@phdthesis{Langlhofer2016, author = {Langlhofer, Georg}, title = {{\"U}ber die Bedeutung intrazellul{\"a}rer Subdom{\"a}nen des Glycinrezeptors f{\"u}r die Kanalfunktion}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-140249}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2016}, abstract = {Der zur Familie der pentameren ligandengesteuerten Ionenkan{\"a}le zugeh{\"o}rige Glycinrezeptor (GlyR) ist ein wichtiger Vermittler synaptischer Inhibition im Zentralnervensystem von S{\"a}ugetieren. GlyR-Mutationen f{\"u}hren zur neurologischen Bewegungsst{\"o}rung Hyperekplexie. Aufgrund fehlender struktureller Daten ist die intrazellul{\"a}re Loop-Struktur zwischen den Transmembransegmenten 3 und 4 (TM3-4 Loop) eine weitgehend unerforschte Dom{\"a}ne des GlyR. Innerhalb dieser Dom{\"a}ne wurden Rezeptortrunkierungen sowie Punktmutationen identifiziert. Rezeptortrunkierung geht mit Funktionslosigkeit einher, welche jedoch durch Koexpression des fehlenden Sequenzabschnitts zum Teil wiederhergestellt werden kann. Innerhalb dieser Arbeit wurde die Interaktion zwischen trunkierten, funktionslosen GlyR und sukzessiv verk{\"u}rzten Komplementationskonstrukten untersucht. Dabei wurden als Minimaldom{\"a}nen f{\"u}r die Interaktion das C-terminalen basische Motive des TM3-4 Loops, die TM4 sowie der extrazellul{\"a}re C-Terminus identifiziert. Die R{\"u}ckkreuzung transgener M{\"a}use, die das Komplementationskonstrukt iD-TM4 unter Kontrolle des GlyR-Promotors exprimierten, mit der oscillator-Maus spdot, die einen trunkierten GlyR exprimiert und 3 Wochen nach der Geburt verstirbt, hatte aufgrund fehlender Proteinexpression keinen Effekt auf die Letalit{\"a}t der Mutation. Des Weiteren wurde die Bedeutsamkeit der Integrit{\"a}t beider basischer Motive 316RFRRKRR322 und 385KKIDKISR392 im TM3-4 Loop in Kombination mit der Loop-L{\"a}nge f{\"u}r die Funktionalit{\"a}t und das Desensitisierungsverhalten des humanen GlyRα1 anhand von chim{\"a}ren Rezeptoren identifiziert. Eine bisher unbekannte Patientenmutation P366L innerhalb des TM3-4 Loops wurde mit molekularbiologischen, biochemischen und elektrophysiologischen Methoden charakterisiert. Es wurde gezeigt, dass die mutierten Rezeptorkomplexe in vitro deutlich reduzierte Glycin-induzierte Maximalstr{\"o}me sowie eine beschleunigte Schließkinetik aufweisen. P366L hat im Gegensatz zu bereits charakterisierten Hyperekplexiemutationen innerhalb des TM3-4 Loops keinen Einfluss auf die Biogenese des Rezeptors. P366 ist Teil einer m{\"o}glichen Poly-Prolin-Helix, die eine Erkennungssequenz f{\"u}r SH3-Dom{\"a}nen darstellt. Ein potenzieller Interaktionspartner des TM3-4 Loops des GlyRα1 ist Collybistin, welches eine wichtige Rolle bei der synaptischen Rezeptorintegration spielt und die Verbindung zum Zytoskelett vermittelt. An der inhibitorischen Synapse verursacht P366L durch die Reduzierung postsynaptischer Chloridstr{\"o}me, das beschleunigte Desensitisierungsverhalten des GlyRα1 sowie ein ver{\"a}ndertes Interaktionsmotiv St{\"o}rungen der glycinergen Transmission, die zur Auspr{\"a}gung ph{\"a}notypischer Symptome der Hyperekplexie f{\"u}hren.