@phdthesis{Kuehler2007,
  author    = {K{\"u}hler, Leif Heinrich},
  title     = {Identifizierung Genetischer Defekte der Famili{\"a}ren Dilatativen Kardiomyopathie},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-22845},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2007},
  abstract  = {Herzinsuffizienz ist eine Krankheit mit wachsender medizinischer und {\"o}konomischer Bedeutung. Die dilatative Kardiomyopathie (DCM) ist eine der Hauptursachen f{\"u}r Herzversagen und f{\"u}hrt in den meisten F{\"a}llen zu einer Herztransplantation. 20-30 \% der DCM-Erkrankungen haben einen genetischen Hintergrund. Durch die Anwendung molekulargenetischer Methoden konnte bereits eine Reihe DCM-verursachender Gene identifiziert werden. Mutationen in Zytoskelettproteinen f{\"u}hrten zu der Hypothese, dass eine Beeintr{\"a}chtigung der Kraft{\"u}bertragung vom Sarkomer auf be-nachbarte Myozyten eine Ursache f{\"u}r die DCM sein k{\"o}nnte. Zus{\"a}tzlich scheint auch eine reduzierte Kraftentwicklung, ausgel{\"o}st durch Mutationen in den Proteinen des Sarkomers die Entwicklung der DCM zu beg{\"u}nstigen. Dar{\"u}ber hinaus wurden Mutationen in Proteinen gefunden, wie z.B. im Lamin A/C- oder Tafazzin-Gen, deren Rolle in der Pathophysiologie der DCM noch nicht gekl{\"a}rt sind. Um die Komplexit{\"a}t der genetischen Defekte, die eine DCM verursachen, besser zu verste-hen, ist es notwendig weitere krankheitsverursachende Gene zu identifizieren. Im ersten Projekt untersuchten wir eine Familie (DCM-I) mit 16 an DCM erkrankten Familienmit-gliedern. Der Ph{\"a}notyp folgte einem autosomal-dominanten Erbgang. Nach Ausschluss aller be-kannter DCM-Loci, f{\"u}hrten wir eine genomweite genetische Suche mit den Mikrosatellitenmarkern der 10. Version des Weber-Screeningsets durch. Durch die Kopplungsanalyse war es m{\"o}glich, ge-netische Kopplung f{\"u}r 80 \% des Genoms auszuschließen. Mehrere benachbarte Marker auf dem langen Arm von Chromosom 7 zeigten hingegen Kosegregation mit dem Krankheitsstatus. Ein maximaler LOD-Score von 4,20 wurde f{\"u}r die Marker D7S471 und D7S501 erzielt. Die Feinkartie-rung mit zus{\"a}tzlichen Markern identifizierte eine Kandidatenregion, die von den beiden Markern D7S2545 und D7S2554 begrenzt wird und ein Intervall von 9,73 Mb umschließt. In dem minima-len Intervall sind 32 Gene sowie 6 aufgrund von Sequenzvergleichen vorhergesagte Transkripte kodiert. Keines dieser Gene kodiert f{\"u}r ein Zytoskelett- oder Sarkomerprotein. Durch Sequenzana-lyse konnten wir eine neue DCM-verursachende Mutation (A100G) in Exon 2 des Gens DLD iden-tifizieren, das f{\"u}r das mitochondriale Protein Dihydrolipoamid-Dehydrogenase (E3) kodiert. Die Mutation ver{\"a}nderte die vorletzte Aminos{\"a}ure des Signalpeptids, das den Import des Proteins in die Mitochondrien dirigiert. Daher hatten wir die Hypothese, dass m{\"o}glichweise der Transport oder die Prozessierung des Signalpeptids beeintr{\"a}chtigt sein k{\"o}nnte. Dazu haben wir das DLD-Signalpeptid mit GFP markiert und die Verteilung des Fusionsproteins in transfizierten humanen Zellen und in isolierten Mitochondrien untersucht. Die Resultate zeigten, dass die Fusionsproteine mit dem mu-tierten Signalpeptid genauso in die Mitochondrien transportiert und prozessiert wurden, wie die Fusionsproteine mit dem Wildtyp-Signalpeptid. Die Enzymaktivit{\"a}t der Dihydrolipoamid-Dehydrogenase in Lymphozyten mit der Mutation A100G liegt innerhalb der normalen Brandbreite und ist im Vergleich zu der Enzymaktivit{\"a}t in Kontroll-Lymphozyten nicht reduziert. Die Identifikation von DLD, einem Protein des Energiemetabolismus, als neues DCM-verursachendes Gen in Familie DCM-I, kann zu einem besseren Verst{\"a}ndnis der komplexen Pa-thophysiologie der dilatativen Kardiomyopathie beitragen. Im zweiten Projekt haben wir eine Familie (DCM-II) untersucht, in der die erkrankten Familien-mitglieder eines oder meherer der folgende Symptome aufwiesen: Reizleitungsst{\"o}rungen, Schlag-anfall, dilatative Kardiomyopathie, Gliederg{\"u}rtel-Muskeldystrophie. Dilatative Kardiomyopathie assoziiert mit Reizleitungsst{\"o}rungen und Skelettmyopathie ist mit Mutationen im Gen f{\"u}r Lamin A und Lamin C (LMNA) korreliert. Zus{\"a}tzlich wurden Mutationen im LMNA in Zusammenhang mit der Emery-Dreifuss-Muskeldystrophie, der Gliederg{\"u}rtel-Muskeldystrophie, Lipodystrophie, dem Charcot-Marie-Tooth-Syndrom und der Hutchinson-Gilford Progerie beschrieben. Da {\"u}ber 90 \% der LMNA-Mutationen Missense-Mutationen sind, resultierte daraus die Hypothese, dass die mu-tierten Proteine {\"u}ber einen dominant-negativen Effekt die dreidimensionale Struktur der Lamin-Intermedi{\"a}rfilamente zerst{\"o}ren. Durch Sequenzanalyse der proteinkodierenden Exons des LMNA konnten wir einen Basenpaaraus-tausch von C nach T an Position 700 (C700T) in Exon 4 identifizieren, der mit dem Ph{\"a}notyp in der Familie segregierte. Die Mutation f{\"u}hrte zum Einbau eines vorzeitigen Stop-Codons (PTC) an Position 234 (Q234X) der Aminos{\"a}uresequenz. Bei der Sequenzanalyse der Lamintranskripte aus Lymphozyten von erkrankten Individuen konnten wir nur das Wildtyp-Allel detektieren, aber nicht das mutierte Allel, was darauf schließen ließ, dass das mutierte Allel m{\"o}glicherweise durch einen Kontrollmechanismus (nonsense-mediated mRNA decay, NMD) degradiert wurde. Nach Inhibition des NMD durch Inkubation der Lymphozyten mit Cycloheximid oder Emetin, akkumulierte das mutierte Transkript wieder in der Zelle. Die Quantifizierung der Lamintranskripte durch Amplifi-kation mittels Real-Time-PCR zeigte eine deutliche Reduktion der Menge an Transkripten in Fi-broblasten von erkrankten Familienmitgliedern. Die Western-Blot-Analyse konnte eine reduzierte Expression von Lamin A und Lamin C best{\"a}tigen. Die Ergebnisse zeigen, dass das Transkript mit dem PTC durch die NMD-Maschinerie degradiert wird und eine Haploinsuffizienz von Lamin A und Lamin C die DCM in dieser Familie verursacht.},
  subject      = {Kongestive Herzmuskelkrankheit},
  language  = {de}
}