@phdthesis{Nikolaev2005,
  author    = {Nikolaev, Viacheslav},
  title     = {Development and application of fluorescent cAMP und cGMP biosensors},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-15673},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2005},
  abstract  = {The cyclic nucleotides cAMP and cGMP are two ubiquitous important second messengers, which regulate diverse physiological responses from vision and memory to blood pressure and thrombus formation. They act in cells via cAMP- and cGMP-dependent protein kinases (PKA and GK), cyclic nucleotide-gated channels and Epac. Although the concept of cyclic nucleotide signalling is well developed based on classical biochemical studies, these techniques have not allowed to analyze cAMP and cGMP in live cells with high temporal and spatial resolution. In the present study fluorescence resonance energy transfer was used to develop a technique for visualization of cAMP and cGMP in live cells and in vitro by means of fluorescent biosensors. Ligand-induced conformational change in a single nucleotide-binding domain flanked with green fluorescent protein mutants was used for dynamic, highly sensitive measurements of cAMP and cGMP. Such biosensors retained binding properties and chemical specificity of unmodified domains, allowing to image cyclic nucleotides in a physiologically relevant range of concentrations. To develop cAMP-sensors, binding domains of PKA, Epac and cAMP-gated HCN-channel were used. cGMP-sensors were based on single domains of GK and phosphodiesterases (PDEs). Sensors based on Epac were used to analyze spatio-temporal dynamics of cAMP in neurons and macrophages, demonstrating that cAMP-gradients travel with a high speed (~ 40 \&\#956;m/s) throughout the entire cytosol. To understand the mechanisms of cAMP-compartmentation, kinetics properties of phosphodi-esterase (PDE2) were, next, analyzed in aldosterone producing cells. PDE2 is able to rapidly hydrolyze extensive amounts of cAMP, so that the speed of cAMP-hydrolysis is much faster than that of its synthesis, which might serve as a basis of compartmentation. cAMP-sensors were also used to develop a clinically relevant diagnostic method for reliable detection of \&\#946;1-adrenergic receptor autoantibodies in cardiac myopathy patients, which has allowed to significantly increase the sensitivity of previously developed diagnostic approaches. Conformational change in a single binding domain of GK and PDE was, next, used to create novel fluorescent biosensors for cGMP. These sensors demonstrated high spatio-temporal resolution and were applied to analyze rapid dynamics of cGMP production by soluble and particulate guanylyl cyclases as well as to image cGMP in mesangial cells. In summary, highly sensitive biosensors for cAMP and cGMP based on single cyclic nucleotide-binding domains have been developed and used in various biological and clinically relevant applications.},
  subject      = {Cyclo-AMP},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Werthmann2009,
  author    = {Werthmann, Ruth},
  title     = {Echtzeit-Untersuchungen zur Thrombin-abh{\"a}ngigen {\"A}nderung der cAMP-Konzentration in lebenden Endothelzellen},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-46066},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2009},
