@phdthesis{Voss2021,
  author    = {Voß, Lena Johanna},
  title     = {{\"A}nderungen der Membranspannung und der Osmolarit{\"a}t als Ausl{\"o}ser f{\"u}r Calciumsignale in Pflanzen - Studien an Schließzellen von Nicotiana tabacum und Polypodium vulgare},
  doi       = {10.25972/OPUS-21963},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-219639},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2021},
  abstract  = {Stomata sind kleine Poren in der Blattoberfl{\"a}che, die Pflanzen eine Anpassung ihres Wasserhaushalts an sich {\"a}ndernde Umweltbedingungen erm{\"o}glichen. Die {\"O}ffnungsweite der Stomata wird durch den Turgordruck der Schließzellen bestimmt, der wiederum durch Ionenfl{\"u}sse {\"u}ber die Membranen der Zelle reguliert wird. Ein Netzwerk von Signaltransduktionswegen sorgt daf{\"u}r, dass Pflanzen die Stomabewegungen an die Umgebungsbedingungen anpassen k{\"o}nnen. Viele molekulare Komponenten dieser Signaltransduktionketten in Schließzellen von Angiospermen sind inzwischen bekannt und Calcium spielt darin als Signalmolek{\"u}l eine wichtige Rolle. Weitgehend unbekannt sind dagegen die Mechanismen, die zur Erzeugung von transienten Erh{\"o}hungen der Calciumkonzentration f{\"u}hren. Auch die molekularen Grundlagen der Regulierung der Stomaweite in Nicht-Angiospermen-Arten sind bisher nur wenig verstanden. Um zur Aufkl{\"a}rung dieser Fragestellungen beizutragen, wurden in dieser Arbeit Mechanismen zur Erh{\"o}hungen der cytosolischen Calciumkonzentration sowie elektrophysiologische Eigenschaften von Schließzellen untersucht. Der Fokus lag hierbei insbesondere auf der Visualisierung cytosolischer Calciumsignale in Schließzellen. Im ersten Teil der Arbeit wurde durch die Applikation hyperpolarisierender Spannungspulse mittels TEVC (Two Electrode Voltage Clamp) gezielt eine Erh{\"o}hung der cytosolischen Calciumkonzentration in einzelnen Schließzellen von Nicotiana tabacum ausgel{\"o}st. Um die Dynamik der cytosolischen Calciumkonzentration dabei zeitlich und r{\"a}umlich hoch aufgel{\"o}st zu visualisieren, wurde simultan zu den elektrophysiologischen Messungen ein Spinning-Disc-System f{\"u}r konfokale Aufnahmen eingesetzt. W{\"a}hrend der Applikation hyperpolarisierender Spannungspulse wurde eine transiente Vergr{\"o}ßerung des cytosolischen Volumens beobachtet. Diese l{\"a}sst sich durch einen osmotisch getriebenen Wasserfluss erkl{\"a}ren, der durch die Ver{\"a}nderung der Ionenkonzentration im Cytosol verursacht wird. Diese wiederum wird durch die spannungsabh{\"a}ngige Aktivierung einw{\"a}rtsgleichrichtender Kaliumkan{\"a}le in der Plasmamembran der Schließzellen und durch den Kompensationsstrom der eingestochenen Mikroelektrode hervorgerufen. Mit Hilfe des calciumsensitiven Farbstoffs Fura-2 konnte gezeigt werden, dass die Erh{\"o}hung der freien cytosolischen Calciumkonzentration w{\"a}hrend der Applikation hyperpolarisierender Spannungspulse durch zwei Mechanismen verursacht wird. Der erste Mechanismus ist die Aktivierung hyperpolarisationsaktivierter, calciumpermeabler Kan{\"a}le (HACCs) in der Plasmamembran, die schon 1998 von Grabov \& Blatt beschrieben wurde. Zus{\"a}tzlich zu diesem Mechanismus der Calciumfreisetzung, konnte ein zweiter bislang unbekannter Mechanismus aufgedeckt werden, bei dem Calcium aus intrazellul{\"a}ren Speichern in das Cytosol freigesetzt wird. Dieser Mechanismus h{\"a}ngt mit der oben