@phdthesis{Schuetz2005,
  author    = {Sch{\"u}tz, Monika},
  title     = {Dynamik und Funktion der HMG-Proteine},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-15627},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2005},
  abstract  = {HMG-Proteine sind Architekturelemente des Chromatins und regulieren durch ihre Bindung an das Chromatin auf verschiedene Weise DNA-abh{\"a}ngige Prozesse wie Replikation, Transkription und DNA-Reparatur. Um zu verstehen, wie HMG-Proteine ihre vielf{\"a}ltigen Funktionen erf{\"u}llen k{\"o}nnen, wurde mit Hilfe von EGFP- und DsRed2-Fusionsproteinen ihre Funktion in vivo untersucht. Im Wesentlichen wurde dabei mit Hilfe von Bleichtechniken ihr dynamisches Verhalten charakterisiert. Daneben wurde f{\"u}r die HMGN-Proteine ihr bislang unbekanntes Expressionsverhalten in Tumorzellen bestimmt. So konnte f{\"u}r die HMGN-Proteine gezeigt werden, dass bestimmte Tumorzelllinien (HT-29, FTC-133, MCF-7, RPMI 8226, 697, Ishikawa, LNCap) eine relativ erh{\"o}hte Expression von HMGN2 aufweisen, die mit der Tumordifferenzierung korreliert. Eine relativ verringerte Expression von HMGN1 steht dagegen in Mammakarzinomen und Non-Hodgkin-Lymphomen in direktem Zusammenhang mit der Aggressivit{\"a}t der Tumore. Somit kann die HMGN-Expression bei diesen Tumoren als diagnostischer Marker verwendet werden. FRAP-Analysen mit EGFP-Fusionsproteinen f{\"u}hrten zu der Erkenntnis, dass HMGN1, HMGN2, HMGA1a, HMGA1b und HMGB1 sich sehr schnell durch den Zellkern bewegen und nur transient an das Chromatin gebunden sind. Es konnte gezeigt werden, dass die spezifischen DNA/Chromatin-Bindungsmotive im Wesentlichen entscheiden, wo die Bindung der HMG-Proteine in vivo erfolgt, ihre Verweildauer im Euchromatin, Heterochromatin und zellzyklusabh{\"a}ngig dann aber durch Modifikationen (Phosphorylierungen, Acetylierungen) reguliert wird. Dies wurde beispielhaft durch punktmutierte und deletierte Fusionsproteine, sowie durch Inkubation der Zellen mit spezifischen Drogen f{\"u}r die HMGA1a-Proteine gezeigt. FRAP-Analysen haben außerdem gezeigt, dass die Spleißvarianten hHMGA1a und hHMGA1b unterschiedliche kinetische Parameter besitzen. Dies zeigt, dass beiden Varianten unterschiedliche Funktionen zugesprochen werden k{\"o}nnen. Die gefundenen spezifischen, transienten Verweildauern der einzelnen HMG-Proteine f{\"u}hren zu einem Modell eines dynamischen Chromatin-Netzwerkes, wobei alle HMG-Proteine in Wechselwirkungen innerhalb eines dynamischen Chromatinprotein-Cocktails DNA-abh{\"a}ngige Prozesse regulieren k{\"o}nnen. Die jeweiligen, wie hier gezeigt, durch Modifikationen regulierten Verweildauern der HMG-Proteine bestimmen dar{\"u}ber, welche anderen Chromatinproteine wie lange am Chromatin verbleiben und bestimmte Funktionen, wie beispielsweise die Modifikation der Core-Histone, {\"u}bernehmen k{\"o}nnen. Die dynamischen Parameter einzelner HMG-Proteine erkl{\"a}ren so, wie diese Proteine ihre vielf{\"a}ltigen Funktionen als Architekturelemente und bei der Regulation DNA-abh{\"a}ngiger Prozesse erf{\"u}llen k{\"o}nnen. Einige Vertreter, wie die HMGB1-Proteine, bewegen sich so schnell durch den Zellkern, dass ihre kinetischen Parameter durch das beschr{\"a}nkte zeitliche Aufl{\"o}sungsverm{\"o}gen konfokaler Mikroskope der {\"a}lteren Generation nicht erfassbar sind. Die Bestimmung von Dosis-Wirkungs-Beziehungen von Drogen, welche die kinetischen Parameter von HMGB1-Proteinen beeinflussen k{\"o}nnen, ist inzwischen mit Mikroskopen der neuen Generation m{\"o}glich. Im Verlaufe der Arbeit zeigte sich, dass andere verwendete Fluorophore wie DsRed2 die kinetischen Eigenschaften von HMG-Fusionsproteinen beeinflussen k{\"o}nnen. Durch eine erh{\"o}hte Verweildauer k{\"o}nnen auch sehr transiente Interaktionen sichtbar gemacht werden. Wie gezeigt wurde, kann eine erh{\"o}hte Verweildauer aber auch zur Verdr{\"a}ngung anderer Proteine f{\"u}hren, die die gleichen Bindungsstellen benutzen und so eine Modulation des Chromatins bewirken. Die Nutzung von DsRed-Fluorophoren erm{\"o}glicht interessante neue Erkenntnisse. Diese m{\"u}ssen aber stets vor dem Hintergrund eines ver{\"a}nderten dynamischen Verhaltens der Fusionsproteine interpretiert werden. Zusammengenommen liefern die hier vorgestellten Ergebnisse zur Dynamik der HMG-Proteine grundlegende Informationen, die zur Kl{\"a}rung ihrer Funktion bei Chromatinmodulationen, etwa bei Differenzierungsprozessen oder der Entstehung von Tumorzellen entscheidend beitragen. Die Erkenntnis, dass diese Proteine lediglich transiente Interaktionen mit ihren Bindungspartnern eingehen k{\"o}nnen, sind im Hinblick auf die Behandlung von Tumoren, bei denen HMG-Proteine im Vergleich zu Normalgewebe h{\"a}ufig {\"u}berexprimiert sind, von großer Bedeutung.},
  subject      = {HMG-Proteine},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Mai2005,
  author    = {Mai, Nikola},
  title     = {Expression und Isolierung des BMP-bindenden Proteins Ep45},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-15311},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2005},