  abstract  = {Das Endothel bildet eine einschichtige Zellbarriere zwischen Blut und interstitiellem Gewebe, deren Durchl{\"a}ssigkeit entscheidend durch die sekund{\"a}ren Botenstoffe Ca2+ und cAMP reguliert wird. W{\"a}hrend Ca2+ durch eine verst{\"a}rkte Kontraktion der Endothelzellen die Permeabilit{\"a}t erh{\"o}ht, f{\"o}rdert cAMP die Adh{\"a}sion der Zellen und unterst{\"u}tzt somit die Barrierefunktion. Es ist bekannt, dass Thrombin durch einen Anstieg der intrazellul{\"a}ren Ca2+-Konzentration und vermutlich auch durch eine Hemmung der cAMP-Konzentration zu einer Permeabilit{\"a}tserh{\"o}hung f{\"u}hrt. Ziel dieser Arbeit war es, Thrombin-induzierte {\"A}nderungen der cAMP-Konzentration in Echtzeit in lebenden Endothelzellen mittels Fluorescence-Resonance-Energy-Transfer (FRET) zu untersuchen. Hierf{\"u}r wurden Human-Umbilical-Vein-Endothelial-Cells (HUVECs) mit dem FRET-basierten cAMP-Sensor Epac1-camps transfiziert. Die Bindung von cAMP an Epac1-camps f{\"u}hrt zu einer Konformations{\"a}nderung des Sensors und damit zu einer Abschw{\"a}chung des FRET. Mit Hilfe dieses Sensors kann die cAMP-Konzentration mit hoher zeitlicher Aufl{\"o}sung in einzelnen lebenden Zellen gemessen werden. Untersucht wurde der Effekt von Thrombin auf die cAMP-Konzentration in Endothelzellen, deren cAMP-Konzentration durch Stimulierung endogener \&\#946;-Rezeptoren erh{\"o}ht war. Thrombin erniedrigte Ca2+-abh{\"a}ngig die cAMP-Konzentration um ca. 30 \%. Dieser Abfall der cAMP-Konzentration folgte zeitlich verz{\"o}gert dem Thrombin-induzierten Ca2+-Signal. Die cAMP-Konzentration erreichte ca. 30 s nach der Thrombinzugabe ein Minimum und stieg danach wieder an. Durch die Herunterregulierung der durch Ca2+ direkt inhibierten Adenylatzyklase 6 (AC6) mittels siRNA wurde die Thrombin-induzierte Abnahme der cAMP-Konzentration vollst{\"a}ndig aufgehoben. Dies best{\"a}tigte, dass Thrombin durch die Ca2+-vermittelte Inhibierung der AC6 eine Abnahme der cAMP-Konzentration verursacht. Ohne \&\#946;-adrenerge Stimulation f{\"u}hrte die Applikation von Thrombin zu einem langsamen Anstieg der cAMP-Konzentration, der mehrere Minuten anhielt. Dieser cAMP-Konzentrationsanstieg beruhte auf der Ca2+-abh{\"a}ngigen Aktivierung der Phospholipase A2 (PLA2). Diese setzt Arachidons{\"a}ure aus Membranphospholipiden frei, die als Substrat f{\"u}r die Synthese verschiedener Prostaglandine dient. Durch die pharmakologische Beeinflussung von Zyklooxygenasen und Prostazyklinrezeptoren konnte gezeigt werden, dass die Synthese von Prostazyklin und die anschließende Stimulation Gs-gekoppelter Prostazyklinrezeptoren zum Thrombin-induzierten Anstieg der cAMP-Konzentration f{\"u}hrte. Da die Physiologie der Endothelzellen im Gef{\"a}ß stark von Faktoren aus der unmittelbaren Umgebung beeinflusst wird, ist die Messung der {\"A}nderungen der cAMP-Konzentration in Endothelzellen, die sich innerhalb eines Gewebes befinden, von sehr großer Bedeutung. Deshalb war die Generierung transgener M{\"a}use mit einer gewebespezifischen Expression des FRET-Sensors Epac1-camps in Endothelzellen ein weiteres Ziel dieser Arbeit. Durch Anwendung eines Cre-Rekombinase/loxP-Ansatzes konnten transgene M{\"a}use generiert werden, die Epac1-camps spezifisch in Endothelzellen exprimierten. An isolierten pulmon{\"a}ren Endothelzellen konnte die Funktionalit{\"a}t des transgen exprimierten Sensors Epac1-camps nachgewiesen werden. Die Echtzeitmessung der Thrombin-induzierten {\"A}nderungen der cAMP-Konzentration verdeutlichte ein zeitlich sehr komplexes Wechselspiel zwischen Ca2+- und cAMP-Signalen, das die Barrierefunktion des Endothels maßgeblich beeinflussen wird. Die transgene Expression von Epac1-camps in Endothelzellen erm{\"o}glicht in Zukunft die Untersuchung der Thrombin-verursachten {\"A}nderungen der cAMP-Konzentration und der Permeabilit{\"a}t innerhalb eines intakten Gef{\"a}ßes.},
