@phdthesis{Wein2001,
  author    = {Wein, Martina},
  title     = {Biosynthese und Metabolismus von 2,5-Dimethyl-4-hydroxy-3(2H)-furanon in Erdbeeren},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-1182059},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2001},
  abstract  = {Die vorliegende Arbeit pr{\"a}sentiert neue Erkenntnisse zur Biosynthese von 2,5-Dimethyl-4-hydroxy-3(2H)-furanon (DMHF) und 2,5-Dimethyl-4-methoxy-3(2H)-furanon (DMMF), zwei wichtigen Aromakomponenten in Erdbeeren. Potentielle, mit stabilen Isotopen markierte Vorl{\"a}ufersubstanzen wurden an Erdbeeren appliziert und drei Tage bei Raumtemperatur inkubiert. Der Nachweis {\"u}ber den erfolgreichen Einbau erfolgte mittels Gaschromatographie-Massenspektrometrie. Anhand der Massenspektren von DMHF und DMMF, die aus den behandelten Erdbeeren mittels Festphasenextraktion isoliert wurden, konnte der Markierungsgrad der Verbindungen ermittelt werden und somit R{\"u}ckschl{\"u}sse {\"u}ber die Effizienz der Metabolisierung der applizierten Zucker zu den beiden Furanonen DMHF und DMMF gezogen werden. Als m{\"o}gliche Ausgangsstoffe dienten unterschiedlich markierte D-Glucose und D-Fructose, sowie Desoxyzucker, da diese als direkte Vorl{\"a}ufersubstanzen von DMHF und DMMF diskutiert werden. Isotopenmarkierte Desoxy-D-glucose oder Desoxy-D-fructose sind kommerziell nicht erh{\"a}ltlich, weshalb die Verbindungen [1-13C]-1-Desoxy-D-fructose, [6-2H1]-6-Desoxy-D-glucose und [5,6,6,6-2H4]-6-Desoxyhexulose-1-phosphat zuerst synthetisiert werden mussten. Nach Applikation der Desoxyzucker wurde keine Erh{\"o}hung des Markierungsgrades an stabilen Isotopen gegen{\"u}ber dem nat{\"u}rlichen Isotopenverh{\"a}ltnis festgestellt. Somit k{\"o}nnen 6-Desoxy-D-glucose, 1-Desoxy-D-fructose und 6-Desoxy-D-fructose-1-phosphat als Prekursoren von DMHF und DMMF ausgeschlossen werden. Als gute Vorl{\"a}ufersubstanzen erwiesen sich D-Glucose und D-Fructose. Markierungen (13C und 2H) an Position C-1 oder C-6 der beiden Verbindungen wurden sowohl in DMHF als auch in dessen Methoxyderivat DMMF detektiert, wobei die Applikation von D-Fructose im Gegensatz zur D-Glucose einen h{\"o}heren Markierungsgrad der Zielverbindungen zur Folge hatte. Durch den Einsatz positionsspezifisch markierter D-Glucose (2H-Markierung an Position C-1, C-2 oder C-4) sollten Aufschl{\"u}sse {\"u}ber den Metabolisierungsmechanismus gewonnen werden. Die Markierung der D-[2-2H]Glucose befand sich wie die der D-[1-2H]Glucose in den Methylgruppen der Furanone, was nur durch eine intramolekulare Verschiebung von C-2 nach C-1 erkl{\"a}rbar ist. Diese wurde bei der Glucosephosphatisomerase-katalysierten Umwandlung von D-Glucose-6-phosphat zu D-Fructose-6-phosphat beobachtet. Somit muss D-Glucose bei der Biosynthese von DMHF und DMMF zuerst in diese Intermediate {\"u}berf{\"u}hrt werden. Im Gegensatz zu an Position C-2 markierter D-Glucose ging das Proton an Position C-4 im Laufe der Metabolisierung verloren. Demzufolge findet der in der Natur verbreitete Desoxygenierungsmechanismus von Monosacchariden nicht statt und schließt die Beteiligung von Desoxyzuckern an der Biosynthese von DMHF und DMMF g{\"a}nzlich aus. Nach Einsatz von uniform markierter D-Fructose konnte sechsfach markiertes DMHF und DMMF identifiziert werden, was durch den Einbau der intakten Kohlenstoffkette zu erkl{\"a}ren ist. Dieser Befund und weitere Untersuchungen mit verschiedenen Glykolyse-regulierenden Substanzen deuteten darauf hin, dass die Furanone dem zentralen Kohlenhydratstoffwechsel, der Glykolyse, entspringen. Vor der Aldolase-katalysierten Spaltung in zwei C3-Einheiten muss jedoch eine Abzweigung erfolgen, da sonst die Kohlenstoffkette nicht unver{\"a}ndert vorliegen k{\"o}nnte. Im zweiten Teil der Arbeit ist erstmals mit Hilfe von molekularbiologischen Techniken die vollst{\"a}ndige cDNA einer O-Methyltransferase (OMT) aus Erdbeeren isoliert worden. Hierf{\"u}r wurde mRNA aus reifenden Erdbeeren extrahiert und eine cDNA Bibliothek hergestellt. Diese wurde mit einer OMT-spezifschen Sonde durchmustert, welche durch PCR mit degenerierten Primern synthetisiert worden war. Nach mehreren Vereinzelungs-Zyklen konnte die vollst{\"a}ndige cDNA einer O-Methyltransferase (STOMT, Strawberry OMT) erhalten werden. Northern-Analysen ergaben, dass die entsprechende RNA ausschließlich in den verschiedenen Reifestadien der Frucht akkumuliert, mit den h{\"o}chsten Transkriptmengen in der rot-werdenden und reifen Frucht. In anderen Gewebeteilen wie Wurzel, Bl{\"a}tter, St{\"a}ngel und Bl{\"u}te konnte keine STOMT-RNA nachgewiesen werden. Das korrespondierende Protein zeigte hohe Homologien zu Kaffees{\"a}ure-OMTs aus Weidengew{\"a}chsen der Gattung Populus. Nach erfolgreicher, heterologer Expression von STOMT in E. coli wurde die Substratspezifit{\"a}t des Enzyms untersucht, dessen Temperaturoptimum bei 30°C lag. Alle eingesetzten Substrate mit phenolischem Grundger{\"u}st, wie Brenzcatechin, Kaffees{\"a}ure, Kaffeeoyl-CoA und 3,4-Dihydroxybenzaldehyd, aber auch das Furanonderivat DMHF wurden von der rekombinanten O-Methyltransferase umgesetzt. Als bestes Substrat erwies sich 3,4-Dihydroxybenzaldehyd, das, im Gegensatz zu