@article{HackerOttWintermeyeretal.1993,
  author    = {Hacker, J{\"o}rg and Ott, Manfred and Wintermeyer, Eva and Ludwig, Birgit and Fischer, Gunter},
  title     = {Analysis of virulence factors of Legionella pneumophila.},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-70620},
  year      = {1993},
  abstract  = {Legionella pneumophila, the causative agent of Legionnaires' disease is a facultative intracellular bacterium, which in the course of human infection multiplies in lung macrophages predominantly manifesting as pneumonia. The natural habitat of Legionella is found in sweet water reservoirs and man-made water systems. Virulent L. pneumophila spontaneously convert to an avirulent status at a high frequency. Genetic approaches have led to the identification of various L. pneumophila genes. The mip (macrophage infectivity potentiator) determinant remains at present the sole established virulence factor. The Mip protein exhibits activity of a peptidyl prolyl cis trans isomerase (PPiase), an enzyme which is able to bind the immunosuppressant FK506 and is involved in protein folding. The recently cloned major outer membrane protein (MOMP) could play a role in the uptake of legionellae by macrophages. Cellular models are useful in studying the intracellular replication of legionellae in eukaryotic cells. Human celllines and protozoan models are appropriate for this purpose. By using U 937 macrophage-like cells and Acanthamoeba castellanii as hosts, we could discriminate virulent and avirulent L. pneumophila variants since only the virulent strain was capable of intracellular growth at 37 oc. By using these systems we further demonstrated that a hemolytic factor cloned and characterized in our laboratory, legiolysin (lly), had no influence on the intracellular growth of L. pneumophila.},
  subject      = {Legionella pneumophila},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Wagner2004,
  author    = {Wagner, Carina},
  title     = {Dictyostelium als Wirtsmodell und Funktionsanalyse des Virulenzfaktors Mip aus Legionella pneumophila},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-12488},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2004},
  abstract  = {Legionella pneumophila wurde erstmals 1977 beschrieben, nachdem der Erreger aus dem Lungengewebe eines Patienten isoliert wurde, der an einer schweren atypischen Pneumonie erkrankt war. Das Bakterium zeichnet sich durch ein duales Wirtssystem aus und kann sich sowohl in Protozoen als auch in humanen Zellen vermehren. Ein Ziel dieser Arbeit war es, wichtige Faktoren einer Legionelleninfektion seitens der Wirtszelle zu betrachten. Als Wirtsmodell diente die soziale Am{\"o}be Dictyostelium discoideum. Mit Hilfe eines von Patrick Farbrother (Universit{\"a}t K{\"o}ln) etablierten Dictyostelium DNA-Microarrays mit 5906 genspezifischen Sonden, wurde die Genexpression von D. discoideum in Reaktion auf eine Infektion durch L. pneumophila untersucht. Zur Kontrolle dienten uninfizierte Zellen, und Zellen, die mit L. hackeliae bzw. einer dotA-Mutante von L. pneumophila koinkubiert wurden. Diese beiden St{\"a}mme weisen eine verminderte Pathogenit{\"a}t bzw. ein deletiertes Pathogenit{\"a}tsgen auf. F{\"u}r den Zeitpunkt 24 h nach Infektionsbeginn wurden 140 Gene gefunden, die in D. discoideum in Reaktion auf eine Infektion mit L. pneumophila differentiell exprimiert werden. Einige Gene codieren bereits bekannte Proteine von D. discoideum. Dazu geh{\"o}ren das RtoA (ratioA, Fusion von Vesikeln), Discoidin I, CotB (spore coat Protein SP70) und die lysosomale \&\#945;-Mannosidase. Mit Hilfe von Homologie-Suchen konnte weiteren unbekannten Proteinen eine Funktion zugeteilt werden. Hierzu z{\"a}hlen die Chaperone ClpB (heat shock protein Hsp104), \&\#946;'-COP (coat protein) und drei calciumbindende Proteine. Nach Einteilung in funktionelle Kategorien, konnte gezeigt werden, dass viele Gene reguliert werden, deren Produkte am Aminos{\"a}ure-Metabolismus beteiligt sind oder bei denen es sich um ribosomale Proteine handelt. Des Weiteren wurde in dieser Arbeit das Nramp-Protein von D. discoideum n{\"a}her untersucht. Nramp transportiert zweiwertige Kationen {\"u}ber die phagosomale Membran. Es konnte festgestellt werden, dass die Aufnahme von L. pneumophila und M. avium in eine nramp-Mutante deutlich reduziert ist. Allerdings ist eine vermehrte Replikation von Legionellen und Mykobakterien in der Wirtsmutante zu beobachten. In Zusammenarbeit mit Salvatore Bozzaro (Turin, Italien) konnte gezeigt werden, dass w{\"a}hrend einer Infektion mit L. pneumophila die nramp-Expression sinkt und bereits nach 48 h ann{\"a}hernd keine nramp-RNA im Northern-Blot nachweisbar ist. Im Gegensatz dazu bleibt die