beschriebenen Vergr{\"o}ßerung des cytosolischen Volumens zusammen und ist wahrscheinlich durch die {\"A}nderungen der mechanischen Spannung der Membran bzw. der Osmolarit{\"a}t innerhalb der Zelle bedingt. Diese k{\"o}nnten zu einer Aktivierung mechanosensitiver, calciumpermeabler Kan{\"a}le f{\"u}hren. Der zweite Teil der Arbeit besch{\"a}ftigt sich mit den molekularen Grundlagen der Regulierung von Stomata in Nicht-Angiospermen. In Schließzellen von Polypodium vulgare konnten durch die Anwendung der TEVC-Technik {\"a}hnliche spannungsabh{\"a}ngige Str{\"o}me {\"u}ber die Plasmamembran gemessen werden wie in Angiospermen. Ebenso wurden durch die Applikation hyperpolarisierender Spannungspulse an Schließzellen von Polypodium und Asplenium Erh{\"o}hungen der cytosolischen Calciumkonzentration ausgel{\"o}st, die auf die Existenz spannungsabh{\"a}ngiger, calciumpermeabler Kan{\"a}le in der Plasmamembran hinweisen. Die Diffusion von Fluoreszenzfarbstoffen in die Nachbarschließzellen nach der iontophoretischen Beladung in Polypodium, Asplenium, Ceratopteris und Selaginella zeigte, dass in diesen Arten eine symplastische Verbindung zwischen benachbarten Schließzellen besteht, die an Schließzellen von Angiospermen bisher nicht beobachtet werden konnte. Anhand elektronenmikroskopischer Aufnahmen von Polypodium glycyrrhiza Schließzellen konnte gezeigt werden, dass diese Verbindung wahrscheinlich durch Plasmodesmata zwischen benachbarten Schließzellen gebildet wird. Durch die Analyse der Calciumdynamik in benachbarten Schließzellen nach hyperpolarisierenden Spannungspulsen stellte sich heraus, dass die Calciumhom{\"o}ostase trotz symplastischer Verbindung in beiden Schließzellen unabh{\"a}ngig voneinander reguliert zu werden scheint. Im Rahmen der Untersuchungen an Farnschließzellen wurde desweiteren eine Methode zur Applikation von ABA etabliert, die es erlaubt mithilfe von Mikroelektroden das Phytohormon iontophoretisch in den Apoplasten zu laden. Im Gegensatz zu den Schließzellen von Nicotiana tabacum, die auf eine so durchgef{\"u}hrte ABA-Applikation mit dem Stomaschluss reagierten, wurde in Polypodium vulgare auf diese Weise kein Stomaschluss ausgel{\"o}st. Da die ABA-Antwort der Farnstomata aber auch von anderen Faktoren wie Wachstumsbedingungen abh{\"a}ngig ist (H{\~o}rak et al., 2017), kann eine ABA-Responsivit{\"a}t in dieser Farnart trotzdem nicht vollkommen ausgeschlossen werden. Die Freisetzung von Calcium aus intrazellul{\"a}ren Speichern, wie sie in dieser Arbeit gezeigt wurde, k{\"o}nnte eine wichtige Rolle bei der Regulierung der Stomaweite spielen. Zur Aufkl{\"a}rung dieser Fragestellung w{\"a}re die Identifizierung der Kan{\"a}le, die an der osmotisch/mechanisch induzierten Calciumfreisetzung aus internen Speichern beteiligt sind, von großem Interesse. Weiterf{\"u}hrende Studien an Schließzellen von Farnen k{\"o}nnten die physiologische Bedeutung der aus Angiospermen bekannten Ionenkan{\"a}le f{\"u}r die Stomabewegungen in evolution{\"a}r {\"a}lteren Landpflanzen aufkl{\"a}ren und so maßgeblich zum Verst{\"a}ndnis der Evolution der Regulierunsgmechanismen von Stomata beitragen. Außerdem stellt sich die Frage, welche Rolle die hier gezeigte symplastische Verbindung der Nachbarschließzellen durch Plasmodesmata f{\"u}r die Funktion der Stomata spielt.},
  subject      = {Schließzelle},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Kloka2019,
