiner, was fr{\"u}here Untersuchungen best{\"a}tigt. Aus den ermittelten Dissoziationskonstanten (Ki) ist die Selektivit{\"a}t f{\"u}r Cathepsin-L-{\"a}hnliche Proteasen eindeutig. Dabei wird die Reihenfolge RD > CL > FP >>> CB gefunden. Der beste Inhibitor f{\"u}r alle Enzyme ist die Substanz 116C (BOC-(S)-Leu-(S)-Azy-(S,S)-Azi(OBn)2), f{\"u}r die Hemmkonstanten im unteren micromolaren bzw. sogar nanomolaren Bereich gefunden werden. Unter den Substanzen finden sich auch einige, die f{\"u}r einzelne Enzyme selektiv sind. F{\"u}r CL sind es die Verbindungen 517C, 105G, Z-023B, 023A; f{\"u}r CB 034A und 013B und f{\"u}r RD 112C, 222C, 105B, 013A. Dabei gibt es zwei Inhibitoren (105A, 517G), die selektiv nur die parasit{\"a}ren Enzyme FP und RD hemmen. Die Analyse der Struktur-Wirkungs-Beziehungen ergab, dass in Abh{\"a}ngigkeit von den Substituenten am Aziridinring (Benzylester, Ethylester, Dis{\"a}ure), von den Substituenten am Aziridin-Stickstoff (Phe-Ala, Leu-Xxx, Gly-Xxx, Xxx = cyclische Aminos{\"a}ure) und der Stereochemie unterschiedliche Bindungsmodi vorliegen m{\"u}ssen. Erste Docking-Versuche, die in Kooperation mit der Arbeitsgruppe Baumann (Institut f{\"u}r Pharmazie und LMC, Universit{\"a}t W{\"u}rzburg) durchgef{\"u}hrt wurden, best{\"a}tigen dies. Postuliert wird f{\"u}r Inhibitoren, die die Sequenz Leu-Pro enthalten, eine Bindung an die S`- Seite von Cathepsin L. Dies erkl{\"a}rt die Selektivit{\"a}t dieser Inhibitoren, denn innerhalb der S`-Substratbindungstaschen finden sich die gr{\"o}ßten strukturellen Unterschiede zwischen Cathepsin B und den Cathepsin-L-{\"a}hnlichen Proteasen. Im Gegensatz dazu wird f{\"u}r eines der Phe-Ala-Derivate eine Bindung an die S-Taschen postuliert, die zwischen den einzelnen Proteasen geringere strukturelle Unterschiede aufweisen. Dieser Inhibitor hemmt, wie fast alle Phe-Ala-Derivate, dementsprechend auch Cathepsin B besser als die Leu-Xxx-Derivate. In Rahmen einer Kooperation mit der Arbeitsgruppe Engels Institut f{\"u}r Organische Chemie, Universit{\"a}t W{\"u}rzburg) wurden quantenchemische Rechnungen durchgef{\"u}hrt, die u.a. den Einfluss von Substituenten auf die Kinetik und Thermodynamik der nucleophilen Ring{\"o}ffnung untersuchten. Vorhergesagt wurde, dass Substituenten am Aziridin-Stickstoff, die den {\"U}bergangzustand stabilisieren (N-Formyl), zu einer besseren Hemmung f{\"u}hren sollten. Das darauf hin synthetisierte N-Formylaziridin-2,3-dicarboxylat 008B weist eine etwa 5000x bessere Hemmung von CL auf als das nicht-formylierte Diethylaziridin-2,3-dicarboxylat. Die gezielt als "affinity label" entwickelte Biotin-markierte Verbindung 999C wurde zur Identifizierung von Cystein-Proteasen, die von Plasmodium falciparum exprimiert werden, eingesetzt (Kooperation mit der Arbeitsgruppe Gelhaus/Leippe, Institut f{\"u}r Zoologie, Universit{\"a}t Kiel).},
  subject      = {Aziridine},
  language  = {de}
}