  abstract  = {Die BMPs (Bone morphogenetic proteins) sind Zytokine, die in fast allen Tieren exprimiert werden und zur TGF-\&\#946; Superfamilie geh{\"o}ren. Sie spielen eine wichtige Rolle in der Knochenentwicklung, unter anderem auf Grund ihrer F{\"a}higkeit, die Neubildung von Knochen auszul{\"o}sen. Eine weitere Aufgabe der BMPs liegt in der Beeinflussung der Embryogenese. Hier tragen sie zur Differenzierung der einzelnen Keimbl{\"a}tter bei und werden w{\"a}hrend der Organogenese in vielen Organanlagen exprimiert. Ep45, ein Protein aus Xenopus laevis, geh{\"o}rt zur Familie der Serinproteaseinhibitoren und ist ein extrazellul{\"a}rer Ligand von BMP4, ohne jedoch dessen Rezeptorbindung bzw. dessen Aktivit{\"a}t zu beeinflussen. Ep45, auch bekannt unter dem Namen pNiXa, wird in der Embryogenese von Xenopus laevis wirksam: Es induziert die Reifung von Oozyten, kann im weiteren Verlauf in verschiedenen Organanlagen nachgewiesen werden und wird in Zusammenhang gebracht mit Teratogenit{\"a}t, die durch Ni2+ hervorgerufen wird. Um auf die aufwendige Isolierung von Ep45 aus Xenopus-Oozyten bzw. -Embryonen verzichten zu k{\"o}nnen, sollte in dieser Arbeit eine Methode zur rekombinanten Expression und Isolierung von aktivem Ep45 entwickelt werden. Zun{\"a}chst wurde die Expression von Ep45 in E. coli als l{\"o}sliches Einzelprotein mit dem Vektor pET25b(+) angestrebt. Da sich jedoch zeigte, dass das Protein zum Großteil als unsl{\"o}sliche Aggregate in Form von inclusion bodies vorlag, wurden diese pr{\"a}pariert, denaturiert und eine Isolierung von Ep45 durch verschiedene Chromatographie-Verfahren (Kationenaustauschers{\"a}ule, Gelchromatographie) unternommen. Durch die nachfolgenden Renaturierungsversuche konnte jedoch kein aktives Protein gewonnen werden. Zum Nachweis von aktivem Ep45 dienten ein Enzymassay, der auf der Serinproteaseinhibitor-Funktion von Ep45 beruht, sowie ein Bindungsassay. Dieser weist den Ep45-Chymotrypsin-Komplex nach, der bei der Inhibition von Chymotrypsin durch Ep45 entsteht. Als alternatives Expressionssystem kam deshalb das pMal™-Fusionsprotein-System zur Anwendung. Dazu wurde Ep45 an MBP gekoppelt, so dass eine Aufreinigung mittels Chromatographie an einer Amyloses{\"a}ule m{\"o}glich werden sollte. Nach Spaltung durch Faktor Xa sollten die beiden Proteine durch Chromatographie voneinander getrennt werden, so dass schließlich Ep45 als reines aktives Protein vorliegt. Trotz des Einsatzes diverser Chromatographie-Verfahren (Ionentauschers{\"a}ule, hydrophobe S{\"a}ule, Nickels{\"a}ule) gelang keine Isolierung von Ep45. Da in E. coli zwar eine Expression jedoch keine Aufreinigung von aktivem Ep45 gelang, wurde ein Expressionssystem unter Verwendung von Sf9-Zellen (Insektenzellen) eingesetzt. Nach Herstellung des Plasmids pIZT/V5-xEp45 wurden Versuche zur transienten Expression von Ep45 in Sf9-Zellen mittels des InsectSelect™ Systems durchgef{\"u}hrt, die bis zum Abschluss meiner praktischen Arbeit nicht zum Erfolg f{\"u}hrten, aber innerhalb der Arbeitsgruppe weiter bearbeitet werden.},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Masek2005,
  author    = {Masek, Pavel},
  title     = {Odor intensity learning in Drosophila},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-15546},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2005},
  abstract  = {It has been known for a long time that Drosophila can learn to discriminate not only between different odorants but also between different concentrations of the same odor. Olfactory associative learning has been described as a pairing between odorant and electric shock and since then, most of the experiments conducted in this respect have largely neglected the dual properties of odors: quality and intensity. For odorant-coupled short-term memory, a biochemical model has been proposed that mainly relies on the known cAMP signaling pathway. Mushroom bodies (MB) have been shown to be necessary and sufficient for this type of memory, and the MB-model of odor learning and short-term memory was established. Yet, theoretically, based on the MB-model, flies should not be able to learn concentrations if trained to the lower of the two concentrations in the test. In this thesis, I investigate the role of concentration-dependent learning, establishment of a concentration-dependent memory and their correlation to the standard two-odor learning as described by the MB-model. In order to highlight the difference between learning of quality and learning of intensity of the same odor I have tried to characterize the nature of the stimulus that is actually learned by the flies, leading to the conclusion that during the training flies learn all possible cues that are presented at the time. The type of the following test seems to govern the usage of the information available. This revealed a distinction between what flies learned and what is actually measured. Furthermore, I have shown that learning of concentration is associative and that it is symmetrical between high and low concentrations. I have also shown how the subjective quality perception of an odor changes with changing intensity, suggesting that one odor can have more than one scent. There is no proof that flies perceive a range of concentrations of one odorant as one (odor) quality. Flies display a certain level of concentration invariance that is limited and related to the particular concentration. Learning of concentration is relevant only to a limited range of concentrations within the boundaries of concentration invariance. Moreover, under certain conditions, two chemically distinct odorants could smell sufficiently similarly such, that