  author    = {Kloka, Jan Andreas},
  title     = {Endogene Lipide als neues Behandlungstarget im TRPA1-vermittelten Entz{\"u}ndungsschmerz},
  doi       = {10.25972/OPUS-18084},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-180844},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2019},
  abstract  = {For nociceptive wound pain, the transient receptor potential channel(TRP) mediated calcium influx is essential. Reactive oxygen species (ROS) and their downstream oxidation products such as 4-hydroxynonenal activate the ankyrin 1 homologue TRPA1 in vivo and in vitro. The calcium imaging experiments performed in this study were carried out on stably with TRPA1 and TRPV1 transfected HEK-293 cells and spinal dorsal root ganglion neurons to further understand the mechanistic correlations of nociceptive pain development in inflammatory wound pain. E06, a monoclonal autoantibody (mAb) against oxidized phosphatidylcholine (OxPC) and D-4F, a mimetic peptide of the structural protein apolipoprotein A-I of high density lipoproteins (HDL) were previously used as a diagnostic tools and novel compounds in atherosclerosis. In this study, E06 mAb and D-4F peptide, both, reduced the TRPA1-mediated calcium influx in vitro caused by lipid peroxidation products (OxPL) such as 4-HNE and reactive oxygen species such as H2O2. In addition, we discovered that neither E06 mAb nor D-4F showed a calcium influx-relevant interaction with the Transient Receptor Potential Channel Vanillin 1 (TRPV1) activator capsaicin or the TRPV1 channel itself. Taken together, E06 mAb and D-4F peptide are two promising substances to reduce inflammatory pain and local pain relief.},
  subject      = {Entz{\"u}ndung},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Diegelmann2003,
  author    = {Diegelmann, S{\"o}ren},
  title     = {Molekulare und ph{\"a}notypische Charakterisierung von Drosophila melanogaster Synapsin Mutanten und In-vivo Calcium Imaging},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-8513},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2003},
  abstract  = {Durch genaue Kartierung der Defizienzen in den Mutanten konnten bislang unbekannte regulatorische Elemente des Synapsin Gens identifiziert werden. Mit dieser Information sollte es m{\"o}glich sein, einen Synapsin-„Rescue" Vektor zu konstruieren, der nach Transformation in die Nullmutante den wildtypischen Ph{\"a}notyp wiederherstellt. Beim Vergleich der im Rahmen des Berkeley Drosophila Genom Projekt ver{\"o}ffentlichten Sequenz des Synapsin Gens mit vor sieben Jahren publizierten Sequenzdaten fielen Diskrepanzen sowohl in der genomischen Sequenz als auch in der cDNA auf. Um zu kl{\"a}ren, ob es sich hier um Artefakte, Polymorphismen oder systematische Modifikationen handelt, wurde der entsprechende Bereich von neun an verschiedenen Orten gefangenen Wildtypen genomisch und auf der cDNA Ebene amplifiziert und sequenziert. In allen F{\"a}llen wurde die genomische Sequenz des Genomprojekts verifiziert, so dass von einem Sequenzierfehler in der fr{\"u}heren Sequenz auszugehen ist. Als Folge ergibt sich eine Exon-Intron Struktur, bei der die Spleiß-Konsensussequenz (GT-AG Regel) im Intron 4 des Synapsins gewahrt bleibt. Dagegen best{\"a}tigten die RT-PCR Sequenzen die fr{\"u}heren cDNA-Daten, so dass ein A zu G Austausch zwischen der genomischen Sequenz und der cDNA des Proteins aufgedeckt wird. Dieser