@phdthesis{Schatz2010, author = {Schatz, Nicole}, title = {Identifizierung und Charakterisierung des BARB-4 Antigens}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-53631}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2010}, abstract = {Der humane, monoklonale IgG Antik{\"o}rper BARB-4 konnte mit Hilfe der Hybridomatechnologie aus einem an Magenkarzinom erkrankten Patienten isoliert werden. BARB-4 stellt aufgrund seiner Keimbahnkodierung einen Bestandteil der innaten Immunit{\"a}t dar und ist eines der wenigen tumorspezifischen IgG Immunglobuline, die diesem Teil des Immunsystems zugeordnet werden k{\"o}nnen. Innerhalb dieser Arbeit konnte die Zielstruktur des Antik{\"o}rpers identifiziert und n{\"a}her charakterisiert werden. Das BARB-4 Antigen wurde hierbei {\"u}ber ein affinit{\"a}tschromatographisches Verfahren aus Tumorzellmembranextrakten aufgereinigt und anschließend mittels MALDI-MS {\"u}ber die Peptidmassen-Fingerprint Methode analysiert. Das dabei isolierte Protein konnte eindeutig als humanes TAF15 identifiziert werden. Diese auf der Zellmembran von Tumoren exprimierte TAF15 Variante besitzt ein Molekulargewicht von etwa 78 kDa. Sie kommt im Gegensatz zum Wildtyp exklusiv in Tumorzellen vor und konnte nicht in Normalgewebe nachgewiesen werden. Immunhistochemische Untersuchungen mit BARB-4 und Anti-TAF15 Antik{\"o}rper auf Tumor- und Normalgewebe deuteten dabei auf eine Koexistenz von Wildtyp und tumorspezifischer TAF15-Variante in malignem Gewebe hin und legten somit eine tumorspezifische Modifikation des TAF15BARB-4 nahe. Ein Carbohydrat-Epitop, wie es sehr h{\"a}ufig bei den nat{\"u}rlichen IgM Antik{\"o}rpern vorkommt, konnte hier jedoch ausgeschlossen werden. In funktionellen Analysen konnte gezeigt werden, dass die Bindung des BARB-4 Antik{\"o}rpers auf Tumorzellen einen Einfluss auf diverse zellul{\"a}re Prozesse aus{\"u}bt. Durch die Bindung hemmte der Antik{\"o}rper das Zellwachstum von Tumorzellen und induzierte deren Apoptose. Weitere interessante Eigenschaften des BARB-4, die bei Tumorzellen beobachtet werden konnten, sind vor allem f{\"u}r metastasierende Zellen von Bedeutung. Nach erfolgter Antik{\"o}rperinkubation konnte bei Tumorzellen eine Inhibierung der Zelladh{\"a}sion und der Zellbeweglichkeit nachgewiesen werden. Diese beiden zellul{\"a}ren Prozesse sind wichtig f{\"u}r sich im K{\"o}rper ausbreitende, maligne Zellen. In allen durchgef{\"u}hrten Analysen handelte es sich um vom Antik{\"o}rper direkt vermittelte Effekte. Weitere Untersuchungen wurden durchgef{\"u}hrt, um das Bindungsverhalten des Antik{\"o}rpers genauer charakterisieren zu k{\"o}nnen. Immunfluoreszenzanalysen zeigten dabei, dass der Antik{\"o}rper BARB-4 nach der Bindung an die Tumorzellmembran internalisiert wird. Die Erforschung des BARB-4 Antik{\"o}rpers und seiner Zielstruktur TAF15BARB-4 auf Krebszellen erm{\"o}glicht sowohl neue Einblicke in die Funktionsweise der innaten Immunit{\"a}t als auch neue Optionen f{\"u}r die zielgerichtete Tumortherapie. Die Identifizierung einer extrazellul{\"a}ren, tumorspezifischen TAF15 Variante bietet eine neue M{\"o}glichkeit f{\"u}r Diagnostik- und Therapieans{\"a}tze. Durch die exklusive Expression auf Tumorzellen erm{\"o}glicht diese TAF15-Variante gezielt maligne Zellen zu attackieren ohne dabei gesunde Zellen zu beeinflussen. Durch das Vorkommen des TAF15BARB-4 in den verschiedensten Tumorentit{\"a}ten k{\"o}nnte diese Zielstruktur f{\"u}r die Therapie vieler unterschiedlicher, maligner Erkrankungen genutzt werden. Aufgrund seiner funktionellen Eigenschaften, wie der Hemmung der Tumorzellmotilit{\"a}t und Tumorzelladh{\"a}sion, k{\"o}nnte der BARB-4 Antik{\"o}rper besonders f{\"u}r die Pr{\"a}vention einer Metastasierung von Bedeutung sein.