they can be generalized between each other like if they would be of the same quality. Therefore, the abilities of the fly to identify the difference in quality or in intensity of the stimuli need to be distinguished. The way how the stimulus is analyzed and processed speaks in favor of a concept postulating the existence of two separated memories. To follow this concept, I have proposed a new form of memory called odor intensity memory (OIM), characterized it and compared it to other olfactory memories. OIM is independent of some members of the known cAMP signaling pathway and very likely forms the rutabaga-independent component of the standard two-odor memory. The rutabaga-dependent odor memory requires qualitatively different olfactory stimuli. OIM is revealed within the limits of concentration invariance where the memory test gives only sub-optimal performance for the concentration differences but discrimination of odor quality is not possible at all. Based on the available experimental tools, OIM seems to require the mushroom bodies the same as odor-quality memory but its properties are different. Flies can memorize the quality of several odorants at a given time but a newly formed memory of one odor interferes with the OIM stored before. In addition, the OIM lasts only 1 to 3 hours - much shorter than the odor-quality memory.},
  subject      = {Taufliege},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Motsch2005,
  author    = {Motsch, Isabell},
  title     = {Lamin A and lamin C are differentially dysfunctional in autosomal dominant Emery-Dreifuss muscular dystrophy},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-15360},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2005},
  abstract  = {Emery-Dreifuss muscular dystrophy (EDMD) is a rare genetic disorder characterised by early contractures of the elbows, Achilles tendons and spine, slowly progressive muscle wasting and cardiomyopathy associated with cardiac conduction defect. The autosomal dominant form is caused by mutations in the LMNA gene which gives rise to lamin A and lamin C proteins by alternative splicing. These A-type lamins, together with B-type lamins, form the nuclear lamina, a network of intermediate filament proteins underlining the nuclear envelope. In order to ascertain the role lamin A and C separately contribute to the molecular phenotype, we analysed ten LMNA mutations and one single nucleotide polymorphism (SNP) in transfection studies in COS7 fibroblasts and, partially, in C2C12 myoblasts. The EGFP or DsRed2 tagged lamins were exogenously expressed either individually or both A-types together and examined by light and electron microscopy. The protein mobility of lamin A mutants was determined by FRAP analysis. Additionally, a co-immunoprecipitation binding assay of in vitro synthesised A-type lamins and emerin was performed.Eight of the LMNA mutations (R50S, R133P, E358K, E358K+C<T1698, E361K, R527P, L530P, R541S and G602S) and the SNP C<T1698, when expressed in lamin A, exhibited a range of nuclear mis-localisation patterns from a wild type phenotype to the formation of nuclear aggregates. Two mutations (T150P and delQ355) led to the severe mis-localisation of the exogenous protein and additionally affected nuclear envelope reassembly and mid-body protein composition after mitosis. Exogenously expressed DsRed2 tagged wild type and mutant lamin C was only inserted into the nuclear lamina if co-expressed with the equivalent EGFP tagged lamin A construct, except for the T150P mutation which prevented either lamin from reaching the nuclear lamina. The T150P, R527P and L530P mutations reduced the ability of lamin A, but not lamin C from binding to emerin. These data indicate that mutations in the rod domain of lamin A mainly impair its function as a structural protein, whereas mutations of the globular tail domain appear to disrupt protein-protein interactions important for gene regulation and signal transduction processes. In addition, our results suggest specific functional roles for the emerin-lamin A and emerin-lamin C containing protein complexes; this is the first report to propose that the A-type lamin mutations may be differentially dysfunctional for the same LMNA mutation.},
  subject      = {Muskeldystrophie},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Schindelin2005,
  author    = {Schindelin, Johannes},
  title     = {The standard brain of Drosophila melanogaster and its automatic segmentation},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-15518},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2005},