Austausch f{\"u}hrt zu einer Ver{\"a}nderung der in allen bisher bekannten Synapsinen konservierten Zielsequenz der Proteinkinase CaMK I/ IV und PKA, was interessante Fragen zu seiner funktionellen Bedeutung aufwirft. Die Basensubstitution spricht f{\"u}r ein A-zu-I RNA-Editing auf der Ebene der Ribonukleins{\"a}ure. Dieser Vorgang wird durch das Enzym dADAR katalysiert und wurde bereits f{\"u}r verschiedene neuronale Proteine nachgewiesen. Die f{\"u}r die Reaktion ben{\"o}tigte doppelstr{\"a}ngige Sekund{\"a}rstruktur der RNA kann durch die Sequenz der pr{\"a}-mRNA des Synapsins gebildet werden. Die potentielle „Editing site Complementary Sequence" (ECS) konnte im Intron 4 in einem Abstand von ca. 90 Basen stromabw{\"a}rts der Editing-Stelle durch ein Computerprogramm ermittelt werden. Der A zu G Austausch wird in allen Laborwildtypen und allen neu etablierten St{\"a}mmen, sowie in verschiedenen Entwicklungsstadien beobachtet. Lediglich in einem cDNA-Gemisch aus Eiern, Embryonen und 1. Larven findet man neben der editierten auch die nicht-editierte Sequenz. Um in sp{\"a}teren Experimenten die Funktion der Phosphorylierung und die Auswirkung der mRNA Editierung ermitteln zu k{\"o}nnen wurden in einem weiteren Versuch die beiden Erkennungsstellen der PKA in der cDNA durch Mutationen modifiziert, so dass Phosphorylierungstests an den Konstrukten durchgef{\"u}hrt werden k{\"o}nnen. Zur ph{\"a}notypischen Charakterisierung der Nullmutante wurde die Defizienz-Linie Syn97 durch extensive R{\"u}ckkreuzung in den genetischen Hintergrund des Wildtyps CantonS eingebracht, der als Standard-Kontrollstamm f{\"u}r Verhaltensexperimente und insbesondere Lernversuche dient. Die Linie Syn97CS wurde im Rahmen einer Kooperation von Mitarbeitern des Lehrstuhls in verschiedenen Verhaltenstests und Lernparadigmen auf ph{\"a}notypische Ver{\"a}nderungen {\"u}berpr{\"u}ft. Dabei fanden sich mehrere Verhaltensunterschiede zum Wildtyp, die vermutlich auf geringf{\"u}gigen Modifikationen in komplexen neuronalen Netzwerken beruhen. In operanten Lernparadigmen konnte ein Einfluss der Synapsin-Elimination auf den Lernerfolg detektiert werden. Dabei trat die Reduktion des Lernindex bereits im dritten Larvenstadien auf und setzte sich in der adulten Fliege fort. Der Einfluss des Fehlens des Synapsins auf Lernprozesse in Drosophila steht im Einklang mit Befunden aus Knock-out M{\"a}usen f{\"u}r SynI + II. Im reduzierten Courtship Index der Syn97CS M{\"a}nnchen offenbart sich ein konkreter Hinweis auf eine verringerte Darwin'sche Fitness der Synapsin-Nullmutante. Die Gesamtheit der in der Synapsin-Nullmutante entdeckten Ph{\"a}notypen k{\"o}nnte den hohen Konservierungsgrad des Proteins zwischen Vertebraten und Invertebraten erkl{\"a}ren. In einem weiteren Teil-Projekt konnten Mutationen in die cDNA des Calciumsensor Cameleon 2.0 Proteins eingebracht werden, um so die verbesserte Version Cam 2.1 zu erhalten. Daraufhin wurden mehrere transgene UAS-Cam 2.1 Linien hergestellt, die bei der Kreuzung mit verf{\"u}gbaren Gal4 Linien den Calciumsensor f{\"u}r eine Expression in definierten Neuronenpopulationen von Drosophila zug{\"a}nglich machen. In weiterf{\"u}hrenden Arbeiten konnte die Funktionalit{\"a}t des Fusionsproteins {\"u}berpr{\"u}ft werden und somit die ersten Schritte hin zur Anwendung der in-vivo Calcium Imaging Methode am Lehrstuhl durchgef{\"u}hrt werden.},
  language  = {de}
}