@phdthesis{Demir2010,
  author    = {Demir, Fatih},
  title     = {Lipid rafts in Arabidopsis thaliana leaves},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-53223},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2010},
  abstract  = {Arabidopsis thaliana (A.th.) mesophyll cells play a pivotal role in the regulation of the drought stress response. The signaling \& transport components involved in drought stress regulation within lipid rafts of the plasma membrane were investigated by DRM isolation from highly purified plasma membranes. Detergent treatment with Brij-98 and Triton X-100 resulted in a total of 246 DRM proteins which were identified by nano HPLC-MS/MS. The majority of these proteins could be isolated by Triton X-100 treatment (78.5 \%) which remains the "golden" standard for the isolation of DRMs. Comparing in-gel and in-solution digestion approaches disclosed additional protein identifications for each method but the in-gel approach clearly delivered the majority of the identified proteins (81.8 \%). Functionally, a clear bias on signaling proteins was visible - almost 1/3 of the detected DRM proteins belonged to the group of kinases, phosphatases and other signaling proteins. Especially leucine-rich repeat receptor-like protein kinases and calcium-dependent protein kinases were present in Brij-98 \& Triton X-100 DRMs, for instance the calcium-dependent protein kinase CPK21. Another prominent member of DRMs was the protein phosphatase 2C 56, ABI1, which is a key regulator of the ABA-mediated drought stress response in A.th. The lipid raft localization of the identified DRM proteins was confirmed by sterol-depletion with the chemical drug MCD. Proteins which depend upon a sterol-rich environment are depleted from DRMs by MCD application. Especially signaling proteins exhibited a strong sterol-dependency. They represented the vast majority (41.5 \%) among the Triton X-100 DRM proteins which were no longer detected following MCD treatment. AtRem 1.2 \& 1.3 could be shown to be sterol-dependent in mesophyll cells as well as two CPKs (CPK10 \& CPK21) and the protein phosphatase ABI1. AtRem 1.2 \& 1.3 could be proven to represent ideal plant lipid raft marker proteins due to their strong presence in Triton X-100 DRMs and dependency upon a sterol-rich environment. When fluorescence labeled AtRem 1.2 \& 1.3 were transiently expressed in A.th. leaves, they localized to small, patchy structures at the plasma membrane. CPK21 was an intrinsic member of Triton X-100 DRMs and displayed extreme susceptibility to sterol-depletion by MCD in immunological and proteomic assays. Calcium-dependent protein kinases (CPKs) have already been studied to be involved in drought stress regulation, for instance at the regulation of S-type anion channels in guard cells. Hence, further transient expression studies with the anion channel SLAH3, protein kinase CPK21 and its counterpart, protein phosphatase ABI1 were performed in Nicotiana benthamiana. Transient co-expression of CPK21 and the anion channel SLAH3, a highly mesophyll- specific homologue of the guard cell anion channel SLAC1, resulted in a combined, sterol-dependent localization of both proteins in DRMs. Supplementary co-expression of the counterpart protein phosphatase ABI1 induced dislocation of SLAH3 from DRMs, probably by inactivation of the protein kinase CPK21. CPK21 is known to regulate the anion channel SLAH3 by phosphorylation. ABI1 dephosphorylates CPK21 thus leading to deactivation and dislocation of SLAH3 from DRMs. All this regulative events are taking place in DRMs of A.th. mesophyll cells. This study presents the first evidence for a lipid raft-resident protein complex combining signaling and transport functions in A.th. Future perspectives for lipid raft research might target investigations on the lipid raft localization of candidate DRM proteins under presence of abiotic and biotic stress factors. For instance, which alterations in the DRM protein composition are detectable upon exogenous application of the plant hormone ABA? Quantitative proteomics approaches will surely increase our knowledge of the post-transcriptional regulation of gene activity under drought stress conditions.},
  subject      = {Ackerschmalwand},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Stange2010,
  author    = {Stange, Annette},
  title     = {Beziehung zwischen Ca2+-Hom{\"o}ostase und Aktivit{\"a}t der S-Typ Anionenkan{\"a}le in Schließzellen},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-52131},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2010},