  abstract  = {In this thesis, I introduce the Virtual Brain Protocol, which facilitates applications of the Standard Brain of Drosophila melanogaster. By providing reliable and extensible tools for the handling of neuroanatomical data, this protocol simplifies and organizes the recurring tasks involved in these applications. It is demonstrated that this protocol can also be used to generate average brains, i.e. to combine recordings of several brains with the same features such that the common features are emphasized. One of the most important steps of the Virtual Insect Protocol is the aligning of newly recorded data sets with the Standard Brain. After presenting methods commonly applied in a biological or medical context to align two different recordings, it is evaluated to what extent this alignment can be automated. To that end, existing Image Processing techniques are assessed. I demonstrate that these techniques do not satisfy the requirements needed to guarantee sensible alignments between two brains. Then, I analyze what needs to be taken into account in order to formulate an algorithm which satisfies the needs of the protocol. In the last chapter, I derive such an algorithm using methods from Information Theory, which bases the technique on a solid mathematical foundation. I show how Bayesian Inference can be applied to enhance the results further. It is demonstrated that this approach yields good results on very noisy images, detecting apparent boundaries between structures. The same approach can be extended to take additional knowledge into account, e.g. the relative position of the anatomical structures and their shape. It is shown how this extension can be utilized to segment a newly recorded brain automatically.},
  subject      = {Taufliege},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Williams2005,
  author    = {Williams, Tatjana},
  title     = {Untersuchungen zur Rolle des Phosphoproteins Stathmin in Listeria monocytogenes-infizierten S{\"a}ugerzellen und Molekulare Charakterisierung der listeriellen Zweikomponetensysteme},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-15388},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2005},
  abstract  = {Das fakultativ intrazellul{\"a}re Bakterium Listeria monocytogenes besitzt die F{\"a}higkeit, eukaryotische Wirtszellen zu penetrieren, sich in diesen zu vermehren, fortzubewegen und zwischen den Zellen auszubreiten. Im Zuge des intrazellul{\"a}ren Lebenszyklus gehen Listerien Wechselwirkungen mit ver-schiedenen zellul{\"a}ren Proteinen ein. Als eines dieser Proteine konnte das zellul{\"a}re Phosphoprotein Stathmin identifiziert werden. Dieses Protein bindet an Untereinheiten des Tubulins und destabilisiert dadurch Mikrotubuli (MT). Es wird durch Phosphorylierung von vier spezifischen Serinresten in seiner MT-destabilisierenden Aktivit{\"a}t reguliert. Da Stathmin als Antwort auf externe Signale zellul{\"a}re Funktionen, z. B. Zell-Proliferation und Differenzierung reguliert, vermutet man seine Funktion in einer Art Relais welches verschiedene Signale aus dem Umfeld der Zelle integriert. In mit L. monocytogenes infizierten Wirtszellen wird Stathmin an die Oberfl{\"a}che intrazellul{\"a}rer Bakterien rekrutiert. Inwiefern diese Rekrutierung das Phosphorylierungsmuster von Stathmin und damit dessen Aktivit{\"a}t beeinflusst, konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht gekl{\"a}rt werden. Stathmin knock-out M{\"a}use sollten sich gut eignen, um die Rolle von Stathmin w{\"a}hrend einer Infektion mit L. monocytogenes EGD in vitro und in vivo zu untersuchen. Es stellte sich heraus, dass in Stathmin(-/-)-Makrophagen der intrazellul{\"a}re Lebenszyklus der Listerien nicht signifikant beeinflusst ist. Nach intraven{\"o}ser Verabreichung von 5x103 L. monocytogenes waren drei Tage nach der Infektion in Leber und Milz der knock-out M{\"a}use allerdings signifikant mehr Listerien nachzuweisen, als in den Organen wildtypischer M{\"a}use. Mittels Immunfluoreszenzmikroskopie und einem anti-Stathmin-Antiersum konnte an mit verschiedenen L. monocytogenes-Mutanten infizierten Zellen gezeigt werden, dass Stathmin mit der Oberfl{\"a}che intrazellul{\"a}rer Listerien kolokalisiert. Allerdings konnten dabei die Angaben in der Literatur nicht best{\"a}tigt werden, wonach f{\"u}r diese Kolokalisation die Expression von ActA notwendig ist. Die Ergebnisse dieser Arbeit sprechen im Gegensatz zu den publizierten Daten daf{\"u}r, dass Stathmin {\"u}ber einen bisher noch unbekannten Mechanismus ActA-unabh{\"a}ngig an intrazellul{\"a}re Listerien rekrutiert wird. Zweikomponentensysteme erm{\"o}glichen Bakterien eine rasche Anpassung an sich ver{\"a}ndernde Umweltbedingungen, da sie extra- und intrazellul{\"a}re Stimuli in zellul{\"a}re Signale umwandeln. Um die 16 in der Genomsequenz von L. mono-cytogenes EGDe identifizierten Zweikomponentensysteme charakterisieren zu k{\"o}nnen, wurden individuelle Mutanten konstruiert, in denen individuelle Response Regulatorgene deletiert sind. Die erhaltenen Mutanten wurden in vitro und in vivo auf ihr Wachstumsverhalten hin untersucht. Es zeigte sich, dass unter den angewandten Kultur- und Versuchsbedingungen keines der Zweikomponentensysteme eine signifikante Rolle bei der Anpassung an Temperatur, sowie an oxidativen oder osmotischen Stress spielt. Die Zugabe von 5 \% Ethanol hatte einen stark hemmenden Effekt auf das Wachstum von 4 Mutanten, wohingegen zwei andere Mutanten in Gegenwart des Alkohols deutlich besser wuchsen. Unter anaeroben Bedingungen konnte kein Unterschied im Wachstum beobachtet werden. Die Expression wichtiger Virulenzgene war in keiner der untersuchten Mutanten im Vergleich zum Ausgangsstamm ver{\"a}ndert. Die intrazellul{\"a}re Replikation sowie intrazellul{\"a}re Bewegung und Ausbreitung im Zellrasen waren durch die Deletion der Response Regulatorgene nicht beeintr{\"a}chtigt. Abgesehen von geringen Unterschieden in der Invasivit{\"a}t einiger Deletionsmutanten f{\"u}r Cos-1 und Caco-2 Zellen zeigte sich keiner der Response Regulatoren f{\"u}r den intrazellul{\"a}ren Lebenszyklus von L. monocytogenes