}, subject = {Glycinrezeptor}, language = {de} } @phdthesis{Fuhl2024, author = {Fuhl, Isabell}, title = {Untersuchung der synaptischen Lokalisation des heteromeren Glycin-Rezeptors in einem neuen Mausmodell der \(Startle\) Erkrankung - mit Fokus auf die GlyR-β-Untereinheit -}, doi = {10.25972/OPUS-34832}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-348328}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2024}, abstract = {Der Glycin-Rezeptor ist Teil der inhibitorischen liganden-gesteuerten Ionenkan{\"a}le im ZNS und wird am st{\"a}rksten im adulten R{\"u}ckenmark sowie im Hirnstamm exprimiert. In der Nerv-Muskel-Synapse sind GlyR f{\"u}r die rekurrente Hemmung der Motoneuronen wichtig und steuern das Gleichgewicht zwischen Erregung und Hemmung der Muskelzellen. F{\"u}r die glycinerge Neurotransmission sind neben den pr{\"a}synaptischen GlyR 𝛼1 insbesondere postsynaptische GlyR 𝛼1/𝛽 verantwortlich. Durch Mutationen des GlyR entsteht das Erkrankungsbild der Hyperekplexie mit {\"u}bersteigerter Schreckhaftigkeit, Muskelsteifheit und Apnoe. Haupturs{\"a}chlich daf{\"u}r sind Mutationen im GLRA1-Gen. Die shaky Maus stellt ein gutes Modell zur Erforschung dieser seltenen Erkrankung dar. Die shaky Missense-Mutation Q177K in der extrazellul{\"a}ren 𝛽8-𝛽9 Schleife der Glycin- Rezeptor-𝛼1-Untereinheit zeigte strukturell ein gest{\"o}rtes Wasserstoffbr{\"u}ckennetzwerk. Funktionell konnten eingeschr{\"a}nkt leitf{\"a}hige Ionenkan{\"a}le identifiziert werden. Der letale Ph{\"a}notyp {\"a}ußert sich beim homozygoten shaky Tier durch Schrecksymptome mit einem einhergehenden zunehmenden Gewichtsverlust. Die Quantifizierung der Oberfl{\"a}chenexpression deutete auf einen Verlust synaptischer GlyR 𝛼1/𝛽 hin. Aussagen bez{\"u}glich der GlyR-𝛽-Untereinheit, die Teil des synaptischen GlyR Komplexes ist, waren aufgrund fehlender stabiler Antik{\"o}rper bisher nicht m{\"o}glich. Das neuartige KI- Mausmodell Glrb eos exprimiert endogen fluoreszierende 𝛽 -Untereinheiten und erm{\"o}glicht damit erstmalig eine Betrachtung der GlyR- 𝛽-Expression in Tiermodellen der Startle Erkrankung. Ziel dieser Arbeit war es, die Auswirkungen der shaky Mutation auf die Interaktion mit der 𝛽 -Untereinheit und Gephyrin zu erforschen. Daf{\"u}r wurden Markerproteine der glycinergen Synapse in R{\"u}ckenmarksneuronen der Kreuzung Glrb eos x Glra1 sh gef{\"a}rbt und quantifiziert. Die durchgef{\"u}hrte Gewichtsbestimmung der Nachkommen im zeitlichen Verlauf zeigte keinen Einfluss der eingef{\"u}gten mEos4b-Sequenz auf das K{\"o}rpergewicht der Tiere und schließt damit funktionelle Einschr{\"a}nkungen bedingt durch die mEos4b-Sequenz aus. Zur Verst{\"a}rkung des 𝛽 eos-Signals wurde ein Antik{\"o}rper verwendet. Die Quantifizierung der GlyR- 𝛽- Untereinheit an R{\"u}ckenmarksneuronen zeigte f{\"u}r homozygote shaky Tiere im Vergleich zum Wildtyp signifikant reduzierte 𝛽eos Oberfl{\"a}chenexpressionen in Gephyrin Clustern sowie signifikant erniedrigte Kolokalisationen von Gephyrin/𝛼1, 𝛽eos/𝛼1 und 𝛽eos/Gephyrin. Die mutierte GlyR-𝛼1- Untereinheit wurde hingegen vermehrt an der Oberfl{\"a}che in shaky Tieren exprimiert. Die Ergebnisse der