dessen Methylierungsprodukt Vanillin, bisher in Erdbeeren nicht nachgewiesen werden konnte. Kaffees{\"a}ure wurde ebenfalls effektiv methyliert, worin vermutlich die Hauptaufgabe von STOMT in der Pflanze liegt. Die Methylierung von Kaffees{\"a}ure oder 5-Hydroxyferulas{\"a}ure ist ein wichtiger Prozess in der Entstehung von Lignin. Die Tatsache, dass Erdbeeren teilweise in den Leitb{\"u}ndeln und verst{\"a}rkt in den Achenen lignifiziert sind, erkl{\"a}rt das Vorhandensein eines solchen Enzyms. DMHF, das als Dienol-Tautomer eine aromatische Struktur mit Hydroxylgruppen aufweist und somit strukturelle {\"A}hnlichkeiten zu phenolischen Verbindungen zeigt, wurde ebenfalls von STOMT als Substrat akzeptiert. Die Bildung von DMMF, dem Methoxyderivat von DMHF erfolgte vergleichsweise langsam, war aber eindeutig auf die Methyltransferase-Aktivit{\"a}t zur{\"u}ckzuf{\"u}hren. STOMT ist aufgrund des Expressionsmusters als fruchtspezifisch und reifeinduziert einzustufen. Prim{\"a}re Funktion ist vermutlich zu Beginn der Fruchtreifung die Lignifizierung der Leitb{\"u}ndel und sp{\"a}ter die der Achenen. Gleichzeitig scheint STOMT wesentlich an der Bildung der Aromastoffe DMMF und Vanillin in Erdbeeren beteiligt zu sein.},
  subject      = {Erdbeere},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Strehl2004,
  author    = {Strehl, Marie-Annette},
  title     = {Die Rolle der DNA-Methylierung in der Kontrolle des MHC-II-spezifischen Typ-IV-Promotors in Thymomen},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-16183},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2004},
  abstract  = {Die Molek{\"u}le des „major histocompatibility complex" (MHC) spielen in der thymischen T-Zell-Reifung eine zentrale Rolle. Durch Interaktion des T-Zell-Rezeptors auf der unreifen T-Zelle und den Co-Rezeptoren CD4 und CD8 mit dem MHC auf dem Thymusepithel werden die zwei wichtigsten Reifungs- und Selektionsprozesse, positive und negative Selektion, vermittelt. St{\"o}rungen dieser Selektionsmechanismen k{\"o}nnen zu Immundefekten oder Autoimmunph{\"a}nomenen f{\"u}hren. Die Regulierung der MHC IIExpression erfolgt haupts{\"a}chlich transkriptionell und wird vor allem durch den sogenannten Class II Transaktivator (CIITA) bestimmt. Die Transkription von CIITA wird {\"u}ber vier alternative, gewebsspezifische Promotoren durch alternatives splicing reguliert. Unter diesen Splicevarianten ist der CIITA Typ IV Promotor f{\"u}r die konstitutive MHC II-Expression in Thymusepithelzellen und f{\"u}r die IFN-g induzierte Expression in anderen Geweben verantwortlich. Thymome sind menschliche Tumoren des Thymusepithels, welche h{\"a}ufig mit einer paraneoplastischen Myasthenia gravis (MG) assoziiert sind. Die paraneoplastische MG zeigt eine starke positive Korrelation mit der F{\"a}higkeit eines Thymoms, reife CD4+ T-Zellen zu produzieren und in das periphere Blut zu exportieren. Thymome weisen aus bislang ungekl{\"a}rten Gr{\"u}nden h{\"a}ufig eine starke Reduktion der epithelialen MHC II- Expression auf. Ziel dieser Arbeit war die Beantwortung der Frage, ob eine DNA-Methylierung der Promotorregion des MHC-Klasse II Transaktivators (CIITA) Typ IV daran beteiligt ist. Hierzu wurden 27 Thymome mit sowohl hoher und als auch niedriger MHC II-Expression und 9 Normalthymi aus unterschiedlichen Altersgruppen untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass der CIITA Typ IV Promotor in kindlichen Kontrollthymi vollst{\"a}ndig unmethyliert ist, w{\"a}hrend die Thymi erwachsener Kontrollpersonen eine vermehrte Methylierung aufweisen. Im Gegensatz dazu war der CIITA Typ IV in nahezu allen Thymomen stark hypermethyliert. Da aber kein signifikanter Unterschied in der Methylierung zwischen Thymomen mit hoher und solchen mit niedriger MHC II-Expression festgestellt werden konnte, lassen diese Ergebnisse vermuten, dass eine Hypermethylierung des CIITA Typ IV Promotors sehr wahrscheinlich nicht der alleinige Grund f{\"u}r die verminderte MHC II-Expression in Thymomen ist, sondern das auch andere Regulationsmechanismen wie zum Beispiel Histon-Acetylierung beteiligt sein k{\"o}nnten beteiligt sein k{\"o}nnten.},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Akimzhanov2005,
  author    = {Akimzhanov, Askar M.},
  title     = {Epigenetic repression of the NFATc1 transcription factor in human lymphomas},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-12921},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2005},