erforderlich. Es zeigte sich, dass der in der vorliegenden Arbeit verwendete L. monocyto-genes-Wildstamm auch bei der f{\"u}r die Flagellenexpression normalerweise nicht-permissiven Temperatur von 37° C noch beweglich ist. Die L. monocytogenes \&\#916;degU-Mutante war dagegen auf Weichagar temperaturunabh{\"a}ngig unbeweglich. Die elektronenmikroskopische Analyse ergab, dass dieser Stamm im Gegensatz zum Wildtyp auch bei 24° C keine Flagellen ausbildet. Durch vergleichende Proteomanalysen konnte gezeigt werden, dass L. monocytogenes \&\#916;degU bei 24° C wesentliche Proteine des Flagellenapparates nicht synthetisiert. Mittels Transkriptomanalysen konnten die Ergebnisse der Proteomanalysen best{\"a}tigt werden. Es wurden neben Genen, die f{\"u}r Proteine der Flagellenbiosynthese und Chemotaxis codieren, noch weitere Gene identifiziert, die offensichtlich unter der transkriptionellen Kontrolle des Response Regulators DegU stehen. Die Ergebnisse der in vivo Studien zeigten, dass L. monocytogenes \&\#916;degU deutlich virulenzattenuiert ist. F{\"u}r die restlichen L. monocytogenes \&\#916;TCS-Mutanten waren im Vergleich zum Wildtyp die Unterschiede in Leber und Milz nur leicht ver{\"a}ndert und statistisch nicht signifikant.},
  subject      = {Phosphoproteine},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Schrama2004,
  author    = {Schrama, David},
  title     = {T-Zell-priming außerhalb sekund{\"a}rer lymphatischer Gewebe},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-15060},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2004},
  abstract  = {T-Zellimmunantworten werden normalerweise durch folgenden Weg initiiert: unreife dendritische Zellen nehmen Antigen in der Peripherie auf, wandern in die sekund{\"a}ren lymphatischen Organe, wobei sie auf ihrem Weg sowohl reifen als auch das Antigen prozessieren. In den sekund{\"a}ren lymphatischen Organen angekommen, pr{\"a}sentieren sie als reife dendritische Zellen den T-Zellen die Antigene in Form von Peptiden zusammen mit kostimulierenden Molek{\"u}len. Dadurch rufen sie eine spezifische T-Zellantwort hervor. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob nicht Situationen herbeigef{\"u}hrt werden k{\"o}nnen, die ein T-Zell priming außerhalb der sekund{\"a}ren lymphatischen Organe erlauben. Dazu wurden ein murines Modell, bei dem das Zytokin Lymphotoxin-alpha spezifisch am Tumor angereichert wurde, und ein humanes Modell, bei dem reife, antigenbeladene DC intradermal appliziert wurden, untersucht. Im murinen Modell zeigte sich, dass die gerichtete Anreicherung von Lymphotoxin-alpha am Tumor zu dessen Zerst{\"o}rung f{\"u}hrte, welche durch T-Zellen vermittelt wurde, und mit der Induktion eines terti{\"a}ren lymphatischen Gewebes am Tumor assoziiert war. Dieses terti{\"a}re lymphatische Gewebe war durch die Kompartimentalisierung von T- und B-Zellen und der Pr{\"a}senz von high endothelial venules charakterisiert und besaß zudem mit dendritischen Zellen und na{\"i}ven T-Zellen alle Voraussetzungen f{\"u}r ein in loco priming. Dementsprechend konnte in der Folge der gerichteten Lymphotoxin-alpa Therapie im Tumor ein Anstieg am T-Zellinfiltrat, welches sich oligoklonal zusammensetzte, beobachtet werden. In vitro Experimente verdeutlichte die Tumorspezifit{\"a}t der Therapie-induzierten T-Zellantwort, da die T-Zellen auf ein Tumorantigen mit der Aussch{\"u}ttung von Interferon gamma reagierten und die Tumorzellen lysierten. Im humanen Modell wurden Hautbiopsien von Melanompatienten untersucht, denen im Rahmen einer klinischen Studie autologe, in vitro generierte und antigenbeladene DC intradermal appliziert wurden. Die Patienten erlaubten die Entnahme von Hautbiopsien aus den Injektionsstellen f{\"u}r wissenschaftliche Untersuchungen. Eine Induktion bzw. Verst{\"a}rkung einer spezifischen T-Zellantwort durch die Vakzinierung mit antigenbeladenen dendritischen Zellen konnte bereits in zahlreichen Arbeiten und auch in dem in dieser Arbeit untersuchten Patientenkollektiv gezeigt werden. Bei der Analyse der Injektionsstellen zeigt sich, dass ein großer Teil der injizierten dendritischen Zellen in der Vakzinierungsstelle verharren und dass diese unabh{\"a}ngig von einer Beladung mit Antigen zu einer Induktion von high endothelial venules Charakteristika f{\"u}hrte. Waren die dendritischen Zellen mit Antigen beladen, so f{\"u}hrte dies zu einem st{\"a}rkeren T-Zellinfiltrat in den Injektionsstellen, wobei sowohl na{\"i}ve als auch central memory T-Zellen nachgewiesen wurde. Diese Zellen wurden vermutlich durch die {\"U}berexpression der DC CK1 und SDF1 Chemokinen in den Injektionsstellen, die chemotaktisch auf T-Zellen wirken, angezogen. Das Infiltrat in den Injektionsstellen war oligoklonal und wies tumorspezifische T-Zellen auf. Nachdem diese T-Zellklone im Blut der Patienten vor der Vakzinierung nicht nachweisbar waren, m{\"u}ssen sie zumindest in den Injektionsstellen expandiert sein. Interessanterweise konnte einer dieser Klone in Metastasen nachgewiesen werden, die nach der Vakzinierung dem Patienten entfernt wurden. In beiden Modellen wurde also durch die Manipulation des Mikromilieus, d.h. Lymphotoxin-alpa Anreicherung am Tumor bzw. Injektion von reifen dendritischen Zellen in die Haut, Strukturen wie z.B. high endothelial venules induziert, die ein in loco priming erm{\"o}glichen sollten. Dementsprechend riefen diese Ver{\"a}nderungen ein Tumorantigen-spezifisches Infiltrat hervor. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass T-Zell priming auch außerhalb sekund{\"a}rer lymphatischer Organe erfolgen kann. Prinzipiell scheint also nur der Kontakt von reifen, antigenbeladenen dendritischen Zellen mit den entsprechenden antigenspezifischen, na{\"i}ven T-Zellen entscheiden zu sein. Die M{\"o}glichkeit des in vitro primings bekr{\"a}ftigt diese These. In vivo erfolgt dieses Aufeinandertreffen normalerweise in den sekund{\"a}ren lymphatischen Organen, doch konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass Ver{\"a}nderungen des Mikromilieus diesen Kontakt auch in anderen Geweben erm{\"o}glicht.},