nramp-Expression w{\"a}hrend einer Infektion mit M. avium relativ konstant. In Infektionsstudien konnte nachgewiesen werden, dass sich die Endozytobionten TUME1, UWE25 und UWC6 in D. discoideum vermehren k{\"o}nnen. Mit Hilfe von spezifischen Cy3-markierten 16S-rRNA Sonden wurde die intrazellul{\"a}re Zunahme der Bakterien {\"u}ber 48 h beobachtet. Zum Zeitpunkt 48 h nach Inokulation konnte eine erh{\"o}hte Anzahl der drei Endozytobionten in D. discoideum festgestellt werden. Anhand von elektronenmikro-skopischen Aufnahmen konnte gezeigt werden, dass die St{\"a}mme TUME1 und UWE25 im Zytoplasma des Wirtes von membran{\"o}sen Strukturen eng umschlossen sind. UWC6 konnte sowohl in Vakuolen als auch frei im Zytoplasma nachgewiesen werden. Die Lokalisierung der Endozytobionten entspricht ihrer Lokalisierung in ihren nat{\"u}rlichen Wirten. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war die Funktionsanalyse des Mip-Proteins aus L. pneumophila. Das Mip-Protein von Legionella geh{\"o}rt in die Klasse der FK506-Bindeproteine. Es besitzt Peptidyl-Prolyl cis/trans Isomeraseaktivit{\"a}t und bildet Homodimere. Mip kann an die extrazellul{\"a}re Matrix von Lungenepithelzellen binden, speziell an das Collagen IV. Mit Hilfe von Transwell-Versuchen konnte festgestellt werden, dass Mip f{\"u}r die Penetration von Legionella durch eine Barriere aus Lungenepithelzellen verantwortlich ist. Die Penetrationsf{\"a}higkeit konnte nach Hemmung der PPIase-Aktivit{\"a}t durch FK506 bzw. Rapamycin gehemmt werden. Ebenso waren Legionellen nach Hemmung der Serinproteaseaktivit{\"a}ten im Transwell-System nicht mehr in der Lage die Barriere aus Epithelzellen mit extrazellul{\"a}rer Matrix zu durchwandern. Mit Hilfe von Degradationsassays mit S35-markierter extrazellul{\"a}rer Matrix konnte gezeigt werden, dass mip-positive Legionellen extrazellul{\"a}re Matrix degradieren k{\"o}nnen. Nach Hemmung der PPIase-Aktivit{\"a}t bzw. Serinproteaseaktivit{\"a}t konnten mip-positive Legionellen extrazellul{\"a}re Matrix nicht mehr degradieren.},
  subject      = {Legionella pneumophila},
  language  = {de}
}
@article{OttBenderLuecketal.1992,
  author    = {Ott, M. and Bender, L. and L{\"u}ck, P. C. and Meyer, P. and Hacker, J{\"o}rg},
  title     = {Distribution of Legionellae in a hospital water system: prevalence of immunologically and genetically related Legionella pneumophila serogroup 6 isolates},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-59827},
  year      = {1992},
  abstract  = {A hospital warm water system was monitored for the prcsence and distribution of lcgionellac. Subtyping of ten scletled Legionella pneumophiltl isolates. originating from four different sites in the system by using serogroup spccific antisera in an indircct immunofluorcscence tcst, rcvcalcd that nine of the tcn isolatcs belonged to scrogroup 6, while the remaining one was serogroup I 0. Two monoclonal antibodics (mAbs) spccific for a subgroup of serogroup 6 strains were further used for characterization. None of the strains reactcd with these mAbs. Genome analysis by elaborating Not I profiles using the pulscd field gel electrophoresis (PFGE) technique revealed that nearly all serogroup 6 isolates dcrived from different sites, including a new building connected hy a ring pipe. wcrc identical according to restriction fragment pattems. The patterns were distinguishable from those of the two L. pnewnophi/a serogroup 6 rcfcrencc strains, and ftom that of thc L. pneumophila scrogroup 10 isolate. These data arguc for a relatively homogeneaus L. pneunwpltila serogroup 6 population in the entire watcr system.},
  subject      = {Infektionsbiologie},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Weinmann2008,
  author    = {Weinmann, Erik},
  title     = {Ein neues Konjugationsssystem in Legionella pneumophila Corby},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-29485},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2008},
  abstract  = {In dieser Arbeit wurde in Legionella pneumophila Corby ein bislang nicht in L. pneumophila beschriebener Bereich im Genom kloniert und sequenziert, der f{\"u}r ein putatives Konjugations- Typ IV Sekretionssystem kodiert. Alle f{\"u}r ein Typ IV Sekretionssystem notwendigen Gene sind vorhanden. Zum einen kodieren diese ein „mating pair formation" System, also Proteine f{\"u}r die Pilusgenese und energieabh{\"a}ngigen Transport von Substraten aus der Bakterienzelle. Konjugationsexperimente zeigen, dass es sich bei den „DNA transfer and replication" Genen trb/tra System um einen funktionierenden Mechanismus zur Mobilisierung von DNA handelt.},
  subject      = {Legionella},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Koehler2000,
  author    = {K{\"o}hler, Rolf},