  abstract  = {We examined the regulation of NFATc1 in different lymphomas and observed an inversed correlation between the methylation status and expression of NFATc1. Our data demonstrate that aberrant DNA methylation associated with chromatin remodeling within nfatc1 locus is a major mechanism for the repression of NFATc1 expression, suggesting that the DNA methylation-mediated transcriptional silencing of NFATc1 may be a critical event in the tumorogenesis of ALCLs and cHLs. Furthermore, the DNA methylation of human nfatc1 promoter region could be used as a novel biomarker of tumor progression. Our results indicate a close link between the loss of immunoreceptor signaling and NFATc1 expression in human lymphomas. For both ALCLs and cHLs, defects in immunoreceptor signaling have been described which result in a loss of receptor-mediated gene expression programs (Schwering et al., 2003; Bonzheim et al., 2004; Marafioti et al., 2004). In T cells, one indicator gene of these programs appears to be the nfatc1 gene whose expression is controlled by TCR signals (Chuvpilo et al., 2002a). In contrast, in T cells NFATc1 expression is unaffected by TCR signals, and NFATc2 was found to be expressed at normal levels in ALCLs and cHLs (L.K., unpubl. data). Moreover, the activity of NF-kappaB factors which can bind to certain NFAT binding sites and share a distantly-related DNA binding domain with NFATs is strongly elevated in cHL cells (Bargou et al., 1997; Hinz et al., 2001; Hinz et al., 2002) suggesting that NFATs and NF-kappaBs exert very different effects on generation and maintenance of Hodgkin's lymhomas. However, it should be mentioned that in Burkitt's and further B cell lymphomas in which NFATc1 proteins are strongly expressed and controlled by receptor signals (Kondo et al., 2003), they could exert a promoting function in tumor development. The genes of p53 family members p63 and p73 are prominent examples for mammalian genes whose products can act both as oncoproteins and tumor suppressor genes (Hibi et al., 2000; Stiewe and Putzer, 2002), and it is likely that more genes exist which encode both tumor suppressors and oncoproteins. It remains to be shown whether the nfatc1 gene is one of them.},
  subject      = {Lymphom},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Neveling2007,
  author    = {Neveling, Kornelia},
  title     = {Molecular causes and consequences of genetic instability with respect to the FA/BRCA Caretaker Pathway},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-27383},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2007},
  abstract  = {In the context of this thesis, I investigated the molecular causes and functional consequences of genetic instability using a human inherited disease, Fanconi anemia. FA patients display a highly variable clinical phenotype, including congenital abnormalities, progressive bone marrow failure and a high cancer risk. The FA cellular phenotype is characterized by spontaneous and inducible chromosomal instability, and a typical S/G2 phase arrest after exposure to DNA-damaging agents. So far, 13 genes have been identified, whose biallelic (or, in the case of X-linked FANCB, hemizygous) mutations cause this multisystem disorder. The FA proteins interact in a multiprotein network, instrumental and essential in the cellular response to DNA damage. A more comprehensive summary of Fanconi anemia and its myriad clinical, cellular and molecular manifestations is provided in the introduction section of this thesis. The results of my experimental work are presented as published papers and manuscripts ready to be submitted. In the first publication, I investigated the connection between FA genes and bladder tumors. The question I tried to answer was whether a disruption of the FA/BRCA pathway may be a frequent and possibly causal event in bladder cancer, explaining the hypersensitivity of these cells to DNA-crosslinking agents. On the basis of my experimental data I arrived at the conclusion that disruption of the FA/BRCA pathway might be detrimental rather than advantageous for the majority tumor types by rendering them vulnerable towards DNA damaging agents and oxidative stress. The second publication deals with the gene coding for the core complex protein FANCE and tries to answer the question why FANCE is so rarely affected among FA-patients. The conclusion from these studies is that like FANCF, FANCE functions as a probable adaptor protein with a high tolerance towards amino acid substitutions which would explain the relative rareness of FA-E patients. I have also investigated the FANCL gene whose product functions as the catalytic subunit of the E3 ligase. The third publication addresses this issue by providing the first comprehensive description of genetic alterations and phenotypic manifestations in a series of three FA-L patients. The results of my study show that genetic alterations of FANCL are compatible with survival, these alterations may include large deletions such as so far common only in the FANCA gene, FA-L phenotypes can be mild to severe, and FANCL belongs to the group of FA genes that may undergo somatic reversion. The central protein of the FA/BRCA network, FANCD2, is the subject of the fourth publication presented in this thesis. Most importantly, we were able to show that there are no biallelic null mutations in FANCD2. Correspondingly, residual protein of both FANCD2-isotypes (FANCD2-S and FANCD2-L) was present in all available patient cell lines. This suggests that complete abrogation of the FANCD2 protein cannot be tolerated and causes early embryonic lethality. There are at least three FA proteins that are not required for the posttranslational modification of FANCD2. One of these proteins is the 5'-3' helicase BRIP1 (BRCA1-interacting protein 1), a protein that interacts directly with the breast cancer susceptibility