}, subject = {Antigen}, language = {de} } @phdthesis{Raab2010, author = {Raab, Viktoria Maria}, title = {Histologische Charakterisierung Vaccinia-Virus infizierter humaner Tumore im Mausmodell}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-49024}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2010}, abstract = {Onkolytische Viren spielen eine immer bedeutendere Rolle f{\"u}r die Tumorforschung, weil in zahlreichen pr{\"a}klinischen Studien gezeigt werden konnte, dass viral bedingte Onkolyse zu einer Tumorregression f{\"u}hrt. Ein {\"a}ußerst vielversprechender Kandidat der onkolytischen Viren ist das Vaccinia-Virus. In der vorliegenden Arbeit wurde mit dem attenuierten Vaccinia-Virus GLV-1h68 gearbeitet, welches nach systemischer Applikation eine Regression von Tumoren verursacht. Obwohl bereits zahlreiche onkolytische Viren in klinischen Studien Anwendung finden, sind zugrunde liegende Abl{\"a}ufe bei einer Virusinfektion solider Tumore sowie Mechanismen, welche f{\"u}r die Tumorregression verantwortlich sind, immer noch nicht erschlossen. Um Aufschluss {\"u}ber notwendige Parameter f{\"u}r eine effiziente Infektion eines soliden Tumors mit GLV-1h68 zu erlangen, wurden im ersten Teil dieser Arbeit die uninfizierte Tumormikroumgebung sowie stromale Ver{\"a}nderungen in der fr{\"u}he Phase der Infektion untersucht. Als Tumormodell diente hierbei ein humanes autologes Melanomzellpaar (888-MEL und 1936-MEL). Diese beiden Zelllinien sind Teil einer Reihe von f{\"u}nf verschiedenen Melanomzelllinien, welche alle aus den widerkehrenden Metastasen eines einzelnen Patienten (Patient 888) isoliert wurden. 888-MEL zeigt nach Virusinfektion mit GLV-1h68 ein regredierendes Verhalten (therapeutischer Index: 88,0) und ist somit respondierend nach GLV-1h68-Infektion. 1936-MEL hingegen zeigte mit einem therapeutischen Index von 13,7 ein nur schwach verlangsamtes Wachstum solider Tumore, und ist somit schwach-respondierend nach GLV-1h68-Infektion. Als ein Grund, weshalb diese beiden autologen Melanomzelllinien unterschiedlich auf GLV-1h68-Infektion reagieren, wurde die Anzahl der Viruspartikel vermutet, welche 1 dpi im soliden Tumor vorliegt. Eine m{\"o}gliche Korrelation zwischen initialem viralen Titer 1 dpi und sp{\"a}terer Tumorregression konnte experimentell aber nicht nachgewiesen werden. Zwei voneinander unabh{\"a}ngige Experimentreihen zeigten, dass bei identischer systemischer Applikation in den beiden soliden Tumoren kein Unterschied des viralen Titers vorlag. Weiterhin wurden die Komponenten der Tumormikroumgebung und ihr m{\"o}glicher Einfluss auf die Effizienz der Virusinfektion untersucht. Immunhistologische Studien zeigten, dass es im uninfizierten Zustand bei soliden 888-MEL Tumoren zu einer massiven Infiltration CD45-positiver Zellen kam, die bei 1936-MEL-Tumoren jedoch nicht zu finden war. Die Beobachtung steht in {\"U}bereinstimmung mit Ergebnissen einer vergleichenden Microarray-Analyse, die das Infiltrat CD45-positiver Zellen in 888-MEL Tumoren genauer charakterisierte. Es wurde mit Microarray-Analyse eine erh{\"o}hte Expression chemotaktischer Molek{\"u}le in soliden 888-MEL Tumoren nachgewiesen. Unter anderem wird CCL8 (MCP-2) erh{\"o}ht exprimiert. Als chemotaktisches Molek{\"u}l hat CCL8 eine erh{\"o}hte Monozyteninfiltration zur Folge. Weiterhin wurde eine erh{\"o}hte Expression von MIF (macrophage migration inhibitory factor) und dem entsprechendem Rezeptor CD74 in uninfizierten 888-MEL-Tumoren gemessen. MIF induziert als