  title     = {Entwicklung eines GFP-Reportersystems in Legionella und molekularbiologische Funktionsanalyse des Legionella Mip-Proteins},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-1594},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2000},
  abstract  = {Das fakultativ intrazellul{\"a}re Bakterium Legionella pneumophila wurde erstmals 1977 als Erreger der Legionellose, einer schweren atypisch verlaufenden Pneumonie identifiziert. Es besitzt ein duales Wirtssystem und kann sich sowohl in aquatischen Habitaten in Protozoen als auch in phagozytierenden Humanzellen als Pathogen vermehren. Zur Analyse der komplexen Interaktion zwischen Pathogen und Wirtszelle wurde in dieser Arbeit ein GFP (Green Fluorescent Protein)-Reportersystem etabliert und erfolgreich eingesetzt. Es erlaubt ein in vivo Monitoring von Legionella Infektionen und erm{\"o}glicht die schnelle Quantifizierung bakterieller Invasion in Wirtszellen in Abh{\"a}ngigkeit von verschiedenen Faktoren. Zur Etablierung der GFP-vermittelten Fluoreszenz wurde eine transkriptionelle Fusion des gfpmut2-Gens mit dem Legionella spezifischen mip ("macrophage infectivity potentiator")-Promoter (Pmip) konstruiert. Zus{\"a}tzlich wurde ein Vektor mit dem von Listeria stammenden sod ("super oxid dismutase")-Promoter eingesetzt. Mit diesen Vektoren transformierte Legionella-St{\"a}mme zeigten nach entsprechender Anregung eine starke Gr{\"u}nfluoreszenz und belegen somit erstmals die Funktionalit{\"a}t von GFP in Legionella. Durch den Einsatz von Fluoreszenzmikroskopie, Spektrofluorimetrie und Durchflusszytometrie (FACS-Analyse) wurden die St{\"a}mme hinsichtlich der Unterschiede in der Virulenz und der intrazellul{\"a}ren Vermehrung untersucht. Ergebnisse, die durch die zeitaufwendige Bestimmung von CFU-Werten ermittelt wurden, konnten verifiziert und damit die Validit{\"a}t des GFP-Reportersystems in Legionella best{\"a}tigt werden. Quantitative Analysen der mip-Promoteraktivit{\"a}t belegen die konstitutive Expression und zeigen, dass Unterschiede in der Virulenz nicht auf variierende mip-Promoteraktivit{\"a}t zur{\"u}ckzuf{\"u}hren sind. Dar{\"u}ber hinaus konnte der Einfluss verschiedener Phagozytose-Inhibitoren auf die Aufnahme von Legionellen in die Protozoenwirte Acanthamoeba castellanii und Hartmannella vermiformis mittels des GFP-Reportersystems quantifiziert und qualitativ bewertet werden. Durch die Verwendung des Inhibitors Cytochalasin D konnte ein Einfluss Mikrofilament-abh{\"a}ngiger Phagozytose auf die Aufnahme in H. vermiformis und A. castellanii ausgeschlossen werden. Wie in Inhibitionsstudien mit Cycloheximid und Methylamin best{\"a}tigt werden konnte, erfolgt die Phagozytose in H. vermiformis wahrscheinlich vorwiegend {\"u}ber Rezeptor-vermittelte-Endozytose. Dem Protozoenwirt A. castellanii stehen dagegen zus{\"a}tzliche M{\"o}glichkeiten der bakteriellen Internalisierung zur Verf{\"u}gung. Diese Ergebnisse best{\"a}tigen die postulierte Heterogenit{\"a}t der Aufnahme-Mechanismen innerhalb verschiedener Protozoenwirte. Nach erfolgter Phagozytose von L. pneumophila wird der endosomale Weg der Phagolysosom- Reifung blockiert, hierf{\"u}r wird die Sekretion bislang unbekannter Effektoren verantwortlich gemacht. Durch die Konstruktion von C-terminalen Mip::GFP-Fusionsproteinen sollte die Detektion einer eventuellen Translokation des Mip-Proteins als Virulenzfaktor innerhalb der Wirtszelle erm{\"o}glicht werden. Die erzeugten Fusionsproteine waren wahrscheinlich aufgrund der homodimeren Mip-Struktur instabil und wurden nicht {\"u}ber die Cytoplasmamembran hinweg transportiert. Sie erwiesen sich daher als nicht geeignet, dieser Fragestellung weiter nachzugehen. Da die in vivo Funktion von PPIasen (Peptidyl-Prolyl-cis/trans-Isomerasen) wie dem Mip-Protein in Prokaryoten bis heute weitgehend unbekannt ist, sollte im zweiten Teil dieser Arbeit versucht werden, einen Interaktionspartner zu identifizieren und den Einfluss der Dimerisierung und der PPIase-Aktivit{\"a}t des Mip-Proteins auf die Virulenz von L. pneumophila zu untersuchen. Durch Quervernetzung-Experimente konnte ein putativer, prokaryotischer Interaktionspartner des Legionella Mip-Proteins detektiert werden. Die N-terminale Aminos{\"a}ure-Sequenzierung ergab jedoch keinerlei Homologie zu bereits bekannten Legionella- oder anderen Proteinen. Es kann nicht ausgeschlossen werden, dass eine N-terminale Blockierung die Aufkl{\"a}rung der Sequenz urs{\"a}chlich verhindert. Wie in fr{\"u}heren Arbeiten gezeigt wurde, ist die PPIase-Aktivit{\"a}t des Legionella Mip-Proteins f{\"u}r die Invasion und das intrazellul{\"a}re {\"U}berleben in Protozoen, Monozyten und der Makrophagen-{\"a}hnlichen Zelllinie U937 nicht notwendig. Ein