@phdthesis{Somody2023,
  author    = {Somody, Joseph Christian Campbell},
  title     = {Leveraging deep learning for identification and structural determination of novel protein complexes from \(in\) \(situ\) electron cryotomography of \(Mycoplasma\) \(pneumoniae\)},
  doi       = {10.25972/OPUS-31344},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-313447},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2023},
  abstract  = {The holy grail of structural biology is to study a protein in situ, and this goal has been fast approaching since the resolution revolution and the achievement of atomic resolution. A cell's interior is not a dilute environment, and proteins have evolved to fold and function as needed in that environment; as such, an investigation of a cellular component should ideally include the full complexity of the cellular environment. Imaging whole cells in three dimensions using electron cryotomography is the best method to accomplish this goal, but it comes with a limitation on sample thickness and produces noisy data unamenable to direct analysis. This thesis establishes a novel workflow to systematically analyse whole-cell electron cryotomography data in three dimensions and to find and identify instances of protein complexes in the data to set up a determination of their structure and identity for success. Mycoplasma pneumoniae is a very small parasitic bacterium with fewer than 700 protein-coding genes, is thin enough and small enough to be imaged in large quantities by electron cryotomography, and can grow directly on the grids used for imaging, making it ideal for exploratory studies in structural proteomics. As part of the workflow, a methodology for training deep-learning-based particle-picking models is established. As a proof of principle, a dataset of whole-cell Mycoplasma pneumoniae tomograms is used with this workflow to characterize a novel membrane-associated complex observed in the data. Ultimately, 25431 such particles are picked from 353 tomograms and refined to a density map with a resolution of 11 {\AA}. Making good use of orthogonal datasets to filter search space and verify results, structures were predicted for candidate proteins and checked for suitable fit in the density map. In the end, with this approach, nine proteins were found to be part of the complex, which appears to be associated with chaperone activity and interact with translocon machinery. Visual proteomics refers to the ultimate potential of in situ electron cryotomography: the comprehensive interpretation of tomograms. The workflow presented here is demonstrated to help in reaching that potential.},
  subject      = {Kryoelektronenmikroskopie},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Thein2009,
  author    = {Thein, Marcus},
  title     = {Porins of Lyme Disease and Relapsing Fever Spirochetes},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-35158},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2009},
  abstract  = {Die Gattung Borrelia geh{\"o}rt zur Abteilung der Spiroch{\"a}ten, einem alten Zweig der Bakteriendom{\"a}ne, der nur entfernt mit Gram-negativen Bakterien verwandt ist. S{\"a}mtliche Arten dieser Gattung sind obligate Parasiten. Borrelien k{\"o}nnen in die Erreger zweier humaner Krankheiten eingeteilt werden: die Lyme-Borreliose und das R{\"u}ckfallfieber. Borrelien besitzen mit 0.91 Mb ein sehr kleines Chromosom und sind daher in ihren metabolischen F{\"a}higkeiten eingeschr{\"a}nkt. Folglich ist das {\"U}berleben s{\"a}mtlicher Borrelienarten absolut abh{\"a}ngig von N{\"a}hrstoffen, die von ihren Wirten bereitgestellt werden. Der Transport dieser N{\"a}hrstoffe und anderer Molek{\"u}le {\"u}ber die {\"a}ußere Membran wird durch porenformende Proteine, so genannte Porine erm{\"o}glicht. Porine sind wassergef{\"u}llte Kan{\"a}le, die in zwei Klassen unterteilt werden k{\"o}nnen: allgemeine Diffusionsporen und substratspezifische Porine. Aus dem Lyme-Borreliose Erreger Borrelia burgdorferi wurden bisher drei mutmaßliche Porine charakterisiert und beschrieben: P13, Oms28 und