protein BRCA1. I participated in the identification of BRIP1 as the FA protein FANCJ. This discovery is described in the fifth publication of this thesis. The newly discovered protein BRIP1/FANCJ seems to act as one of the mediators of genomic maintenance downstream of FANCD2. Another protein identified downstream of FANCD2 is PALB2. PALB2 was originally discovered as "partner and localizer of BRCA2". In a candidate gene approach we tested patients with early childhood cancers but without mutations in BRCA2 for mutations in PALB2 (publication 6). PALB2 was identified as a novel FA gene and designated FANCN. FA-N patients are very severely affected. The last publication included in my thesis describes the identification of the FA gene FANCI as the second monoubiquitinated member of the FA/BRCA pathway (publication 7). We identified biallelic mutations in KIAA1794 in four FA patients, thus proving the genuine FA-nature of this candidate sequence. The general discussion provides a synopsis of the results and conclusions of my work with the state of art of FA research.},
  subject      = {Fanconi-An{\"a}mie},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Jonas2008,
  author    = {Jonas, Ren{\´e}},
  title     = {Arsen-induzierte Zyto- und Gentoxizit{\"a}t sowie deren Modulation},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-28772},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2008},
  abstract  = {Arsen ist daf{\"u}r bekannt, dass es mutagen und kanzerogen wirkt und ein gentoxisches Potential besitzt. Die Mechanismen, durch die diese Effekte ausge{\"u}bt werden, sind noch nicht vollst{\"a}ndig aufgekl{\"a}rt. Es konnte jedoch gezeigt werden, dass Parameter, die mit der Freisetzung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS), z.B. Superoxiddismutaseaktivit{\"a}t und H{\"a}moxygenase-Genexpression, und Ver{\"a}nderungen des epigenetischen Musters der DNA, z.B. Depletion von S-Adenosylmethionin, in Zusammenhang stehen, durch Arsen beeinflusst werden. In dieser Studie wurde versucht, das gentoxische Potential von Arsen mit Hilfe des Comet Assay, eines Standard-Gentoxizit{\"a}tstests, zu charakterisieren sowie zu pr{\"u}fen, ob dieser Test eine geeignete Messmethode f{\"u}r die gentoxische Wirkung von Arsen darstellt. Dies wurde unter Heranziehung verschiedener additiver Messgr{\"o}ßen wie der Vitalit{\"a}t und der Proliferation sowie der parallelen Quantifizierung der Mitose-, C-Mitose-, Mikrokern- und Apoptosefrequenzen der verwendeten murinen L5178Y-Zellen durchgef{\"u}hrt. Des Weiteren wurde der den Arsen-bedingten DNA-Sch{\"a}den zugrundeliegende Mechanismus genauer beleuchtet. Unter Zuhilfenahme verschiedener Modulatoren wurden durch Arsen induzierter oxidativer Stress und durch Arsen induzierte Ver{\"a}nderung der epigenetischen DNA-Struktur untersucht. Ferner wurde gepr{\"u}ft, inwieweit die Inhibition von oxidativem Stress und Hypomethylierung der DNA zur Verringerung von potenziellen Folgen wie der Entstehung unnat{\"u}rlicher Mitosemorphologien und chromosomaler Aberrationen beitragen k{\"o}nnen, die wiederum eventuell in der Entstehung von Karzinomen resultieren k{\"o}nnen. F{\"u}r die Modulation der Freisetzung von ROS wurden als prooxidative Substanz 4-Nitrochinolin-1-Oxid und als Antioxidantien Benfotiamin (Vitamin-B1-Prodrug), N-Acetylcystein (NAC) und \&\#945;-Tocopherol (Vitamin E) ausgew{\"a}hlt. Das Methylierungs¬muster der DNA sollte durch das hypomethylierende Agens 5-Azacytidin und durch die potenziell hypermethylierenden Verbindungen S-Adenosylmethionin (SAM) und Folat beeinflusst werden. Die Untersuchungen bez{\"u}glich des gentoxischen Potentials von Arsen und die Eignung des Comet Assay f{\"u}r dessen Quantifizierung ergaben, dass unter Miteinbeziehung der erw{\"a}hnten additiven Parameter und der Quantifizierung nach Behandlung mit unterschiedlichen Arsen-Konzentrationen nach unterschiedlich langen Behandlungszeiten die im Comet Assay erzielten Werte als korrekt und zuverl{\"a}ssig angesehen werden k{\"o}nnen. Des Weiteren zeigten die Untersuchungen der Freisetzung von ROS und der Ver{\"a}nderung des DNA-Methylierungsmusters mit Hilfe von Modulatoren, dass beide Mechanismen an den Arsen-induzierten Effekten beteiligt sind. Nicht nur konnte mit Hilfe der Modulatoren jeweils die Inhibition der Freisetzung von ROS und der DNA-Hypomethylierung erreicht werden, es konnte zudem gezeigt werden, dass die Substanzen auch die Reduktion der erh{\"o}hten Anzahl unnat{\"u}rlicher Mitosemorphologien und chromosomaler Aberrationen bewirkten. Dieser Zusammenhang konnte in dieser Studie zum ersten Mal aufgezeigt werden und k{\"o}nnte im Hinblick auf die potenzielle Erniedrigung der Krebsinzidenzen durch Supplementierung der Bev{\"o}lkerung in Gebieten mit Arsen-belastetem Trinkwasser mit den genannten Modulatoren von Bedeutung sein.},
  subject      = {Oxidativer Stress},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Neuenkirchen2012,
  author    = {Neuenkirchen, Nils},
  title     = {An in vitro system for the biogenesis of small nuclear ribonucleoprotein particles},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-71300},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2012},