weiteres Charakteristikum des Proteins ist seine homodimere Struktur und die Assoziation mit der {\"a}ußeren Membran. In Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. G. Fischer in Halle konnte durch Deletion der N-terminalen Dom{\"a}ne (AS 4-79) ein verk{\"u}rztes Dimer-defizientes Legionella Mip-Protein (L.p.FKBP-20-3, 80-213) erzeugt und biochemisch charakterisiert werden. Durch site-spezifische Mutagenese N-terminal lokalisierter Aminos{\"a}uren (K11A/D32A, Y16A/D32A und M38,42E) konnte deren Beteiligung an der Dimerisierung nachgewiesen werden. Zur Analyse des Einflusses der dimeren Ouart{\"a}rstruktur auf die Pathogenit{\"a}t wurde ein mip-negativer Stamm mit dem nur noch als Monomer vorliegenden Mip-Protein (L.p.FKBP-20-3, 80-213) in cis komplementiert und die Expression sowie Integration in L. pneumophila PhilI JR32-2.4 verifiziert. Ergebnisse aus Infektionsstudien zeigten deutlich, dass die Dimerisierung des Legionella Mip-Proteins und nicht die Isomerase-Aktivit{\"a}t f{\"u}r die Infektion von monozellul{\"a}ren Systemen entscheidend ist. Im Gegensatz dazu konnte in Tierexprimenten (Meerschweinchen) die Beteiligung der Isomerase-Aktivit{\"a}t an der Pathogenit{\"a}t von L. pneumophila nachgewiesen werden. Der Verlust der Isomerase-Aktivit{\"a}t wirkt sich, verglichen mit dem monozellul{\"a}ren System (A. castellanii), im Tiermodel wesentlich dramatischer auf das intrazellul{\"a}re {\"U}berleben aus. Mit site-spezifisch ver{\"a}ndertem Mip-Protein komplementierte Legionella-St{\"a}mme zeigten eine intrazellul{\"a}re Vermehrung in Abh{\"a}ngigkeit der gemessenen in vitro Isomerase-Restaktivit{\"a}t. Durch den Einsatz der dimerisierungsdefizienten Mip-Komplementante, L. pneumophila PhilI JR32-2.4, wurde die Notwendigkeit der Dimerisierung des Mip-Proteins auch im Tiermodell best{\"a}tigt. Durch die vorliegende Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Funktion der Isomerase-Aktivit{\"a}t f{\"u}r die Infektion monozellul{\"a}rer Systeme und h{\"o}herer Organismen unterschiedlich ist.},
  subject      = {Legionella pneumophila},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Grimm2000,
  author    = {Grimm, Dorothee},
  title     = {Entwicklung von neuen Nachweismethoden f{\"u}r Legionellen und Am{\"o}ben und ihre Anwendung in {\"o}kologischen Studien},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-1351},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2000},
  abstract  = {Legionella pneumophila wurde 1976 als Erreger der Legionellose, einer schweren Form von Lungenentz{\"u}ndung, identifiziert. Die inzwischen 42 Arten umfassende Gattung ist weltweit in aquatischen Biotopen verbreitet. Die Bakterien leben vergesellschaftet mit anderen Mikroorganismen in Biofilmen oder intrazellul{\"a}r in Protozoen. Sie haben ein duales Wirtssystem, das heißt, sie sind in der Lage, sich sowohl in Einzellern als auch in humanen Phagozyten zu vermehren. F{\"u}r die Erweiterung ihrer Habitate spielen verschiedene Umweltfaktoren eine Rolle. Eine exakte und schnelle Detektion und Identifikation der humanpathogenen Keime ist sowohl f{\"u}r die Lokalisierung der Infektionsquelle als auch f{\"u}r eine rechtzeitige Therapie der Patienten von großer Bedeutung. Die Technik der fluoreszierenden in situ Hybridisierung (FISH) basiert auf der Bindung einer spezifischen, mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten Oligonukleotidsonde an eine komplement{\"a}re Zielsequenz der ribosomalen RNA. In der vorliegenden Arbeit wurde f{\"u}r die in situ Hybridisierung eine neue 16S rRNA-gerichtete Sonde LEGPNE1 entwickelt, die spezifisch ist f{\"u}r L. pneumophila. In Versuchsreihen mit verschiedenen Bakterienkulturen wurden die Spezifit{\"a}t und Sensitivit{\"a}t der Gensonde ermittelt. LEGPNE1 erwies sich als artspezifisch und erkannte alle getesteten L. pneumophila-St{\"a}mme, ungeachtet ihrer Serogruppe. Nicht-pneumophila-Referenzst{\"a}mme hybridisierten nicht mit der Sonde, ein einziger Basenaus-tausch in der Sequenz war f{\"u}r diese Unterscheidung ausreichend. Die Anwendung der Sonde wurde auch in Am{\"o}ben-Infektionsassays und Umweltproben erfolgreich durchgef{\"u}hrt. Unterschiedliche, intrazellul{\"a}r vorliegende Bakterien wurden von der Sonde spezifisch erkannt. Eine in situ Dokumentation der Infektions- und Vermehrungsrate war damit m{\"o}glich. Durch die meist fakultativ intrazellul{\"a}re Lebensweise der Legionellen ist es wichtig, auch die Wirtszellen der Keime qualitativ zu detektieren und zu identifizieren. Die Entwicklung neuer Gensonden wurde daher auf die beiden bekannten Wirtsam{\"o}ben Hartmannella und Naegleria ausgedehnt. Basierend auf Sequenzvergleichen wurden die gattungsspezifischen 18S rRNA-gerichteten Sonden