  subject      = {Cyclo-AMP},
  language  = {de}
}
@phdthesis{vonHayn2010,
  author    = {von Hayn, Kathrin},
  title     = {Untersuchungen zur Ca2+-abh{\"a}ngigen Regulation von cAMP in intakten vaskul{\"a}ren Myocyten},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-47709},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2010},
  abstract  = {Die Regulation des Tonus glatter Muskelzellen wird entscheidend von den beiden antagonistisch wirkenden second messengern cAMP und Ca2+ beeinflusst. Ein Ziel dieser Arbeit war herauszufinden, ob diese beiden Botenstoffe auch direkten Einfluss aufeinander haben k{\"o}nnen und welche Enzyme in diesem Fall an den Prozessen beteiligt sind. cAMP-Signale in intakten Zellen konnten wir in Echtzeit mit Hilfe des FRET-basierten cAMP-Sensors Epac1-camps beobachten; Ca2+-Signale durch Markieren der Zellen mit Fura-2. Anstiege der intrazellul{\"a}ren Ca2+-Konzentration in VSMCs wurden durch Aktivierung von endogen exprimierten, Gq-gekoppelten P2Y6-Rezeptoren mit Uridindiphosphat (UDP) ausgel{\"o}st. Durch eine zus{\"a}tzliche in-vitro Kalibrierung des Epac1-camps konnten dar{\"u}ber hinaus absolute cAMP-Konzentrationen in einzelnen lebenden Zellen berechnet werden. W{\"a}hrend ein Anstieg der Ca2+-Konzentration auf nicht vorstimulierte VSMCs keinen signifikante Einfluss auf die intrazellul{\"a}ren cAMP-Konzentrationen hatte, bewirkte die Aktivierung der purinergen Rezeptoren einen deutlichen R{\"u}ckgang der intrazellul{\"a}ren cAMP-Konzentration in mit Isoproterenol vorstimulierten VSMCs. Dieser Effekt konnte sowohl durch die Komplexierung von Ca2+ mit BAPTA-AM als auch durch die {\"U}berexpression der Ca2+-insensitiven AC4 antagonisiert werden. Adenylatcyclase-Aktivit{\"a}ts-Assays in VSMC-Membranen zeigten ebenfalls einen R{\"u}ckgang der Cyclaseaktivit{\"a}t nach Zugabe von 2 und 5 \&\#956;M freiem Ca2+. Die Hemmung der einzigen Ca2+-regulierbaren PDE1 mit dem selektiven PDE1-Inhibitor 8-Methoxymethyl-IBMX (8-MM-IBMX) hatte im Gegensatz dazu keinen Einfluss auf die durch UDP verursachte {\"A}nderung der cAMP-Konzentration in vorstimulierten VSMCs. Schließlich bewirkte die Herunterregulation der Ca2+-inhibierbaren AC5 und 6 mit siRNA einen signifikante Hemmung des durch UDP verursachten Effekts. Fasst man alle diese Ergebnisse zusammen, so l{\"a}sst sich folgende Schlussfolgerung ziehen: Der durch purinerge Stimulation verursachte R{\"u}ckgang der cAMP-Konzentration in mit Isoproterenol vorstimulierten VSMCs wird durch eine Hemmung der Ca2+-hemmbaren AC5 und 6 vermittelt. Dadurch sind zwei f{\"u}r die Regulation des Tonus wichtige Signalwege in VSMCs miteinander verbunden, die sich somit gegenseitig entscheidend beeinflussen k{\"o}nnen. Ein weiterer Bestandteil dieser Arbeit war die Entwicklung eines transgenen Mausmodells, das glattmuskelspezifisch den cAMP-Sensor Epac1-camps exprimiert. Mit Hilfe eines solchen Tiermodells k{\"o}nnten in Zukunft cAMP-{\"A}nderungen in intakten Geweben und vielleicht sogar in lebenden Tieren beobachtet werden. Durch Anwendung des Cre-loxP-Rekombinationssystems gelang es eine glatt¬muskelspezifische, f{\"u}r den Epac1-camps transgene Mauslinie zu generieren. Mit isolierten VSMCs dieser Tiere konnten bereits erste FRET-Messungen durchgef{\"u}hrt und agonistinduzierte cAMP-{\"A}nderungen beobachtet werden.},
  subject      = {Glatte Muskulatur},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Konrad2021,