  abstract  = {Most protein-encoding genes in Eukaryotes are separated into alternating coding and non-coding sequences (exons and introns). Following the transcription of the DNA into pre-messenger RNA (pre-mRNA) in the nucleus, a macromolecular complex termed spliceosome removes the introns and joins the exons to generate mature mRNA that is exported to the cytoplasm. There, it can be interpreted by ribosomes to generate proteins. The spliceosome consists of five small nuclear ribonucleic acids (snRNAs) and more than 150 proteins. Integral components of this complex are RNA-protein particles (RNPs) composed of one or two snRNAs, seven common (Sm) and a various number of snRNP-specific proteins. The Sm proteins form a ring-structure around a conserved site of the snRNA called Sm site. In vitro, Sm proteins (B/B', D1, D2, D3, E, F, G) and snRNA readily assemble to form snRNPs. In the context of the cell, however, two macromolecular trans-acting factors, the PRMT5 (protein arginine methyltransferases type 5) and the SMN (survival motor neuron) complex, are needed to enable this process. Initially, the Sm proteins in the form of heterooligomers D1/D2, D3/B and F/E/G are sequestered by the type II methyltransferase PRMT5. pICln, a component of the PRMT5 complex, readily interacts with Sm proteins to form two distinct complexes. Whereas the first one comprises pICln and D3/B the second one forms a ring consisting of pICln, D1/D2 and F/E/G (6S). It has been found that pICln prevents the premature interaction of snRNAs with the Sm proteins in these complexes and thus functions as an assembly chaperone imposing a kinetic trap upon the further assembly of snRNPs. PRMT5 catalyzes the symmetrical dimethylation of arginine residues in B/B', D1 and D3 increasing their affinity towards the SMN complex. Finally, the SMN complex interacts with the pICln-Sm protein complexes, expels pICln and mediates snRNP assembly in an ATP-dependent reaction. So far, only little is known about the action of PRMT5 in the early phase of snRNP assembly and especially how the 6S complex is formed. Studies of this have so far been hampered by the unavailability of soluble and biologically active PRMT5 enzyme. The composition of the SMN complex and possible functions of individual subunits have been elucidated or hypothesized in recent years. Still, the exact mechanism of the entire machinery forming snRNPs is poorly understood. In vivo, reduced production of functional SMN protein results in the neurodegenerative disease spinal muscular atrophy (SMA). How specific SMN mutations that have been found in SMA patients cause the disease remains elusive, yet, are likely to interfere with either SMN complex stability or snRNP assembly. The aim of this work was to establish an in vitro system to recapitulate the cytoplasmic assembly of snRNPs. This was enabled by the recombinant production of all PRMT5 and SMN complex components as well as Sm proteins in a combination of bacterial and insect cell expression systems. Co-expression of human PRMT5 and its direct interaction partner WD45 (WD-repeat domain 45) in Sf21 (Spodoptera frugiperda 21) insect cells resulted for the first time in soluble and biologically active enzyme. Recombinant PRMT5/WD45 formed complexes with Sm protein heterooligomers as well as pICln-Sm protein complexes but not with F/E/G alone. Also, the enzyme exhibited a type II methyltransferase activity catalyzing the mono- (MMA) and symmetrical dimethylation (sDMA) of Sm proteins B, D1 and D3. Two experimental setups were devised to quantitatively analyze the overall methylation of substrates as well as to identify the type and relative abundance of specific methylation types. Methylation of Sm proteins followed Michaelis-Menten kinetics. Complex reconstitutions and competition of the methylation reaction indicate that 6S is formed in a step-wise manner on the PRMT5 complex. The analysis of the methylation type could be applied to deduce a model of sequential MMA and sDMA formation. It was found that large Sm protein substrate concentrations favored monomethylation. Following a distributive mechanism this leads to the conclusion that PRMT5 most likely confers partial methylation of several different substrate proteins instead of processing a single substrate iteratively until it is completely dimethylated. Finally, the human SMN complex was reconstituted from recombinant sources and was shown to be active in snRNP formation. The introduction of a modified SMN protein carrying a mutation (E134K) present in spinal muscular atrophy (SMA) proved that mutated complexes can be generated in vitro and that these might be applied to elucidate the molecular etiology of this devastating disease.},
  subject      = {Biogenese},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Gohlke2013,
  author    = {Gohlke, Jochen},
  title     = {Die Rolle von DNA-Methylierungen in der Entwicklung und Physiologie vonAgrobacterium-induzierten Arabidopsis-Tumoren},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-77732},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2013},