proinflammatorisches Zytokin die Synthese inflammatorischer Mediatoren. Dies erkl{\"a}rt die Anh{\"a}ufung CD45-positiver Zellen in der Tumormikroumgebung. Durch eine erh{\"o}hte Expression MHC II-verwandter Gene in soliden 888-MEL- Tumoren wurden die CD45-positiven Zellen als Monozyten identifiziert. Um die Funktion der Immunzellen zu analysieren, wurde durch eine intraperitoneale Applikation des Zytostatikums Cyclophosphamid eine Monozytendepletion induziert. Diese Immundepletion resultierte in soliden 888-MEL- Tumoren in einer signifikant verringerten Virusreplikation und -Ausbreitung nach Infektion mit GLV-1h68. Diese Ergebnisse implizieren, dass durch eine erh{\"o}hte Infiltration CD45-positiver Zellen in die Tumormikroumgebung die GLV-1h68-Infektion und -Replikation erleichtert wird. Nach Ausbreitung der Infektion kommt es in respondierenden Tumoren nach einem ersten Wachtumsarrest zu einer Tumorregression. Um Aufschluss {\"u}ber den beteiligten Mechanismus bei der Tumorregression zu erlangen, wurden GLV-1h68-infizierte-Tumore in der sp{\"a}ten Phase der Infektion untersucht. Drei m{\"o}gliche Mechanismen viral verursachter Onkolyse wurden beschrieben: Tumorzell-spezifische Onkolyse, Zerst{\"o}rung der Tumorvaskulatur oder anti-tumorale Immunantwort. F{\"u}r diese Experimente wurden humane Brustkarzinomzellen als Tumormodell verwendet. Mit diesem Tumormodell sollte analysiert werden, welcher der drei bislang diskutierten Mechanismen bei einer GLV-1h68-Infektion vorlag. Als erstes zeigten histologische Studien, dass Virusinfektion und -Replikation zu ausgedehnten Tumornekrosen f{\"u}hren. Dabei blieben die Blutgef{\"a}ße in uninfizierten und auch in infizierten Bereichen des Tumors intakt und funktionell aktiv. Systemische Perfusion der Vaskulatur mit Lektin zeigte, dass die Tumorvaskulatur an das periphere Blutgef{\"a}ßsystem angeschlossen war. Nachfolgende Experimente zeigten, dass Endothelzellen nicht durch die Viren infiziert wurden, wohingegen aber Endothelzell-ummantelnde, Gef{\"a}ß-stabilisierende Perizyten nur in uninfizierten, nicht aber in infizierten Bereichen des Tumors vorkamen. Perizyten wurden m{\"o}glicherweise durch Virusinfektion lysiert. Morphologische und funktionelle Analyse der Blutgef{\"a}ße im Tumor zeigte, dass GLV-1h68-Infektion Hyperpermeabilit{\"a}t, Vasodilatation und eine erh{\"o}hte Expression des Adh{\"a}sionsmolek{\"u}ls CD31 verursachte. Eine erh{\"o}hte CD31-Expression erleichtert eine Infiltration rekrutierter Immunzellen. Das konnte durch immunhistochemische F{\"a}rbung von CD45 und MHC II besonders in intratumoralen Bereichen gezeigt werden. Durch Cyclophosphamid-vermittelte Immunsuppression wurde nachgewiesen, dass diese rekrutierten Immunzellen keinen ausschlaggebenden Einfluss auf die Tumorregression haben. Nach Immundepletion in soliden GI-101A-Tumoren konnte eine verst{\"a}rkte Virusinfektion, effektivere Onkolyse und fr{\"u}hzeitigere Tumorregression nachgewiesen werden. Zusammenfassend zeigten diese Ergebnisse, dass der dominierende Mechanismus, welcher zur Tumorregression f{\"u}hrt, die Onkolyse ist.