  subject      = {T-Lymphozyt},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Wagh2005,
  author    = {Wagh, Dhananjay Anil},
  title     = {"Bruchpilot" -molecular and functional characterization of a novel active zone protein at the Drosophila synapse},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-14989},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2005},
  abstract  = {Chemical neurotransmission is a complex process of central importance for nervous system function. It is thought to be mediated by the orchestration of hundreds of proteins for its successful execution. Several synaptic proteins have been shown to be relevant for neurotransmission and many of them are highly conserved during evolution- suggesting a universal mechanism for neurotransmission. This process has checkpoints at various places like, neurotransmitter uptake into the vesicles, relocation of the vesicles to the vicinity of calcium channels in order to facilitate Ca2+ induced release thereby modulating the fusion probability, formation of a fusion pore to release the neurotransmitter and finally reuptake of the vesicles by endocytosis. Each of these checkpoints has now become a special area of study and maintains its own importance for the understanding of the overall process. Ca2+ induced release occurs at specialized membrane structures at the synapse known as the active zones. These are highly ordered electron dense grids and are composed of several proteins which assist the synaptic vesicles in relocating in the vicinity of Ca2+ channels thereby increasing their fusion probability and then bringing about the vesicular fusion itself. All the protein modules needed for these processes are thought to be held in tight arrays at the active zones, and the functions of a few have been characterized so far at the vertebrate active zones. Our group is primarily interested in characterizing the molecular architecture of the Drosophila synapse. Due to its powerful genetics and well-established behavioural assays Drosophila is an excellent system to investigate neuronal functioning. Monoclonal antibodies (MABs) from a hybridoma library against Drosophila brain are routinely used to detect novel proteins in the brain in a reverse genetic approach. Upon identification of the protein its encoding genetic locus is characterized and a detailed investigation of its function is initiated. This approach has been particularly useful to detect synaptic proteins, which may go undetected in a forward genetic approach due to lack of an observable phenotype. Proteins like CSP, Synapsin and Sap47 have been identified and characterized using this approach so far. MAB nc82 has been one of the shortlisted antibodies from the same library and is widely used as a general neuropil marker due to the relative transparency of immunohistochemical whole mount staining obtained with this antibody. A careful observation of double stainings at the larval neuromuscular junctions with MAB nc82 and other pre and post-synaptic markers strongly suggested an active zone localization of the nc82 antigen. Synaptic architecture is well characterized in Drosophila at the ultrastructural level. However, molecular details for many synaptic components and especially for the active zone are almost entirely unknown. A possible localization at the active zone for the nc82 antigen served as the motivation to initiate its biochemical characterization and the identification of the encoding gene. In the present thesis it is shown by 2-D gel analysis and mass spectrometry that the nc82 antigen is a novel active zone protein encoded by a complex genetic locus on chromosome 2R. By RT-PCR exons from three open reading frames previously annotated as separate genes are demonstrated to give rise to a transcript of at least 5.5 kb. Northern blots produce a prominent signal of 11 kb and a weak signal of 2 kb. The protein encoded by the 5.5 kb transcript is highly conserved amongst insects and has at its N-terminus significant homology to the previously described vertebrate active zone protein ELKS/ERC/CAST. Bioinformatic analysis predicts coiled-coil domains spread all over the sequence and strongly suggest a function involved in organizing or maintaining the structure of the active zone. The large C-terminal region is highly conserved amongst the insects but has no clear homologues in veretebrates. For a functional analysis of this protein transgenic flies expressing RNAi constructs under the control of the Gal4 regulated enhancer UAS were kindly provided by the collaborating group of S.Sigrist (G\&\#1616;ttingen). A strong pan-neuronal knockdown of the nc82 