  abstract  = {Agrobacterium tumefaciens ist ein pathogenes Bodenbakterium, welches nach Integration seiner T-DNA in das pflanzliche Genom die Bildung von tumorartigen Wucherungen, den sogenannten Wurzelhalsgallen, an einer Reihe unterschiedlicher Wirtspflanzen verursacht. Die Expression der T-DNA-codierten Onkogene resultiert in der Proliferation und Differenzierung der sogenannten Wurzelhalsgallen, einem Prozess, welcher mit weitreichenden transkriptionellen und physiologischen Ver{\"a}nderungen verbunden ist. F{\"u}r DNA-Methylierungen ist bekannt, dass diese zu Genexpressionsver{\"a}nderungen beitragen, welche neoplastisches Wachstum in S{\"a}ugetieren beg{\"u}nstigen. {\"U}ber die Funktion epigenetischer Prozesse f{\"u}r die Physiologie und Entwicklung pflanzlicher Tumore ist bisher hingegen wenig bekannt. Daher wurde in dieser Arbeit das Methylierungsmuster von Wurzelhalsgallen, welche an Arabidopsis thaliana induziert wurden, sowohl genomweit als auch auf Basis einzelner Gene bestimmt. Dabei zeigte sich, dass die Onkogene ipt, iaaH und iaaM welche mit der T-DNA ins Genom integriert werden und die Proliferation ausl{\"o}sen, im Tumorgewebe unmethyliert vorliegen. Dennoch sind die Onkogene empf{\"a}nglich gegen{\"u}ber epigenetischen Modifikationen, da die siRNA-vermittelte Methylierung sowohl ihre Transkription als auch das Tumorwachstum unterbindet. Eine genomweite Studie der DNA-Methylierungsmuster mittels Tiling-Array-Analysen von immunopr{\"a}zipitierter methylierter DNA zeigte ein global hypermethyliertes Tumor-Genom im Vergleich zum tumorfreien Sprossgewebe. Diese Beobachtungen stehen im Gegensatz zu den Methylierungsmustern der meisten S{\"a}uger-Tumore, welche typischerweise mit globaler Hypomethylierung und lokaler Hypermethylierung von Promotor-Sequenzen assoziiert sind. Im Unterschied dazu waren die Promoter-Sequenzen im Pflanzentumor eher hypomethyliert. Die Methylierungsunterschiede zwischen Wurzelhalsgallen und Sprossgewebe korrelierten mit transkriptionellen Ver{\"a}nderungen. Speziell Gene, welche in Entwicklungsprozessen und Zellteilung involviert sind, waren von Methylierungs{\"a}nderungen betroffen. Dies impliziert, dass insbesondere diese Prozesse epigenetisch kontrolliert werden. Die Methylierung von Genen, welche einer transkriptionellen Kontrolle durch ABA unterliegen, war durch eine ABA-Behandlung induzierbar. DNA-Methylierungen kontrollieren somit wahrscheinlich essenzielle physiologische Prozesse w{\"a}hrend der Tumorentwicklung wie beispielsweise die ABA-vermittelte Trockenstressanpassung. Arabidopsis-Mutanten, welche in Nicht-CG-Methylierungsprozessen beeintr{\"a}chtigt sind, entwickelten gr{\"o}ßere Tumore als die Kontrollpflanzen der entsprechenden Wildtypen. Dies weist auf eine Inhibierung des Tumor-Wachstums durch ein hypermethyliertes Genom, insbesondere der Nicht-CG-Motive hin. Insgesamt zeigen die Ergebnisse, dass Genexpression, physiologische Prozesse und die Entwicklung pflanzlicher Tumore einer Regulation durch DNA-Methylierung unterliegen.},
  subject      = {Abscisins{\"a}ure},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Ziegler2016,
  author    = {Ziegler, Christiane},
  title     = {Epigenetic Mechanisms in the Pathogenesis and Therapy of Anxiety Disorders},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-146815},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2016},
  abstract  = {Anxiety disorders (AD) are common, disabling mental disorders, which constitute the most prevalent mental health condition conveying a high individual and socioeconomic burden. Social anxiety disorder (SAD), i.e. fear in social situations particularly when subjectively scrutinized by others, is the second most common anxiety disorder with a life time prevalence of 10\%. Panic disorder (PD) has a life time prevalence of 2-5\% and is characterized by recurrent and abrupt surges of intense fear and anticipatory anxiety, i.e. panic attacks, occurring suddenly and unexpected without an apparent cue. In recent years, psychiatric research increasingly focused on epigenetic mechanisms such as DNA methylation as a possible solution for the problem of the so-called "hidden heritability", which conceptualizes the fact that the genetic risk variants identified so far only explain a small part of the estimated heritability of mental disorders. In the first part of this thesis, oxytocin receptor (OXTR) gene methylation was investigated regarding its role in the pathogenesis of social anxiety disorder. In summary, OXTR methylation patterns were implicated in different phenotypes of social anxiety disorder on a categorical, neuropsychological, neuroendocrinological as well as on a neural network level. The results point towards a multilevel role of OXTR gene hypomethylation particularly at one CpG site (CpG3, Chr3: 8 809 437) within the protein coding region of the gene in SAD. The second part of the thesis investigated monoamine oxidase A (MAOA) gene methylation regarding its role in the pathogenesis of panic disorder as well as - applying a psychotherapy-epigenetic approach - its dynamic regulation during the course of cognitive behavioural therapy (CBT) in PD patients. First, MAOA hypomethylation was shown to be associated with panic disorder as well as with panic disorder severity. Second, in patients responding to treatment MAOA hypomethylation was shown to be reversible up to the level of methylation in healthy controls after the course of CBT. This increase in MAOA methylation along with successful psychotherapeutic treatment was furthermore shown to be associated with symptom improvement regarding agoraphobic avoidance in an independent replication sample of non-medicated patients with PD. Taken together, in the future the presently identified epigenetic patterns might contribute to establishing targeted preventive interventions and personalized treatment options for social anxiety disorder or panic disorder, respectively.},
