@phdthesis{Hoehn2007,
  author    = {H{\"o}hn, Karsten P.},
  title     = {Funktionsanalyse des murinen Replikationsfaktors ORC2},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-23488},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2007},
  abstract  = {F{\"u}r Studien an murinen Initiationsfaktoren wurden in dieser Arbeit die Gene mcm2, orc3, cdc6, cdc7, dbf4 sowie das Gen ttf1 in ihrem chromosomalen Kontext mit Hilfe einer genomischen Bibliothek identifiziert und isoliert. Diese Gene sollen als Ausgang f{\"u}r Zielvektoren von transgenen M{\"a}usen dienen oder f{\"u}r chromosomale Lokalisationsstudien verwendet werden. Weiterhin wurde in dieser Arbeit ein Zielvektor f{\"u}r eine orc2-„knock out"-Maus konstruiert. F{\"u}r den „knock out" wurde eine konditionale Strategie mit dem Cre/loxP-System gew{\"a}hlt, wobei Exon 2-5 von loxP-Stellen flankiert sein sollten. Als Ausgangsmaterial stand ein BAC-Vektor mit einem ca. 200 kb großen genomischen Insert, der das orc2-Gen enth{\"a}lt, zur Verf{\"u}gung. Die erforderlichen Subklonierungen wurden durch die Gr{\"o}ße des Inserts bzw. der daraus gewonnenen orc2-Subfragmente und durch die unbekannten Intronsequenzen negativ beeintr{\"a}chtigt, da sich dadurch die Anzahl an verwendbaren Schnittstellen erheblich reduzierte. Nachdem es letztendlich nicht m{\"o}glich war den vorletzten Schritt der Klonierung abzuschließen, wurde das Projekt aus Zeitgr{\"u}nden eingestellt. Ein weiterer Teil diese Arbeit besch{\"a}ftigte sich mit der Lokalisation des murinen Orc2-Proteins am Centrosom. Bei Studien mit EGFP-gekoppelten murinen Replikationsproteinen zeigten Mcm4p-7p und Orc2p-5p eine Lokalisation am Centrosom. F{\"u}r endogenes Orc2p sollte diese ebenfalls {\"u}berpr{\"u}ft werden. {\"U}ber Immunfluoreszenz-Doppelf{\"a}rbungen mit Antik{\"o}rpern sowohl gegen Orc2p als auch gegen das centrosomale Protein \&\#947;-Tubulin konnte in NIH/3T3-Zellen eine centrosomale Orc2p-Lokalisation best{\"a}tigt werden. Diese trat sowohl in Interphase- als auch in Mitose-Zellen auf. Dar{\"u}ber hinaus wurde von anti-Orc2-Antik{\"o}rpern in Telophase-Zellen eine punktf{\"o}rmige Struktur in der {\"a}quatorialen Ringfurche angef{\"a}rbt. Diese Region entspricht vermutlich der des „midbodys". Zus{\"a}tzlich zu den Immunfluoreszenz-Analysen wurden Immunpr{\"a}zipitationen durchgef{\"u}hrt. Durch diese konnte gezeigt werden, dass Orc2p durch \&\#947;-Tubulin pr{\"a}zipitierbar ist. Solch eine Lokalisation und Interaktion von Orc2p am Centrosom legt eine von der Replikation unabh{\"a}ngige Funktion nahe, wie sie bereits f{\"u}r andere Initiationsfaktoren beschrieben wurde. Um die Funktion von Orc2p genauer untersuchen zu k{\"o}nnen, wurden in einem weiteren Teil dieser Arbeit die Auswirkungen eines Orc2p-"knock downs" auf NIH/3T3-Zellen untersucht. Das dabei verwendete RNAi-System basiert auf einem induzierbaren Expressionssystem, wobei die Orc2-siRNA aus der exprimierten „small hairpin RNA" prozessiert wird. Um eine zeitliche Regulation zu erm{\"o}glichen, wurde das Tet-on-System verwendet. Auf Basis dieser beiden Systeme wurde eine stabile NIH/3T3-TetOn-Orc2siRNA-Zelllinie hergestellt. Zur Vereinfachung zuk{\"u}nftiger Arbeiten mit regulierbaren Expressionssystemen, wurde parallel dazu eine NIH/3T3-Tet-on-Zelllinie, mit Neomycin als Selektionsmarker, hergestellt, in die nur noch der gew{\"u}nschte shRNA-Expressionsvektor transfiziert werden muss. Durch Zugabe von Doxycyclin zum N{\"a}hrmedium wird in den NIH/3T3-TetOn-Orc2siRNA-Zellen die Expression der Orc2-shRNA induziert. Dies l{\"o}st anschließend den RNAi-Mechanismus aus. Es konnte bei diesen Zellen unter Einfluss von Doxycyclin eine deutliche Abnahme der Orc2-Proteinmenge festgestellt werden. Eine Analyse der Proliferationsrate von Zellen unter Doxycyclin-Einfluss ergab schon nach zwei Tagen eine deutliche Verlangsamung der Wachstumsrate. In Dox-behandelten Zellen f{\"u}hrte die Orc2-shRNA-Expression zu einer ver{\"a}nderten Verteilung der Zellen auf die Zellzyklus-Phasen. Es konnte nach sieben Tagen eine Akkumulation der Zellen in der G2/M-Phase, nach 14 Tagen aber in der G1-Phase gezeigt werden. Diese Auswirkungen des Orc2p"knock downs" stehen im Einklang mit dessen Funktion als Initiationsprotein. Weiterhin konnten w{\"a}hrend der Doxycyclin-Behandlung von NIH/3T3-TetOn-Orc2siRNA-Zellen auff{\"a}llig viele multinukle{\"a}re Zellen, bzw. Zellen die {\"u}ber Zytoplasmabr{\"u}cken verbunden waren, beobachtet werden. Dies deutet darauf hin, dass bei Zellen mit einer reduzierten Orc2-Proteinmenge die Cytokinese beeintr{\"a}chtigt ist. Des weiteren zeigten sich auch Zellen mit einer ungeraden Anzahl von Kernen sowie Kerne verschiedener Gr{\"o}ße. Eine F{\"a}rbung dieser Zellen mit Propidiumiodid ergab, dass alle Tochterkerne Nukleins{\"a}uren enthalten. Dies deutet darauf hin, dass nicht in allen Zellen die DNA in gleichen Teilen auf die Tochterkerne verteilt wird. Eine ungerade Anzahl an Kernen weist darauf hin, dass diese sich in unterschiedlichen Zellzyklus-Phasen befinden k{\"o}nnen. Da vielkernige Zellen auch bei Beeintr{\"a}chtigung des Spindelfaserapparates auftreten k{\"o}nnen, wurden bei Doxycyclin-behandelten NIH/3T3-TetOn-Orc2siRNA-Zellen Immunfluoreszenzf{\"a}rbungen mit anti-\&\#946;-Tubulin-Antik{\"o}rpern durchgef{\"u}hrt. Es konnte gezeigt werden, dass Zellen, die Orc2-siRNA exprimieren, diffus verteilte, unregelm{\"a}ßig organisierte Mikrotubuli aufweisen. Dies spricht daf{\"u}r, dass Orc2p neben seiner Funktion als Replikationsprotein noch weitere Aufgaben in der Mitose bzw. Cytokinese besitzt.},
  language  = {de}
}