  author    = {Konrad, Charlotte},
  title     = {Biochemische Charakterisierung von cAMP-Gradienten - Einfluss von Phosphodiesterasen},
  doi       = {10.25972/OPUS-20572},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-205728},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2021},
  abstract  = {Cyclisches Adenosinmonophosphat ist ein ubiquit{\"a}rer zweiter Botenstoff zahlreicher Signalwege im menschlichen K{\"o}rper. Auf eine Vielzahl verschiedenster extrazellul{\"a}rer Signale folgt jedoch eine Erh{\"o}hung desselben intrazellul{\"a}ren Botenstoffs - cAMP. Nichtsdestotrotz schafft es die Zelle, Signalspezifit{\"a}t aufrecht zu erhalten. Ein anerkanntes, wenn auch bisher unverstandenes Modell, um dieses zu erm{\"o}glichen, ist das Prinzip der Kompartimentierung. Die Zelle besitzt demnach Areale verschieden hoher cAMP-Konzentrationen, welche lokal begrenzt einzelne Signalkaskaden beeinflussen und somit eine differenzierte Signal{\"u}bertragung erm{\"o}glichen. Eine m{\"o}gliche Ursache f{\"u}r die Ausbildung solcher Bereiche geringerer cAMP- Konzentrationen (hier als Dom{\"a}nen bezeichnet), ist die hydrolytische Aktivit{\"a}t von Phosphodiesterasen (PDEs), welche als einzige Enzyme die F{\"a}higkeiten besitzen, cAMP zu degradieren. In dieser Arbeit wird der Einfluss der cAMP-Hydrolyse verschiedener PDEs auf die Gr{\"o}ße dieser Dom{\"a}nen evaluiert und mit denen der PDE4A1 verglichen, welche bereits durch unsere Arbeitsgruppe aufgrund ihrer Gr{\"o}ße als Nanodom{\"a}nen definiert wurden. Der Fokus wird dabei auf den Einfluss von kinetischen Eigenschaften der Phosphodiesterasen gelegt. So werden eine PDE mit hoher Umsatzgeschwindigkeit (PDE2A3) und eine PDE mit hoher Substrataffinit{\"a}t (PDE8A1) verglichen. Mithilfe sogenannter Linker, Abstandshaltern definierter L{\"a}nge, werden zus{\"a}tzlich die Nanodom{\"a}nen ausgemessen, um einen direkten Zusammenhang zwischen Gr{\"o}ße und kinetischer Eigenschaft anzugeben. Die Zusammenschau der Ergebnisse zeigt, dass die maximale Umsatzgeschwindigkeit der Phosphodiesterasen direkt mit der Gr{\"o}ße der Nanodom{\"a}nen korreliert. Durch den unmittelbaren Vergleich der gesamten PDE mit ihrer katalytischen Dom{\"a}ne wird zus{\"a}tzlich der Einfluss von regulatorischen Dom{\"a}nen evaluiert. Es wird gezeigt, dass diese cAMP-Gradienten modulieren k{\"o}nnen. Bei der PDE2A3 geschieht die Modulation u.a. durch Stimulation mit cGMP, welche h{\"o}chstwahrscheinlich dosisabh{\"a}ngig ist und somit graduell verl{\"a}uft. Hiermit pr{\"a}sentieren sich die Dom{\"a}nen als dynamische Bereiche, d.h. sie k{\"o}nnen in ihrer Auspr{\"a}gung reguliert werden. In dieser Arbeit wird die Hypothese best{\"a}tigt, dass Phosphodiesterasen eine wichtige Rolle in der Kompartimentierung von cAMP spielen, die Gruppe jedoch inhomogener ist, als bislang angenommen. Die Gradienten-Bildung l{\"a}sst sich nicht bei jeder Phosphodiesterase darstellen (PDE8A1). Einige Phosphodiesterasen (PDE2A3) jedoch bilden Kompartimente, die durch externe Stimuli in ihrer Gr{\"o}ße reguliert werden k{\"o}nnen. Die Arbeit legt den Grundstein zur breiteren Charakterisierung des spezifischen Einflusses weiterer PDEs auf cAMP-Kompartimentierung, welches nicht nur das Verst{\"a}ndnis der Kompartimentierungs-Strategien voranbringt, sondern auch essentiell f{\"u}r das Verst{\"a}ndnis der Pathophysiologie zahlreicher Krankheitsbilder, aber auch f{\"u}r das Verst{\"a}ndnis bereits angewandter aber auch potentiell neuer Medikamente ist.},
  subject      = {Cyclo-AMP},
  language  = {de}
}