  subject      = {Angst},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Boeck2018,
  author    = {B{\"o}ck, Julia},
  title     = {Differenzielle Methylierungsanalysen mittels verschiedener Next-Generation Sequencing-basierter Techniken: Die Bedeutung von differenziell methylierten Regionen in der menschlichen Hirnevolution und bei der Krebsentstehung},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-164220},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2018},
  abstract  = {Die Evolution der Primaten zeigt eine Verbindung zwischen der zunehmenden Komplexit{\"a}t des sozialen Verhaltens und der Vergr{\"o}ßerung des humanen Gehirns, insbesondere des pr{\"a}frontalen Cortex. Deshalb stellt der pr{\"a}frontale Cortex bez{\"u}glich der Evolution des Menschen eine der interessantesten Strukturen im humanen Gehirn dar. Es wird angenommen, dass nicht allein die Gr{\"o}ße, sondern auch die Funktion, vor allem das Zusammenspiel von Neuronen und nicht-neuronalen Zellen, wie z.B. Gliazellen, zur Differenzierung des menschlichen Gehirns von dem rezenter Primaten gef{\"u}hrt hat. Daraus l{\"a}sst sich schließen, dass die Gehirnfunktionen {\"u}ber eine ausgeglichene und gut aufeinander abgestimmte transkriptionelle Landschaft kontrolliert werden, die durch ein zugrundeliegendes genetisches und epigentisches R{\"u}ckgrat organisiert ist. In dieser Studie wurden das Methylierungsprofil neuronaler und nicht-neuronaler Zellen des pr{\"a}frontalen Cortex (Brodmann-Areal 10) von drei Menschen und drei Schimpansen miteinander verglichen. Die intra- und interspezifischen differenziell methylierten Regionen (DMRs) waren in bestimmten genomischen Regionen angereichert. Intraspezifische Methylierungsunterschiede zwischen neuronalen und nicht-neuronalen Zellen konnten dreimal h{\"a}ufiger beobachtet werden als interspezifische Unterschiede in den einzelnen Zelltypen. Rund 90\% der humanen intraspezifischen DMRs wiesen eine Hypomethylierung in den neuronalen Zellen im Vergleich zu den nicht-neuronalen Zellen auf. In den intraspezifischen DMRs (Mensch und Schimpanse) waren Gene angereichert, die mit verschiedenen neuropsychiatrischen Erkrankungen assoziiert sind. Der Vergleich zwischen Menschen und Schimpanse in den neuronalen und nicht-neuronalen Zelltypen zeigte eine Anreicherung von Genen mit human-spezifischer Histonsignatur. In den nicht-neuronalen Zellen konnten mehr interspezifische DMRs (n=666) detektiert werden als in den neuronalen Zellen (n=96). Ungef{\"a}hr 95\% der nicht-neuronalen interspezifischen DMRs waren im Menschen, im Vergleich zum Schimpansen, hypermethyliert. Daraus ergibt sich der Eindruck, dass mehrere hundert der nicht-neuronalen Gene w{\"a}hrend der humanen Gehirnevolution einer Methylierungswelle unterlagen. Dies f{\"u}hrt zu der Annahme, dass der Einfluss dieser Ver{\"a}nderungen in den nicht-neuronalen Zellen auf die Verg{\"o}ßerung des menschlichen Gehirns bisher stark untersch{\"a}tzt wurde. Die bekannteste genetische Ursache f{\"u}r erblichen Brust- und Eierstockkrebs sind Mutationen in den Tumorsuppressorgenen (TSG) BRCA1 und BRCA2. Dennoch k{\"o}nnen nur rund 20-25\% der famili{\"a}ren Brustkrebserkrankungen {\"u}ber Keimbahnmutationen in BRCA1/BRCA2 erkl{\"a}rt werden, besonders bei Frauen, deren Erkrankung vor dem vierzigsten Lebensjahr auftritt. Epigenetische Ver{\"a}nderungen, die zu einer aberranten Genexpression f{\"u}hren, spielen ebenfalls eine wichtige Rolle bei der Karzinogenese und der Entwicklung einer Brustkrebserkrankung. Es ist bekannt, dass TSG nicht nur durch den Verlust der Heterozygotie (engl. loss of heterozygosity, LOH) oder homozygote Deletionen, sondern auch durch transkriptionelle Stilllegung via DNA-Methylierung inaktiviert werden k{\"o}nnen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde {\"u}berpr{\"u}ft, welchen Einfluss aberrante Methylierungsmuster im Promotorbereich von TSG auf die Brustkrebskarzinogenese und die Expression der Gene haben. F{\"u}r die Quantifizierung der Epimutationen wurden die Promotorbereiche von acht TSG (BRCA1, BRCA2, RAD51C, ATM, PTEN, TP53, MLH1, RB1) und des estrogene receptor (ESR1) Gens, welches eine Rolle in der Tumorprogression spielt, mittels Deep Bisulfite Amplicon Sequencing (DBAS) analysiert. Es wurden Blutproben von zwei unabh{\"a}ngigen BRCA1/BRCA2-mutationsnegativen Brustkrebs (BC)-Patientenkohorten, sowie von zwei unabh{\"a}ngigen alters-gematchten, gesunden Kontrollkohorten