HART498 und NAEG1088 konstruiert und in Versuchsreihen mit Referenzst{\"a}mmen bei steigender Stringenz etabliert. Mit ihrer Hilfe konnten die Ergebnisse der zeit- und arbeitsaufwendigen Determination unbekannter Am{\"o}ben anhand morphologischer Merkmale best{\"a}tigt werden. In situ Hybridisierungen mit einer Kombination von 16S und 18S rRNA-gerichteten Sonden wurden in Am{\"o}ben-Infektionsassays mit Hartmannella vermiformis und L. pneumophila erfolgreich durchgef{\"u}hrt. Eine Interferenz der Sonden fand nicht statt. Die in situ Untersuchung der Struktur und Funktion komplexer mikrobieller Lebensgemeinschaften erfordert eine kultivierungsunabh{\"a}ngige und hochaufl{\"o}sende Methode, wie sie die fluoreszierende in situ Hybridisierung darstellt. Mit dem Ziel, m{\"o}gliche Pr{\"a}ferenzen der Legionellen f{\"u}r bestimmte Parameter, wie pH, Temperatur, elektrische Leitf{\"a}higkeit, Str{\"o}mungsverh{\"a}ltnisse, zu erkennen und zu definieren, wurden mit Hilfe der neu entwickelten 16S rRNA-gerichteten Sonde 21 verschiedene Kaltwasserhabitate auf die Verbreitung von Legionella untersucht. Die Bakterien zeigten jedoch ein breites Toleranzspektrum gegen{\"u}ber den gemessenen Parametern. Sie waren in nahezu allen beprobten Gew{\"a}ssern zu finden und ließen sich unabh{\"a}ngig von der Jahreszeit nachweisen. Die neue Sonde LEGPNE1 zeigte sich in in situ Hybridisierungen der Umweltproben als hochspezifisch. Mit ihr konnten auch nicht kultivierbare Legionellen detektiert werden. In drei Legionella-positiven Gew{\"a}ssern wurde außerdem das Vorkommen von Am{\"o}ben untersucht. Es konnten insgesamt acht Am{\"o}bengattungen isoliert, kultiviert und bestimmt werden. Dominierend waren St{\"a}mme des nicht humanpathogenen Naegleria gruberi-Komplexes, Echinamoeba spp. und Echinamoeba-like Am{\"o}ben. In einzelnen Proben wurden Acanthamoeba spp. Gruppe II, Hartmannella spp., Platyamoeba placida, Saccamoeba spp., Thecamoeba quadrilineata und Vexillifera spp. gefunden. Durch in situ Hybridisierung mit den neuen 18S rRNA-gerichteten Sonden HART498 und NAEG1088 konnten die Ergebnisse der morphologischen Bestimmung der Am{\"o}ben best{\"a}tigt werden. Auch die Am{\"o}ben zeigten keine Pr{\"a}ferenzen bez{\"u}glich der in den Standorten gemessenen Wasserparameter. Die in situ Hybridisierung mit rRNA-gerichteten Gensonden erlaubt eine Analyse der Struktur und Dynamik von Bioz{\"o}nosen, erm{\"o}glicht aber keine Aussage {\"u}ber die speziellen Aktivit{\"a}ten der nachgewiesenen Bakterien. Eine L{\"o}sung hierf{\"u}r k{\"o}nnte der spezifische in situ Nachweis von mRNA-Molek{\"u}len darstellen. Ein Problem hierbei stellt ihre, im Vergleich zu anderen Molek{\"u}len wie rRNA, sehr kurze Halbwertszeit und das Vorhandensein von nur wenigen Kopien pro Zelle dar. Daher ist im Anschluss an die in situ Hybridisierung in den meisten F{\"a}llen eine Signalamplifikation n{\"o}tig, um ein detektierbares Signal zu erhalten. In dieser Arbeit sollte die f{\"u}r das iap-Gen in Listeria monocytogenes entwickelte Methode zum Nachweis der mip-mRNA in L. pneumophila etabliert werden. Erste Anwendungen in Dot blot- und in situ Hybridisierungen mit mehrfach DIG-markierten Polyribonukleotidsonden bzw. mit simultan eingesetzten, einfach DIG-markierten Oligonukleotiden zeigten noch nicht die gew{\"u}nschte Spezifit{\"a}t. Diese Ergebnisse stellen jedoch eine wichtige Grundlage f{\"u}r zuk{\"u}nftige Experimente dar.},
  subject      = {Legionella pneumophila},
  language  = {de}
}
@article{HackerRdestWintermeyeretal.1991,
  author    = {Hacker, J{\"o}rg and Rdest, Ursula and Wintermeyer, E. and Ludwig, B.},
  title     = {Legiolysin, a New Hemolysin from L. pneumophila},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-73070},
  year      = {1991},
  abstract  = {Legionella pneumophila generares exotoxins, cytolysins, proteases oc hemolysins that darnage host cells llke erythrocytes or rissue cu lrure cells. The gene for a new L. pneumophila hemolysin withour a proteolytic activiry was idemified, cloned in E. coli and sequenced. The gene producr was analysed by SDS-Polyacrylamide-gel-electrophoresis.},
  subject      = {H{\"a}molysin},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Dietrich2000,
  author    = {Dietrich, Claudia},
  title     = {Molekularbiologische Studien zur Bedeutung der Flagelle f{\"u}r die Virulenz von Legionella pneumophila},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-1081},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2000},