antigen by transgenic RNAi expression leads to embryonic lethality. A relatively weaker RNAi expression results in behavioural deficits in adult flies including unstable flight and impaired walking behavior. Due to this peculiar phenotype as observed in the first knockdown studies the gene was named "bruchpilot" (brp) encoding the protein "Bruchpilot (BRP)" (German for crash pilot). A pan-neuronal as well as retina specific downregulation of this protein results in loss of ON and OFF transients in ERG recordings indicating dysfunctional synapses. Retina specific downregulation also shows severely impaired optomotor behaviour. Finally, at an ultrastructural level BRP downregulation seems to impair the formation of the characteristic T-shaped synaptic ribbons at the active zones without significantly altering the overall synaptic architecture (in collaboration with E.Asan). Vertebrate active zone protein Bassoon is known to be involved in attaching the synaptic ribbons to the active zones as an adapter between active zone proteins RIBEYE and ERC/CAST. A mutation in Bassoon results in a floating synaptic ribbon phenotype. No protein homologous to Bassoon has been observed in Drosophila. BRP downregulation also results in absence of attached synaptic ribbons at the active zones. This invites the speculation of an adapter like function for BRP in Drosophila. However, while Bassoon mutant mice are viable, BRP deficit in addition to the structural phenotype also results in severe behavioural and physiological anomalies and even stronger downregulation causes embryonic lethality. This therefore suggests an additional and even more important role for BRP in development and normal functioning of synapses in Drosophila and also in other insects. However, how BRP regulates synaptic transmission and which other proteins are involved in this BRP dependant pathway remains to be investigated. Such studies certainly will attract prominent attention in the future.},
  subject      = {Taufliege},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Schwenkert2005,
  author    = {Schwenkert, Isabell},
  title     = {Phenotypic characterization of hangover at the neuromuscular junction},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-14977},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2005},
  abstract  = {Ethanoltoleranz beruht vermutlich auf Ver{\"a}nderung in synaptischer Plastizit{\"a}t; da die Mechanismen, die zu dieser Anpassung der Synapsen f{\"u}hren, in hang-Mutanten offensichtlich defekt sind, war es Ziel dieser Arbeit zu erkl{\"a}ren, wie HANG zu synaptischer Plastizit{\"a}t beitr{\"a}gt. In diesem Zusammenhang war es besonders wichtig herauszufinden, in welchem neuronalen Prozeß HANG eine Rolle spielt. Antik{\"o}rperfarbungen gegen HANG zeigten, da das Protein in allen neuronalen Zellkernen larvaler und adulter Gehirne vorhanden ist. Gehirne der hangAE10 Mutante zeigen keine F{\"a}rbung, was best{\"a}tigt, da diese Tiere Nullmutanten f{\"u}r HANG sind. Eine genauere Analyse der Verteilung von HANG im Zellkern ergab, daß HANG in einem punktartigen Muster an bestimmten Stellen im Kern angereichert ist; diese HANG-Aggregate sind an der Innenseite der Kernmembran lokalisiert und colokalisieren nicht mit dem Chromatin. Auf der Basis dieser Ergebnissen wurde postuliert, daß HANG vermutlich an der Stabilisierung, Prozessierung oder dem Export von mRNAs beteiligt ist. Da synaptische Plastizit{\"a}t gut an den einzelnen Neuronen der neuromuskul{\"a}ren Synapse von Drosophila-Larven studiert werden kann, wurde die Morphologie der Motorneurone dritter Larven am Muskelpaar 6/7 des Segments A4 untersucht. Diese Untersuchungen zeigten, da Boutonanzahl und Axonl{\"a}nge in hangAE10-Larven um 40 \% erh{\"o}ht sind. Außerdem zeigen einige Boutons der hang-Mutanten eine abnormale, sanduhrf{\"o}rmige Form, was darauf hinweist, daß sie nach Initiation der Bouton-Teilung m{\"o}glicherweise in einem halb-separierten Zustand geblieben sind. Die Zunahme an Boutons in den Mutanten ist im wesentlichen auf eine Zunahme der Anzahl der Typ Ib-Boutons zur{\"u}ckzuf{\"u}hren. Die Analyse der Verteilung verschiedener synaptischer Marker in hangover-Mutanten ergab keine Hinweise auf Abnormalit{\"a}ten im Zytoskelett oder in der Ausbildung der pr{\"a}-und postsynaptischen Strukturen. Des weiteren ist die Anzahl der aktiven Zonen relativ zur Boutonoberfl{\"a}che nicht ver{\"a}ndert; da hang-Mutanten aber mehr synaptische Boutons pro synaptischem Terminal besitzen, kann man insgesamt von einer Zunahme der Anzahl der aktiven Zonen ausgehen. Die pr{\"a}synaptische Expression von HANG in den Mutanten rettet die erh{\"o}hte Boutonanzahl und die verl{\"a}ngerten Axone, was ebenfalls beweist, daß die beobachteten synaptischen Defekte auf das Fehlen von HANG und nicht auf Sekund{\"a}rmutationen zur{\"u}ckzuf{\"u}hren sind. Eine postsynaptische Expression der hangover cDNA in den Mutanten dagegen rettet den Ph{\"a}notyp nicht. Die Anzahl der synaptischen Boutons wird unter anderem durch cAMP-Levels bestimmt, welche somit synaptische Plastizit{\"a}t regeln. Da hang-Mutanten eine erh{\"o}hte Boutonanzahl aufweisen, f{\"u}hrte dies zu der Spekulation, daß der Ph{\"a}notyp dieser Mutanten m{\"o}glicherweise auf ver{\"a}nderte cAMPlevels zur{\"u}ckzuf{\"u}hren ist. Um dies zu {\"u}berpr{\"u}fen, wurde die Morphologie der neuromuskul{\"a}ren Synapsen von hangAE10-Larven mit denen von dnc1 verglichen, welche Defekte in der cAMP-Kaskade aufweisen. Einige Aspekte des Ph{\"a}notyps (z. B. die Zunahme der Boutonanzahl und das Verhaltnis von aktiven Zonen pro Boutonfl{\"a}che) sind sehr ¨ahnlich; jedoch unterscheiden sich die beiden Mutanten in anderen morphologischen Aspekten. Die Expression eines UAS-dnc-Transgens in hangover-Mutanten modifizierte den hang-Ph{\"a}notyp ebenfalls nicht. Auf der Basis der Ergebnisse dieser Arbeit wurde ein Modell f{\"u}r die Funktion von HANG erstellt, nach dem dieses Protein vermutlich am Isoform-spezifischen Spleißen bestimmter Transkripte beteiligt ist, deren Produkte f{\"u}r die synaptische Plastizit{\"a}t an der neuromuskul{\"a}ren Synapse ben{\"o}tigt werden.},
