@phdthesis{Helm2020,
  author    = {Helm, Johanna Charlotte},
  title     = {Invasive Mykosen - Prognose und Diagnose mittels Aspergillus fumigatus-spezifischer CD154+/CD4+ Zellen},
  doi       = {10.25972/OPUS-21340},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-213406},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2020},
  abstract  = {In den vergangenen Jahrzehnten kam es durch den Einsatz massiv immunsupprimierender Therapien zu einer steigenden Inzidenz invasiver Mykosen. Die durch eine Infektion mit A. fumigatus ausgel{\"o}ste invasive Aspergillose stellt eine lebensbedrohliche Erkrankung f{\"u}r Patienten mit h{\"a}matologischen Malignomen oder nach h{\"a}matopoetischer Stammzelltransplantation dar. F{\"u}r die Behandlung solcher Erkrankungen ist eine fr{\"u}hzeitige Diagnosestellung unabdingbar. Da invasive diagnostische Maßnahmen bei den betroffenen Patienten jedoch h{\"a}ufig kontraindiziert sind, werden neue Biomarker und nicht invasive Diagnoseverfahren intensiv beforscht. Ein k{\"u}rzlich beschriebener Ansatz zur Prim{\"a}r- und Verlaufsdiagnostik bei Patienten mit invasiven pulmonalen Aspergillosen und Mukormykosen ist die Verwendung des auf aktivierten T-Zellen exprimierten Aktivierungsmarkers CD154 zur durchflusszytometrischen Quantifizierung A. fumigatus-spezifischer T-Helfer-Zellen. Die Detektion dieser Zellen mit dem in der Literatur beschriebenen Protokoll erfordert die Isolation von PBMCs und duldet vor der Verarbeitung der Proben in einem spezialisierten Labor nur kurze pr{\"a}analytische Lagerungszeiten. Dies stellt einen limitierenden Faktor f{\"u}r die klinische Verwendbarkeit des beschriebenen Assays dar. Die vorliegende Dissertationsschrift besch{\"a}ftige sich damit, den beschriebenen Assay zur Detektion A. fumigatus-spezifischer T-Zellen, hinsichtlich seiner Pr{\"a}analytik und klinischen Anwendbarkeit eingehender zu evaluieren und zu optimieren. Zun{\"a}chst konnte gezeigt werden, dass mittels Verd{\"u}nnung und Agitation der zur PBMC Isolation verwendeten Blutproben eine Verl{\"a}ngerung des pr{\"a}analytischen Zeitfensters zwischen Blutentnahme und Aufbereitung auf bis zu 4 h m{\"o}glich ist, ohne dass dabei die Sensitivit{\"a}t des CD154-basierten T-Zell-Assays beeintr{\"a}chtigt wird. Weiterhin konnte die Verwendung eines Vollblut-basierten Protokolls, das auf die zeitaufwendige Isolation von PBMCs verzichtet, etabliert werden. Hinsichtlich seiner Detektionsleistung zeigte sich das Vollblutprotokoll dem PBMC Protokoll grunds{\"a}tzlich {\"u}berlegen. F{\"u}r verschiedene Stimulationsperioden konnte ein gegen{\"u}ber dem PBMC Standardprotokoll reproduzierbarer Konversionsfaktor ermittelt werden, welcher einen Vergleich von Ergebnissen bei alternierender Durchf{\"u}hrung von PBMC- und Vollblut-Assay bei den selben Patienten m{\"o}glich macht. Das Protokoll erlaubt die Kombination von Stimulations- und Transportzeit unter Verwendung eines auf 37 °C temperierten Transportgef{\"a}ßes. Eine alleinige Stimulation bei Raumtemperatur zeigte sich hingegen nicht erfolgreich. Die Anwendung des Assays am Point-of-Care wird durch die Verwendung vorbereiteter, markt{\"u}blicher Blutentnahmer{\"o}hrchen m{\"o}glich, welche bis zum Zeitpunkt der Verwendung eingefroren gelagert werden k{\"o}nnen. Eine Analyse der Material- und Arbeitskosten ergab eine Reduktion der Gesamtkosten f{\"u}r die Verwendung des Vollblut-basierten Protokolls von bis zu 22 \% pro Probe. Prinzipiell kann davon ausgegangen werden, dass der entwickelte Assay mit jedem Peptid-Antigen durchf{\"u}hrbar ist, das in konstanter Qualit{\"a}t bezogen oder generiert werden kann und einen immunogenen Effekt aufweist, ohne dabei mit anderen verwendeten Reagenzien zu interagieren. Weiterhin wurde in der vorliegenden Arbeit gepr{\"u}ft, wie sich T-Zell-inhibitorische Substanzen auf die Testergebnisse auswirken. Hierbei fand sich eine nicht unwesentliche Anzahl falsch-negativer Testergebnisse. Die Ergebnisse der vorliegenden Dissertationsschrift zeigen, dass eine suffiziente und sensitive Bestimmung A. fumigatus-spezifischer T-Zellen im Rahmen eines Vollblut-basierten Protokolls m{\"o}glich ist. Eine Ausweitung des Assays f{\"u}r andere Infektionserreger, sowie die Entwicklung Brefeldin A-freier Protokolle w{\"a}ren w{\"u}nschenswert. Ein m{\"o}gliches Einsatzgebiet stellen klinisch infektiologische Studien oder umwelt- und arbeitsmedizinische Fragestellungen dar.},
  subject      = {Aspergillus fumigatus},
  language  = {de}
}