  abstract  = {Legionella pneumophila, der Erreger der Legion{\"a}rskrankheit, ist ein fakultativ intrazellul{\"a}res, ubiquit{\"a}r vorkommendes Umweltbakterium. Die Rolle, die Flagelle und Motilit{\"a}t der Legionellen bei der Infektion von Protozoen oder humanen Zellen spielen k{\"o}nnen, ist bisher noch nicht gekl{\"a}rt. Um etwas {\"u}ber noch unbekannte Flagellengene und deren Organisation in Legionella zu erfahren, wurde mit Hilfe einer Cosmid-Genbank des Stammes L. pneumophila Philadelphia I die flaA-Region n{\"a}her charakterisiert. Im 5´-Bereich von flaA konnten auf dem Gegenstrang zwei Stoffwechselgene (accD und folC) identifiziert werden, im 3´-Bereich schliessen sich die Flagellengene flaG, fliD und fliS, sowie zwei offene Leseraster mit Homologien zu den erst k{\"u}rzlich bei Legionella beschriebenen Genen enhA und milA an. Zur Untersuchung des Einflusses der Flagelle auf den Infektionsverlauf wurde die flaA-negative Mutante KH3, bei der das flaA-Gen durch Insertion einer Kanamycin-Kassette unterbrochen worden war, wieder komplementiert. Dies gelang durch Reintegration des intakten flaA-Gens mit Hilfe des „Suicide"-Vektors pMSS704 in das Chromosom von KH3, wodurch Stamm CD10 entstand. Durch Westernblot-Analyse konnte gezeigt werden, dass der Stamm wieder in der Lage war, Flagellin zu exprimieren. Elektronenmikroskopische Aufnahmen best{\"a}tigten außerdem das Vorhandensein intakter Flagellen. Das Verhalten von flagellierten und nicht flagellierten Legionellen bei der Infektion von Wirtszellen wurde hinsichtlich Auffinden, Adh{\"a}renz, Invasion, intrazellul{\"a}rer Vermehrung und Lyse der Zellen untersucht. Als Wirtszellen wurden sowohl Protozoen (Acanthamoeba castellanii), als auch humane Zellen (HL-60 Zellen und frisch isolierte Blutmonozyten) verwendet. Dabei wurde deutlich, dass die Flagelle f{\"u}r das Erreichen der Wirtszellen eine wichtige Funktion hat. Wurde der Motilit{\"a}tsdefekt der flaA-Mutanten durch Zentrifugation auf die Zielzellen aufgehoben, so konnten mit den gew{\"a}hlten Versuchsbedingungen bez{\"u}glich des Adh{\"a}renzverm{\"o}gens der St{\"a}mme keine Unterschiede detektiert werden. Es wurde jedoch eine signifikante Reduktion der Invasionseffizienz f{\"u}r die nicht flagellierten Legionellen beobachtet. Diese war bei den humanen Zellen besonders ausgepr{\"a}gt. Hinsichtlich der intrazellul{\"a}ren Vermehrung konnte keine Attenuierung der Mutante festgestellt werden. Allerdings f{\"u}hrte vermutlich die Reduktion der Invasivit{\"a}t zu einer geringeren Ausbreitungsgeschwindigkeit im HL-60 Modell, die bei niedriger Infektionsdosis mit einer verlangsamten Wachstumsrate der Bakterien einherging. Durch Sequenzierung des Genbank-Cosmids 12/44, auf welchem die Gene fliA und motA lokalisiert waren, konnten im „upstream"-Bereich von fliA zwei putative Flagellenregulatorgene identifiziert werden (motR und flhF). Im 3´-Bereich von motA schließt sich, um 26 bp {\"u}berlappend, das Gen motB an, welches f{\"u}r den Motor der Flagelle eine Rolle spielt, gefolgt von einem Leseraster unbekannter Funktion und einem ORF mit Homologien zu prfB. Durch Insertion einer Kanamycin-Kassette in das motA-Gen von L. pneumophila Corby konnte in dieser Arbeit eine motA-negative Mutante hergestellt werden. Westernblot-Analyse und elektronenmikroskopische Untersuchungen best{\"a}tigten, dass es weiterhin zur Expression und zur Polymerisation des Flagellins kommt. Lichtmikroskopisch war jedoch zu beobachten, dass die hergestellte Mutante im Gegensatz zum Wildtyp durch den fehlerhaften Flagellenmotor nicht mehr in der Lage ist, gerichtete Strecken zu schwimmen. Untersuchungen mit den Wirtszellen A. castellanii und humanen HL-60 Zellen belegten, wie schon bei der flaA-Mutante, eine Beteiligung der Motilit{\"a}t an Vorg{\"a}ngen wie Auffinden der Zielzelle und deren Invasion, wohingegen die Adh{\"a}renz und die intrazellul{\"a}re Vermehrung nicht beeintr{\"a}chtigt waren. Eine Southernblot-Analyse des erst k{\"u}rzlich beschriebenen Transkriptionsregulators FlaR ergab, dass es sich hierbei vermutlich um einen L. pneumophila-spezifischen Regulationsfaktor handelt, welcher in Kombination mit dem „upstream" auf dem Gegenstrang liegenden ORF234 vorkommt. Fusionen der Promotorbereiche mit dem Reportergen gfp zeigten, dass beide Gene auch in Legionella aktiv sind und temperaturabh{\"a}ngig reguliert werden.},
  subject      = {Legionella pneumophila},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Fluegel1999,
  author    = {Fl{\"u}gel, Manfred},
  title     = {Molekularbiologische Studien zur Pathogenit{\"a}t und {\"O}kologie von Legionella pneumophila},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-1178},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {1999},