  subject      = {Taufliege},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Rock2005,
  author    = {Rock, Rebecca},
  title     = {Charakterisierung des Vertebraten-Gens four-jointed x1 (fjx1) und Analyse des planaren Zellpolarit{\"a}tssignalwegs (PCP-Signalweg)},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-14815},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2005},
  abstract  = {Das four-jointed (fj) Gen in Drosophila ist zum einen am proximo-distalen L{\"a}ngenwachstum der Extremit{\"a}ten beteiligt, zum anderen spielt es auch eine Rolle in dem in neuerer Zeit verst{\"a}rkt untersuchten planaren Zellpolarit{\"a}tssignalweg (PCP-Signalweg). {\"U}ber das in der Maus identifizierte homologe fjx1 Gen ist dagegen vergleichsweise wenig bekannt. Ziel dieser Arbeit war daher die n{\"a}here Charakterisierung von fjx1 sowie die Identifizierung m{\"o}glicher Interaktionspartner. Durch RNA in situ Hybridisierung wurde zun{\"a}chst das r{\"a}umliche und zeitliche Expressionsmuster von fjx1 in Embryonen und adulten Organen untersucht. Dabei zeigte sich, dass fjx1 in allen Stadien vor allem im Gehirn, aber auch in epithelialen Strukturen verschiedener Organe exprimiert war. Obwohl die Expression von fjx1 ebenso wie die von fj {\"u}ber den Notch-Signalweg reguliert wird, konnte im Gegensatz zu Drosophila jedoch keine Regulation von fjx1 {\"u}ber den Wnt- und/oder den JAK/STAT-Signalweg nachgewiesen werden. Da Fj in Drosophila zumindest teilweise sezerniert wird und nicht-zellautomome Effekte zeigt, wurde ein Fjx1-Rezeptor gesucht. Mit Hilfe eines Fjx1-AP Fusionsproteins konnten Bindungsstellen {\"u}berlappend bzw. angrenzend zu Regionen mit fjx1-Expression gefunden werden. Beispielsweise zeigten in der embryonalen Lunge und der Niere sowohl die in situ Hybridisierung (fjx1-Expression) als auch die Inkubation mit dem Fusionsprotein (Lokalisation des Bindungspartners) F{\"a}rbung in epithelialen Strukturen, w{\"a}hrend im adulten Gehirn die F{\"a}rbungen in jeweils benachbarten Schichten des Hippocampus und des Kleinhirns detektiert wurden. Durch Expressionsklonierung bzw. Coimmunpr{\"a}zipitation konnte der Rezeptor jedoch nicht identifiziert werden. Aufgrund der Tatsache dass fj in Drosophila in enger Beziehung zu dachsous (ds) und fat (ft) steht, wurden die homologen Gene in der Maus gesucht und deren Expressionsmuster analysiert. In Embryonalstadien war dchs1 komplement{\"a}r zu fjx1 in mesenchymalen Geweben zu finden, {\"a}hnlich der Situation in Drosophila, wo fj und ds in gegenl{\"a}ufigen Gradienten exprimiert sind. Das homologe Gen von ft, fat-j, war hingegen nicht ubiquit{\"a}r exprimiert, sondern wie dchs1 im Mesenchym. Erg{\"a}nzend dazu wurden die fat-like (ftl) Homologen, fat1-3, epithelial detektiert. Die Expression in adulten Organen wurde mit Real-Time-PCR untersucht, die zeigte, dass alle Gene (fj, ds und fat Homologe) relativ stark im adulten Gehirn zu finden sind. Mit Hilfe von RNA in situ Hybridisierungen konnten die Gene im Riechhirn, im Hippocampus und im Kortex des Großhirns sowie in der K{\"o}rnerschicht des Kleinhirns lokalisiert werden. Um Hinweise auf die Funktion von Fjx1 zu erhalten, wurde in Datenbanken nach Proteinen mit {\"a}hnlicher Aminos{\"a}uresequenz gesucht, die eventuell Auskunft {\"u}ber m{\"o}gliche Proteindom{\"a}nen geben sollten. Bei den gefundenen f{\"u}nf Mausproteinen handelte es sich jedoch um hypothetische bzw. noch nicht untersuchte Proteine, so dass R{\"u}ckschl{\"u}sse auf die Funktion von Fjx1 nicht m{\"o}glich waren. Die Expression dieser Gene war nach Datenbankangaben entweder sehr spezifisch, beschr{\"a}nkt auf ein bestimmtes Gewebe (z.B. Milchdr{\"u}se oder Nebenniere) oder schwach und daf{\"u}r ubiquit{\"a}r, was sich auch durch eine schwache, einheitliche F{\"a}rbung in der RNA in situ Hybridisierung best{\"a}tigte. Die Proteinstruktur von Fjx1 und der Fjx1-{\"a}hnlichen Proteine sowie die Art der konservierten Reste geben Grund zu der Annahme, dass es sich um (sezernierte) Glykosyltransferasen handeln k{\"o}nnte, was durch die zumindest zeitweise Lokalisation von Fjx1 im Golgi-Apparat best{\"a}rkt wird. Auch die in Drosophila gefundenen Ergebnisse sprechen f{\"u}r eine derartige Funktion von Fj, obwohl auch hier noch keine konkreten biochemischen Belege vorliegen. Die Ergebnisse dieser Arbeit deuten auf eine Konservierung des in Drosophila entdeckten Fj/Ds/Ft-Siganlwegs in Vertebraten hin, wenn auch der genaue Mechanismus der Interaktion zwischen den Proteinen noch nicht gekl{\"a}rt ist und weiterer Untersuchungen bedarf.},
  language  = {de}
}