  abstract  = {Pflanzen regulieren ihren Gasaustausch mit der Atmosph{\"a}re, indem sie die {\"O}ffnungsweite von Poren in der Epidermis von Bl{\"a}ttern, sog. Stomata, ver{\"a}ndern. Bei Wassermangel werden die stomat{\"a}ren Poren geschlossen, um den Verlust von Wasser zu minimieren. Dieser Vorgang wird durch das Phytohormon ABA ausgel{\"o}st, welches eine Aktivierung von Anionenkan{\"a}len in der Plasmamembran der Schließzellen induziert. Obwohl die Aktivierung der Anionenkan{\"a}le ein zentrales Element in der ABA-Antwort darstellt, ist der Signalweg, der zu der Aktivierung der Anionenkan{\"a}le f{\"u}hrt, nur l{\"u}ckenhaft verstanden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Rolle von Signalintermediaten wie Proteinkinasen, -phosphatasen, Lipid-abgeleiteten Botenstoffen und Ca2+ bei der Aktivierung der Anionenkan{\"a}le untersucht. Hinsichtlich Ca2+ lag ein spezieller Fokus auf der Generierung von Ca2+-Signalen und auf der Frage, inwieweit ein Anstieg in der cytosolischen freien Ca2+-Konzentration f{\"u}r eine Aktivierung der Anionenkan{\"a}le ausreicht. F{\"u}r diese Studien wurde haupts{\"a}chlich die Zwei-Elektroden-Spannungsklemm- (DEVC) Technik in Kombination mit Ca2+-Konzentrationsmessungen durch den Ca2+-sensitiven Farbstoff FURA-2 angewendet. Die M{\"o}glichkeit Anionenkan{\"a}le durch Ca2+ zu aktivieren wurde getestet, indem Ca2+-Signale in intakten Schließzellen von Nicotiana tabacum durch hyper- und depolarisierte Spannungen ausgel{\"o}st wurden und gleichzeitig die Str{\"o}me, die {\"u}ber die Plasmamembran flossen, gemessen wurden. Dabei f{\"u}hrte eine Hyperpolarisation zu einer transienten Erh{\"o}hung der cytosolischen freien Ca2+-Konzentration w{\"a}hrend des Spannungssprunges, wohingegen eine Depolarisation zun{\"a}chst eine Erniedrigung der cytosolischen freien Ca2+-Konzentration ausl{\"o}ste und das Ca2+-Signal bei Repolarisation der Plasmamembran auftrat. Dies weist darauf hin, dass in beiden F{\"a}llen hyperpolarisations-aktivierte Ca2+-Kan{\"a}le beteiligt sind, wobei das Schwellenpotential der Schließzellen, bei dem ein Ca2+-Signal ausgel{\"o}st wird, nach einer langen Depolarisation zu positiveren Spannungen verschoben ist. Die Modulation der Spannungssensitivit{\"a}t der Schließzellen w{\"a}hrend einer langen Depolarisation findet m{\"o}glicherweise durch eine Aktivierung der Ca2+-Kan{\"a}le und/oder eine Inhibierung verschiedener Ca2+-Transportproteine durch eine niedrige cytosolische freie Ca2+-Konzentration statt. Der durch Hyperpolarisation bzw. durch lange Depolarisation induzierte transiente Anstieg in der cytosolischen freien Ca2+-Konzentration korrelierte mit einer transienten Aktivierung von S-Typ Anionenkan{\"a}len. Die Analyse der Ca2+-Konzentrations- und Zeitabh{\"a}ngigkeit ergab, dass die S-Typ Anionenkan{\"a}le durch Ca2+ in einem schnellen Signalweg mit einer halbmaximalen cytosolischen freien Ca2+-Konzentration von 515 nM (SE=235, n=33) aktiviert werden. Der durchschnittliche maximale S-Typ Anionenstrom lag bei -349 pA (SE=107, n=33) bei einer Spannung von -100 mV. Die Wirkung von Ca2+ auf Transportvorg{\"a}nge {\"u}ber die Plasmamembran wurde auch in Dr{\"u}senzellen von Dionaea muscipula untersucht. In diesem Zelltyp induzierte eine mechanische Stimulierung der Triggerhaare ein Ca2+-Signal, wobei mehr als zwei Aktionspotentiale n{\"o}tig waren, um einen transienten Ca2+-Anstieg auszul{\"o}sen. Diese Daten zeigen, dass die Depolarisationsphase des Aktionspotentials in den Dr{\"u}sen nicht direkt mit Ca2+-Fl{\"u}ssen assoziiert ist. Anstelle einer Ca2+-abh{\"a}ngigen Aktivierung scheinen Anionenkan{\"a}le in Dr{\"u}sen von Dionaea muscipula also in einem Ca2+-unabh{\"a}ngigen Signalweg aktiviert zu werden. Diesen Aktivierungsmechanismus gibt es auch im ABA-Signalweg in Schließzellen. Dort findet eine Ca2+-unabh{\"a}ngige Aktivierung der S-Typ Anionenkan{\"a}le durch Proteinkinasen wie OST1 und CPK23 statt, wobei die Proteinphosphatase ABI1 als negativer Regulator diskutiert wird. In dieser Arbeit konnte die Redundanz von OST1 und CPK23 sowie Komponenten des Ca2+-abh{\"a}ngigen Weges in DEVC-Experimenten mit ost1-2- und cpk23-Mutanten von Arabidopsis thaliana beobachtet werden, die beide S-Typ Anionenkanalaktivit{\"a}t zeigten. Die Aktivit{\"a}t von S-Typ Anionenkan{\"a}len in Arabidopsis thaliana Mutanten, denen der S-Typ Anionenkanal SLAC1 fehlt, deutet außerdem an, dass redundante S-Typ Anionenkan{\"a}le vorhanden sind, die auch durch andere Proteinkinasen aktiviert werden k{\"o}nnten. ABA-induzierte S-Typ Anionenstr{\"o}me waren auch in abi1-Transformanten von Nicotiana tabacum messbar, wobei eine geringere Sensitivit{\"a}t gegen{\"u}ber ABA als im Wildtyp auftrat, was auf eine unvollst{\"a}ndige Inhibierung des ABA-Signalweges hindeutet. Die Redundanz der Intermediate im ABA-Signalweg war auch in Studien mit dem Lipid-abgeleiteten Botenstoff Phosphatids{\"a}ure sichtbar, der nur einen langsamen und unvollst{\"a}ndigen Stomaschluss induzierte, was allerdings auch auf eine untergeordnete Rolle von Phosphatids{\"a}ure im ABA-Signalweg hinweisen k{\"o}nnte.},
  subject      = {Schließzelle},
  language  = {de}
}