  abstract  = {Legionella pneumophila, der Erreger der Legion{\"a}rskrankheit, ist ein Umweltkeim mit Verbreitung in aquatischen Habitaten. Die Keime sind in der Lage, sich intrazellul{\"a}r in eukaryontischen Zellen, wie Makrophagen, Monozyten und Protozoen zu vermehren. Die erfolgreiche Besiedlung {\"o}kologischer Nischen, aber auch das Virulenzpotential des Keimes k{\"o}nnen dabei von Umweltfaktoren abh{\"a}ngen. Die Erforschung {\"o}kologischer Zusammenh{\"a}nge kann daher f{\"u}r das Verst{\"a}ndnis der bakteriellen Virulenz von großer Bedeutung sein. Ausgangspunkt dieser Arbeit ist die in der sp{\"a}ten station{\"a}ren Phase des Bakterienwachstums von L. pneumophila zu beobachtende intensive Pigmentierung des Kulturmediums. F{\"u}r diesen Ph{\"a}notyp ist das Legiolysin (Lly) verantwortlich. Es ist eines der wenigen bekannten Genprodukte von L. pneumophila, die einen Einfluß auf das {\"U}berleben des Keimes in der Umwelt haben. Legiolysin kann daher als Fitnessfaktor bezeichnet werden. Um die {\"o}kologischen Zusammenh{\"a}nge der Pigmentgenerierung n{\"a}her zu untersuchen, wurde das lly-positive Plasmid pEWL 1 subkloniert und sequenziert. Neben lly konnten in diesem Genabschnitt durch Sequenzvergleiche der abgeleiteten Aminos{\"a}uresequenzen sechs weitere Leseraster detektiert werden. Die drei unmittelbar benachbarten Gene von lly kodieren dabei f{\"u}r Proteine mit Funktionalit{\"a}t in Bezug zur lly-Determinante, w{\"a}hrend die drei upstream von lly liegenden Leseraster Homologien zu Proteinen aufweisen, die an Transportprozessen beteiligt sind. Die L{\"a}nge des RNA-Transkripts von lly konnte im Northern-Blot mit ungef{\"a}hr 1,8 kb bestimmt werden und l{\"a}ßt damit auf die gemeinsame Transkription des lly-Gens mit dem unmittelbar upstream liegenden Leseraster schließen. Durch Sequenzanalysen konnte aufgezeigt werden, daß das f{\"u}r diesen Ph{\"a}notyp verantwortliche Legiolysin-Gen f{\"u}r eine p-Hydroxyphenylpyruvat-Dioxygenase (HPPD) kodiert. Dieses Enzym katalysiert die Umsetzung von p-Hydroxyphenylpyruvat zu Homogentisat (HGA). In Zusammenarbeit mit Prof. P. Proksch (Pharmazeutische Biologie, W{\"u}rzburg) konnte im Vergleich zu lly-negativen L. pneumophila- und rekombinanten E. coli-St{\"a}mmen in den Kultur{\"u}berst{\"a}nden von lly-positiven St{\"a}mmen auf Basis einer Hochdruck-Fl{\"u}ssigkeits-Chromatographie (HPLC) HGA nachgewiesen werden. Es konnte somit gezeigt werden, daß das Legiolysin-Gen f{\"u}r ein Protein mit HPPD- Aktivit{\"a}t kodiert, und in die Degradation der aromatischen Aminos{\"a}uren Phenylalanin und Tyrosin involviert ist. Des weiteren wurden chromosomale Integrationsmutationen der aus L. pneumophila stammenden Gene lly und mip ("macrophage infectivity potentiator") in E. coli K-12 St{\"a}mmen erstellt. Diese wurden nachfolgend in {\"o}kologisch ausgerichteten Langzeitstudien eingesetzt. Die chromosomale Integration von lly erfolgte als ortsspezifische Rekombination in die l att - site von E. coli WM 2269. Die Integration von mip erfolgte in die fim-Region des E. coli K-12-Stammes AAEC 160. Der zweite Teil der vorliegenden Arbeit befaßt sich mit {\"o}kologischen Studien zur Persistenz von L. pneumophila in der Umwelt. Durch die Bestrahlung mit Licht {\"u}ber einen Verlauf von sieben Tagen konnte gezeigt werden, daß die Exprimierung von lly zu einer Persistenz unter Lichtstreß f{\"u}hrt. Dieser Lichtschutz k{\"o}nnte in der Umwelt, aber auch bei der Sanierung von Wasserleitungssystemen mittels UV-Licht Relevanz aufweisen. Die Assoziation von L. pneumophila JR32 und JR32-1 (lly-negativ) mit dem Cyanobakterium Fischerella wurde in Mikrokosmen {\"u}ber einen Verlauf von sieben Tagen beobachtet. Dabei konnte gezeigt werden, daß Legionella in Assoziation mit Fischerella bzw. in dessen {\"U}berstand zu persistieren vermag, w{\"a}hrend dies den Bakterien in frischem Fischerella-Medium nicht m{\"o}glich war. Wie die Coinkubation der Fischerellen mit L. pneumophila JR32-1 zeigte, spielt die Expression von lly dabei keine Rolle. Ein Wachstum der Bakterienkulturen konnte weder im Fischerella-{\"U}berstand, noch in Fischerella-Medium beobachtet werden. Durch Rasterelektronenmikroskopie konnte der adh{\"a}sive Charakter der Assoziation von L. pneumophila zu Fischerella dokumentiert werden. Durch Persistenzstudien von L. pneumophila und E. coli in Boden wurde die {\"U}berlebensf{\"a}higkeit der Mikroorganismen in suboptimaler Umgebung getestet. F{\"u}r Legionella ist eine rapide Abnahme der Zellzahl schon nach kurzer Zeit zu detektieren. Nach sechs Tagen konnten keine Zellen mehr kultiviert werden. Die Defizienz der Pathogenit{\"a}ts- und Umweltfaktoren Mip, Fla (Flagellin) und Lly hatte dabei keinen Einfluß auf die Persistenz der Bakterien im Boden. Zudem sind die zuvor generierten rekombinanten E. coli-Klone AAEC 160-1 und WM 2269-1 mit genomischer mip- bzw. lly-Integration eingesetzt worden. Innerhalb von vier Wochen konnte f{\"u}r