}, subject = {Vaccinia-Virus}, language = {de} } @phdthesis{Wilhelm2010, author = {Wilhelm, Daniela Elisabeth}, title = {Die Rolle von GSK3 im Rahmen der angeborenen Immunabwehr gegen Aspergillus fumigatus}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-71674}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2010}, abstract = {Aspergillus fumigatus ist ein ubiquit{\"a}r vorkommender Schimmelpilz, dessen Sporen vom Menschen t{\"a}glich zu hunderten mit der Atemluft aufgenommen werden. Aufgrund ihrer geringen Gr{\"o}ße gelangen die Konidien leicht bis in die Alveolen der Lunge, wo sie normalerweise sofort vom angeborenen Immunsystem beseitigt werden. Immunsupprimierte Menschen leiden an einer qualitativen oder quantitativen Einschr{\"a}nkung dieses Teiles der Immunabwehr, weshalb die Inokulation der Sporen bei ihnen zur Ausl{\"o}sung der lebensgef{\"a}hrlichen Invasiven Aspergillose f{\"u}hren kann, deren Mortalit{\"a}t in der Hochrisikogruppe der Patienten nach h{\"a}matopoetischer Stammzelltransplantation {\"u}ber 90\% betr{\"a}gt. Bei diesen Patienten gewinnt die adaptive Immunabwehr an Bedeutung. Dendritische Zellen geh{\"o}ren dem angeborenen Immunsystem an und besitzen einzigartige F{\"a}higkeiten zur Aktivierung und Steuerung der erworbenen Immunabwehr. Durch die Aktivierung naiver T-Zelen und die Sekretion bestimmter immunmodulatorischer Zytokine bestimmen sie die Art der konsekutiv asugel{\"o}sten T-Helferzellantwort. Lediglich eine T-Helfer 1-Zellantwort wird hierbei mit einer erh{\"o}hten Resistenz gegen{\"u}ber der invasiven Aspergillose in Verbindung gebracht. Die Zytokinsekretion der Dendritischen Zellen wird durch intrazellul{\"a}re Signalkaskaden reguliert, welche sich an ihre PRRs anschließen. F{\"u}r die Erkennung des bakteriellen LPS durch den TLR wurde die Regulation der immunmodulatorischen Zytokine durch die Serin-Threonin-Kinase GSK3 festgestellt. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob es bei der Erkennung von Aspergillus fumigatus durch humane dendritische Zellen ebenfalls einen Zusammenhang mit GSK3 und der Sekretion immunmodulatorischer Zytokine gibt. Daf{\"u}r wurden aus humanen Monozyten generierte dendritische Zellen mit rekombinanten Antigenen von Aspergillus fumigatus sowie verschiedenen Morphologien stiumuliert und teilweise mit dem GSK3-Inhibitor LiCl gehemmt. Anschließend wurde die Expression bestimmter immunmodulatorischer Zytokine und der GSK3 mittels quantitativer real-time RT-PCR bestimmt. Hierbei konnte f{\"u}r eines der getesteten Antigene, Aspf 1, ein deutlicher Einfluss auf die GSK3-Expression der Zellen festgestellt werden. Ein paralleler Anstieg der Expression proinflammatorischer Zytokine erh{\"a}rtete die Annahme einer immunregulierenden Rolle der GSK3 bei der Erkennung von Aspergillus fumigatus. Einen deutlicheren Hinweis auf den Zusammenhang zwischen der Aktivit{\"a}t der GSK3 und der Expression proinflammatorischer Zytokine erbrachte die Inhibierung mittels LiCl. Die mit Aspergillus fumigatus stimulierten Zellen reagierten hierauf im Vergleich zu den nicht-inhibierten Zellen mit einer Reduktion der IL12p35-Expression um 86,1\% sowie mit einer Reduktion der IL23-Expression um 49,5\%. Der letzte Teil der Experimente sollte ausgehend von der Vorstellung, dass verschiedene Aspergillus-Morphologien von unterschiedlichen Rezeptoren erkannt werden quantitative Unterschiede der GSK3-Beteiligung bei der Erkennung von Aspergillus fumigatus durch dendritische Zellen zeigen. Obwohl alle Morphologien des Schimmelpilzes einen Einfluss auf die GSK3-Expression der Zellen zeigten, konnten hierbei keine einheitlichen quantitativen Unterschiede festgestellt werden. Zusammengefasst konnte in der vorliegenden Arbeit die Beteiligung von GSK3 bei der Erkennung von Aspergillus fumigatus durch humane dendritische Zellen gezeigt werden. Außerdem konnten Hinweise auf eine immunregulierende Rolle der GSK3 bei der Abwehr des fakultativ pathogenen Schimmelpilzes erbracht werden, wobei die genaue Einbindung der Serin-Threonin-Kinase in dieser Situation noch unklar ist und weitere Experimente erforderlich macht.}, subject = {Aspergillus fumigatus}, language = {de} }