P66. Demgegen{\"u}ber sind die Kenntnisse {\"u}ber Porine in R{\"u}ckfallfieberarten rudiment{\"a}r und es wurde bisher noch kein einziges Porin f{\"u}r Vertreter dieser Krankheit identifiziert. Unter Ber{\"u}cksichtigung dieses Hintergrunds war die allgemeine Zielsetzung dieser Arbeit, einen Einblick in die Porinzusammensetzung von sowohl Lyme Borreliose- als auch R{\"u}ckfallfieber-Spiroch{\"a}ten zu erlangen. Dieses Ziel konnte erreicht werden, indem Porine aus den Außenmembranen von Borrelien isoliert und identifiziert wurden und anschließend biophysikalisch in k{\"u}nstlichen Lipidmembranen charakterisiert wurden. Ein Kapitel dieser Arbeit beschreibt die Identifizierung und Charakterisierung des ersten Porins aus R{\"u}ckfallfiebererregern. Das porenformende Protein wurde aus den Außenmembranen von Borrelia duttonii, Borrelia hermsii und Borrelia recurrentis isoliert und Oms38 genannt, f{\"u}r „outer membrane-spanning protein of 38 kDa". Die biophysikalische Charakterisierung mit der „black lipid bilayer" Methode zeigte, dass Oms38 kleine, wassergef{\"u}llte Kan{\"a}le mit einer Einzelkanalleitf{\"a}higkeit von 80 pS in 1 M KCl bildet. Diese Kan{\"a}le sind nicht spannungsabh{\"a}ngig und leicht selektiv f{\"u}r Anionen mit einem Permeabilit{\"a}tsverh{\"a}ltnis von Kationen zu Anionen von 0,41 in KCl. Ein homologes Protein zu Oms38 wurde in den Lyme Borreliose Erregern Borrelia burgdorferi, Borrelia garinii und Borrelia afzelii identifiziert. Das porenformende Protein dieser Arten weist eine hohe Sequenzhomologie zu Oms38 auf und zeigt {\"a}hnliche biophysikalische Eigenschaften, das heißt es formt Poren von 50 pS in 1 M KCl. Durch Titrationsexperimente konnte gezeigt werden, dass die Pore teilweise durch Dicarboxylate blockiert werden kann. Eine Auswertung dieser Versuche legte nahe, dass dieses Protein keine allgemeine Diffusionspore darstellt, sondern einen Kanal mit einer spezifischen Bindestelle f{\"u}r diese Komponenten. Daher wurde dieses Porin DipA genannt, was f{\"u}r „dicarboxylate-specific porin A" steht. In einer anderen Versuchsreihe wurde gezeigt, dass das Porin P66 sowohl in Lyme Borreliose Erregern als auch in R{\"u}ckfallfieberarten vorhanden ist. Hierf{\"u}r wurden die Außenmembranen der Lyme Borreliose Erreger Borrelia burgdorferi, Borrelia afzelii und Borrelia garinii und der R{\"u}ckfallfieberarten Borrelia duttonii, Borrelia recurrentis und Borrelia hermsii genauer untersucht. Mit Ausnahme des P66 Homologs von Borrelia hermsii rekonstituierten P66 Proteine aus allen Arten sehr aktiv in k{\"u}nstliche Membranen und formten Poren zwischen 9 und 11 nS in 1 M KCl. Die biophysikalischen Eigenschaften der Homologe wurden in Experimenten mit „black lipid bilayer" Membranen ausf{\"u}hrlich verglichen. Des Weiteren wurden Porendurchmesser und Konstitution des Borrelia burgdorferi Porins P66 genau untersucht. Hierf{\"u}r wurde die P66 Einzelkanalleitf{\"a}higkeit in Anwesenheit von verschiedenen Nichtelektrolyten in k{\"u}nstlichen Lipidmembranen analysiert. Der effektive Durchmesser des P66 Wasserlumens wurde auf ~1.9 nm bestimmt. Dar{\"u}ber hinaus konnte P66 mit bestimmten Nichtelektrolyten wie PEG 400, PEG 600 und Maltohexaose blockiert werden. Weitere Blockierungsexperimente auf Einzelkanalebene deckten sieben Unterzust{\"a}nde von P66 auf, die auf ein P66 Heptamer schließen ließen. Dieser heptamere Charakter konnte durch Blue native PAGE Analysen best{\"a}tigt werden. Zusammenfassend beschreibt diese Dissertation detaillierte biochemische und biophysikalische Untersuchungen von Porinen aus sowohl Lyme Borreliose- als auch R{\"u}ckfallfieber-Borrelien. Erkenntnisse aus dieser Arbeit bringen das Verstehen der N{\"a}hrstoffaufnahme {\"u}ber Außenmembranen dieser streng wirtsabh{\"a}ngigen, pathogenen Spiroch{\"a}ten einen großen Schritt vorw{\"a}rts. Ein fundiertes Wissen {\"u}ber oberfl{\"a}chenexponierte Proteine wie Porine ist Vorraussetzung f{\"u}r die Herstellung erfolgreicher Impfstoffe und Therapeutika gegen die von Borrelien verursachten Krankheiten.},
  subject      = {Porin},
  language  = {en}
}