@phdthesis{Armbruster2011,
  author    = {Armbruster, Nicole},
  title     = {Gentherapie der Rheumatoiden Arthritis mit foamyviralen Vektoren},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-65330},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2011},
  abstract  = {Die rheumatoide Arthritis (RA) ist eine Autoimmunerkrankung, die durch anhaltende Gelenksentz{\"u}ndungen gekennzeichnet ist und mit einer fortschreitenden Degradierung des Knorpels und Knochen einhergeht. Ungef{\"a}hr 2 \% der erwachsenen Bev{\"o}lkerung weltweit sind betroffen und leiden unter erheblichen Gelenkschmerzen und Beeintr{\"a}chtigungen. Der intraartikul{\"a}re Transfer anti-entz{\"u}ndlicher Gene (z.B. des Interleukin-1 Rezeptorantagonisten - IL1RA) zeigte signifikante Bedeutung in pr{\"a}klinischen und Phase-I klinischen Studien der RA Therapie. Die meisten dieser Studien verwendeten MLV-basierte orthoretrovirale Vektoren f{\"u}r eine stabile Transgenexpression, tragen aber das Risiko der Insertionsmutagenese. Wir haben foamyvirale Vektoren (FVV) etabliert, welche von apathogenen Elternviren abgeleitet sind und sich durch ein breites Wirtsspektrum und ein vorteilhaftes Integrationsmuster ins zellul{\"a}re Genom auszeichnen. In dieser Arbeit wurden IL1RA exprimierende prototypische foamyvirale Vektoren (PFV) generiert, deren chondroprotektives Potential in vitro und in einem indirekten Gentransferansatz in Kniegelenken von Wistar und athymischen Nacktratten in vivo evaluiert wurde. PFV Vektoren mit der kodierenden Sequenz f{\"u}r den humanen IL1RA, einer internen ribosomalen Eintrittsstelle (IRES) und EGFP wurden generiert und mit Verwendung eines Vier-Plasmidsystem, bestehend aus dem Vektorplasmid (IL1RA-IRES-EGFP) und den Expressionsplasmiden FV-gag, FV-pol und FV-env in 293T Zellen produziert. Ebenso wurden Kontrollvektoren welche nur EGFP exprimieren generiert. Transduktionsexperimente wurden mit prim{\"a}ren humanen mesenchymalen Stammzellen (MSZ) aus Knochenmarkaspiraten, der Tert-4 mesenchymalen Stammzelllinie, HT1080 Fibroblasten und prim{\"a}ren Ratten Synovialfibroblasten durchgef{\"u}hrt. Die Transgenexpression wurde mittels Fluoreszenzmikroskopie (EGFP), ELISA (IL1RA) und quantitativer Real-Time PCR (IL1RA) evaluiert. Die Funktionalit{\"a}t des IL1RA-Proteins wurde mit einem Prostaglandin E2 (PGE2) Assay gezeigt. Dazu wurden FV.IL1RA transduzierte Tert-4 Zellen und unbehandelte Zellen mit 10 ng/ml IL1 inkubiert. Als readout f{\"u}r die IL1-Stimulation dienten die PGE2 Mengen in den konditionierten Medien. Die Zellkultur{\"u}berst{\"a}nde wurden 48 h nach IL1-Gabe auf ihren PGE2 und IL1RA Gehalt hin untersucht. Die PGE2 Menge war dabei, im Vergleich zu den unbehandelten Kontrollen, in den FV.IL1RA transduzierten Zellen signifikant erniedrigt. Nach der Transplantation von foamyviral transduzierten Synovialfibroblasten in Kniegelenke von Wistar und athymischen Nacktratten, war die intraartikul{\"a}re (i.a.) Transgenexpression in den Wistar Ratten zun{\"a}chst hoch, fiel jedoch nach ungef{\"a}hr 3 Wochen ab. Im Gegensatz dazu war die foamyviral vermittelte IL1RA-Expression in den immundefizienten Ratten f{\"u}r 12 Wochen auf sehr hohen Leveln stabil. Ein Maximum wurde an Tag 10 nach i.a. Transplantation mit ca. 450 ng pro Gelenk erreicht. Untersuchungen zur Biodistribution zeigten keine extraartikul{\"a}re Transgenexpression in allen untersuchten Organen (Gehirn, Herz, Lunge, Leber, Niere, Milz, Gonaden und Serum). Diese Resultate, zusammen mit dem Ausbleiben von sekund{\"a}ren Erkrankungen, wie bspw. Tumoren, in allen behandelten Tieren, sprechen f{\"u}r die Sicherheit des Ansatzes. Die Arbeit zeigt, dass FVV verwendet werden k{\"o}nnen, um prim{\"a}re Synovialfibroblasten und MSZ effizient mit Markergenen und dem anti-entz{\"u}ndlichen IL1RA Transgen zu transduzieren. Die dabei erzielten Transgenlevel sind in der Lage, die Effekte von hochdosiertem IL1 zu blockieren. Die Ergebnisse sprechen daf{\"u}r, dass FVV sehr effiziente Werkzeuge f{\"u}r den ex vivo Gentransfer sind und unterstreichen ihr großes Potential f{\"u}r die Bereitstellung anti-entz{\"u}ndlicher Transgene in prim{\"a}ren Zellen und Geweben. Zuk{\"u}nftig soll diese Technologie in Tiermodellen der Arthritis angewendet werden. Das Fernziel der Arbeiten besteht in der Etablierung und Evaluierung eines Gentransfersystems, welches die in vivo Applikation am Menschen erlaubt.},
  subject      = {Rheumatoide Arthritis},
  language  = {de}
}