diese St{\"a}mme eine kontinuierliche Reduktion der Zellzahlen beobachtet werden. Somit erwies sich keiner der Organismen als erfolgreicher Besiedler der Bodenprobe. Die Studien zum Verlust der Kultivierbarkeit von L. pneumophila und E. coli erfolgten in autoklaviertem Leitungswasser bzw. PBS und zwei unterschiedlich behandelten Varianten von Mainwasser. Neben sterilfiltriertem Mainwasser fand die Inokulierung der Organismen auch in einem Ansatz mit autoklaviertem Mainwasser statt. Es konnte gezeigt werden, daß L. pneumophila in Leitungswasser und Mainwasser außerordentlich gut zu persistieren vermochte. Zudem konnte dokumentiert werden, daß auch E. coli DH5a in ein lebensf{\"a}higes, aber nicht mehr kultivierbares Ruhestadium (viable but nonculturable, VBNC) eintreten kann. Parallel zur Ermittlung der CFU-Werte wurden w{\"a}hrend des Verlaufs der Experimente die Lebendzellzahlen durch Fluoreszenzf{\"a}rbungen bestimmt. Der {\"U}bergang von L. pneumophila in das VBNC-Ruhestadium wurde zudem durch in situ - Hybridisierungen mit fluoreszenzmarkierten 16 S rRNA-Oligonukleotidsonden dokumentiert. Im Naturhaushalt spielt dieser {\"U}bergang zu VBNC-Stadien bei Umweltbakterien zur {\"U}berwindung ung{\"u}nstiger Phasen eine große Rolle. Schließlich erfolgten Experimente zur Reaktivierung der VBNC-Ruhestadien. Diese Reaktivierung ist abh{\"a}ngig von speziesspezifischen Triggern und kann bei L. pneumophila durch Coinkubation mit Acanthamoeba castellanii erfolgen.},
  subject      = {Legionella pneumophila},
  language  = {de}
}
@phdthesis{AlbertWeissenberger2009,
  author    = {Albert-Weißenberger, Christiane},
  title     = {Regulation of the Flagellar Biogenesis in Legionella pneumophila},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-34335},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2009},
  abstract  = {The bacterial pathogen Legionella pneumophila replicates intracellularly in protozoa, but can also cause severe pneumonia, called Legionnaires' disease. The bacteria invade and proliferate in the alveolar macrophages of the human lung. L. pneumophila bacteria exhibit a biphasic life cycle: replicative bacteria are avirulent; in contrast, transmissive bacteria express virulence traits and flagella. Primarily aim of this thesis was to evaluate the impact of the regulatory proteins FleQ, FleR, and RpoN in flagellar gene regulation. Phenotypic analysis, Western blot and electron microscopy of regulatory mutants in the genes coding for FleQ, RpoN and FleR demonstrated that flagellin expression is strongly repressed and that these mutants are non-flagellated in transmissive phase. Transcriptomic studies of these putative flagellar gene expression regulators demonstrated that fleQ controls the expression of numerous flagellar biosynthetic genes. Together with RpoN, FleQ controls transcription of 14 out of 31 flagellar class II genes, coding for the basal body, hook, and regulatory proteins. Unexpectedly, 7 out of 15 late flagellar genes class III and IV) are expressed dependent on FleQ but independent of RpoN. Thus, in contrast to the commonly accepted view that enhancer binding proteins as FleQ always interact with RpoN to initiate transcription, our results strongly indicate that FleQ of L. pneumophila regulates gene expression RpoN-dependent as well as RpoN-independent. Moreover, transcriptome analysis of a fleR mutant strain elucidated that FleR does not regulate the flagellar class III genes as previously suggested. Instead FleR regulates together with RpoN numerous protein biosynthesis and metabolic genes. Based on these experimental results our modified model for the transcriptional regulation of flagellar genes in L. pneumophila is that flagellar class II genes are controlled by FleQ and RpoN, while flagellar class III and IV genes are controlled in a fleQ-dependent but rpoN-independent manner. Although all L. pneumophila strains share the same complex life style, various pathotypes have evolved. This is reflected by the genomes, which contain e.g. genomic islands. The genomic island Trb-1 of L. pneumophila Corby, carries all genes necessary for a type-IV conjugation system, an integrase gene and a putative oriT site. The second aim of this thesis was to investigate the implication of this genomic island in conjugative DNA transfer. Using conjugation assays we showed that the oriT site located on Trb-1 is functional and contributes to conjugation between different L. pneumophila strains. As this is the first oriT site of L. pneumophila known to be functional our results provide evidence that conjugation is a major mechanism for the evolution of new pathotypes in L. pneumophila.},
  subject      = {Legionella pneumophila},
  language  = {en}
}