R{\"u}ckenmarksschnitte unterst{\"u}tzen diese Befunde aus den Prim{\"a}rneuronen. Die Untersuchung der Pr{\"a}synapse erbrachte f{\"u}r Glrb eos/eos x Glra1 sh/sh eine signifikant verminderte Synapsin und Synapsin/𝛼1 Expression. Die Ergebnisse dieser Arbeit erweitern die Daten fr{\"u}herer Arbeiten zur shaky Maus und zeigen einen starken Verlust synaptischer GlyR 𝛼 1/ 𝛽 an der Oberfl{\"a}che von Motoneuronen. Ein m{\"o}glicher kompensatorischer Versuch durch erh{\"o}hte 𝛼1 Expression bleibt infolge der Funktionsbeeintr{\"a}chtigung dieser mutierten GlyR- 𝛼 1 Rezeptoren erfolglos mit letalem Ausgang. In vorherigen Arbeiten wurde vermutet, dass die Mutation in der extrazellul{\"a}ren Bindungsstelle in der Lage ist, Konformations{\"a}nderungen in die TM3-TM4-Schleifenstruktur zu {\"u}bertragen und dadurch die Gephyrin Bindung und synaptische Verankerung zu st{\"o}ren. Die Daten dieser Arbeit st{\"u}tzen diese Annahme und weisen dar{\"u}ber hinaus auf eine gest{\"o}rte Rezeptorkomplexbindung hin. Die vorliegende Arbeit tr{\"a}gt somit zum besseren Verst{\"a}ndnis der Startle Erkrankung auf synaptischer Ebene bei.}, subject = {Glycinrezeptor}, language = {de} } @phdthesis{Drehmann2018, author = {Drehmann, Paul}, title = {SLC7A10 als neues Gen f{\"u}r humane Hyperekplexie}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-159736}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2018}, abstract = {Neuste Studien haben ergeben, dass Asc-1 Knock-out M{\"a}use aufgrund einer verminderten intrazellul{\"a}ren Glycinkonzentration in synaptischen Boutons im Gehirn, einen Hyperekplexie-{\"a}hnlichen Ph{\"a}notyp entwickeln. Aufgrund nicht vollst{\"a}ndig gekl{\"a}rter Ursachen f{\"u}r die Entstehung des Krankheitsbildes der Hyperekplexie beim Menschen, wurde eine Kohorte von 51 Patienten zusammengetragen, um vor dem Hintergrund der Forschungsergebnisse zu Asc-1 im Tiermodell, das kodierende Gen beim Menschen SLC7A10 als m{\"o}gliches Kandidatengen auf Sequenzalterationen zu untersuchen. Hierf{\"u}r wurde aus Vollblut der an Hyperekplexie erkrankten Patienten genomische DNA isoliert, um mittels PCR und anschließendem Screening der Sequenzen, Mutationen innerhalb funktionell wichtiger Bereiche des Gens zu eruieren. Neben weiteren Sequenzunterschieden, die meist in Introns gefunden wurden, wurde die codierende Mutation G307R innerhalb von Exon 7 identifiziert, die letztendlich der Grund f{\"u}r eine Versuchsreihe war, um zu hinterfragen, ob dieser Aminos{\"a}ureaustausch in der Proteinsequenz funktionelle Konsequenzen zur Folge hat. HEK293-Zellen wurden mit dem zuvor hergestellten Klon G307R transfiziert, um {\"u}ber Biotinylierung, immuncytochemische F{\"a}rbungen und funktionelle Untersuchungen die Aktivit{\"a}t des Transporters zu beurteilen. Hier zeigte sich ein Funktionsverlust von {\"u}ber 95 \%, bei uneingeschr{\"a}nkter Oberfl{\"a}chenexpression. ASC-1 best{\"a}tigt sich damit als neue Ursache in der Auspr{\"a}gung von Hyperekplexie. Ferner k{\"o}nnen Zusammenh{\"a}nge mit geistiger Retardierung und eingeschr{\"a}nkter neuronaler Plastizit{\"a}t bestehen.}, subject = {Knockout}, language = {de} }