untersucht. BC-Kohorte 1 beinhaltet early-onset (EO) BC-Patientinnen. Kohorte 2 enth{\"a}lt BC-Patientinnen mit einem Risiko von >95\% eine heterozygote Mutation in BRCA1/BRCA2 (high-risk, HR) zu tragen. Allele mit >50\% methylierten CpGs werden als funktionell relevante Epimutationen erachtet, da bekannt ist, dass TSG {\"u}ber eine Methylierung im Promotorbereich transkriptionell stillgelegt werden. Im Vergleich zu ESR1 ({\O} Methylierung, 3\%), welches die Methylierungslevel eines durchschnittlichen Promotors wiederspiegelt, zeigten die TSG sehr geringe durchschnittliche Methylierungswerte von weniger als 1\%. Zudem waren die durchschnittlichen Epimutationsraten (EMR; <0,0001-0,1\%) der TSG sehr gering. Mit der Ausnahme von BRCA1, welches eine erh{\"o}hte EMR in der BC-Kohorte verglichen zu den Kontrollen (0,31\% gegen 0,06\%) zeigte, gab es keine signifikanten Gruppenunterschiede zwischen BC-Patientinnen und Kontrollen. Eine von 36 HR BC-Patientinnen zeigte im Vergleich zu den restlichen Proben eine stark erh{\"o}hte EMR von 14,7\% in BRCA1. Rund ein Drittel (15/44) der EO BC-Patientinnen wiesen eine erh{\"o}hte Rate an Einzel-CpG Fehlern in mehreren TSG auf. Die nachfolgenden Expressionsanalysen ergaben eine erniedrigte Expression vieler TSG je analysierter Patientin. Diese Ergebnisse f{\"u}hren zu der Annahme, dass epigenetische Ver{\"a}nderungen in normalen K{\"o}rperzellen als ein m{\"o}glicher Indikator f{\"u}r einen gest{\"o}rten Mechanismus, der f{\"u}r die Aufrechterhaltung des unmethylierten Status und der daraus resultierenden normalen Genexpression zust{\"a}ndig ist, angesehen werden k{\"o}nnen. Dies kann mit einem erh{\"o}hten BC-Risiko assoziiert werden.},
  subject      = {Epigenetik},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Maierhofer2018,
  author    = {Maierhofer, Anna},
  title     = {Altersassoziierte und strahleninduzierte Ver{\"a}nderungen des genomweiten DNA-Methylierungs-Profils},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-174134},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2018},
  abstract  = {Der Prozess des Alterns ist ein komplexer multifaktorieller Vorgang, der durch eine sukzessive Verschlechterung der physiologischen Funktionen charakterisiert ist. Ein hohes Alter ist der Hauptrisikofaktor f{\"u}r die meisten Krankheiten, einschließlich Krebs und Herz-Kreislauf-Erkrankungen. Das Verst{\"a}ndnis der epigenetischen Mechanismen, die in den Prozess des Alterns involviert sind, k{\"o}nnte zur Entwicklung pharmakologischer Interventionen beitragen, die nicht nur die Lebenserwartung erh{\"o}hen, sondern auch den Beginn des altersassoziierten funktionellen Abbaus verz{\"o}gern k{\"o}nnten. Durch die Langzeit-Kultivierung prim{\"a}rer humaner Fibroblasten wurde ein in vitro Modell f{\"u}r das Altern etabliert, das die Identifizierung altersassoziierter DNA-Methylierungs-Ver{\"a}nderungen erm{\"o}glichte. Die in vitro Alterung konnte mit einer globalen Hypomethylierung und einer erh{\"o}hten DNA-Methylierung der ribosomalen DNA assoziiert werden. Dar{\"u}ber hinaus konnten DNA-Methylierungs-Ver{\"a}nderungen in Genen und Signalwegen, die f{\"u}r das Altern relevant sind, und ein erh{\"o}htes epigenetisches Alter nachgewiesen werden. Das in vitro Modell f{\"u}r das Altern wurde verwendet, um neben den direkten Effekten ionisierender Strahlung auf die DNA-Methylierung auch deren Langzeit-Effekte zu untersuchen. Die Strahlentherapie ist ein entscheidendes Element der Krebstherapie, hat aber auch negative Auswirkungen und kann unter anderem das Risiko f{\"u}r die Entwicklung eines Zweittumors erh{\"o}hen. Bei externer Bestrahlung wird neben dem Tumor auch gesundes Gewebe ionisierender Strahlung ausgesetzt. Daher ist es wichtig zu untersuchen, wie Zellen mit intakten DNA-Reparatur-Mechanismen und funktionierenden Zellzyklus-Checkpoints durch diese beeinflusst werden. In der fr{\"u}hen Phase der DNA-Schadensantwort auf Bestrahlung wurden in normalen Zellen keine wesentlichen DNA-Methylierungs-Ver{\"a}nderungen beobachtet. Mehrere Populations-Verdoppelungen nach Strahlenexposition konnten dagegen eine globale Hypomethylierung, eine erh{\"o}hte DNA-Methylierung der ribosomalen DNA und ein erh{\"o}htes epigenetisches Alter detektiert werden. Des Weiteren zeigten Gene und Signalwege, die mit Krebs in Verbindung gebracht wurden, Ver{\"a}nderungen in der DNA-Methylierung. Als Langzeit-Effekte ionisierender Strahlung traten somit die mit der in vitro Alterung assoziierten DNA-Methylierungs-Ver{\"a}nderungen verst{\"a}rkt auf und ein epigenetisches Muster, das stark an das DNA-Methylierungs-Profil von Tumorzellen erinnert, entstand. Man geht davon aus, dass Ver{\"a}nderungen der DNA-Methylierung eine aktive Rolle in der Entwicklung eines Tumors spielen. Die durch ionisierende Strahlung induzierten DNA-Methylierungs-Ver{\"a}nderungen in normalen Zellen k{\"o}nnten demnach in die Krebsentstehung nach Strahlenexposition involviert sein und zu dem sekund{\"a}ren Krebsrisiko nach Strahlentherapie beitragen. Es ist bekannt, dass Patienten unterschiedlich auf therapeutische Bestrahlung reagieren. Die Ergebnisse dieser Arbeit weisen darauf hin, dass die individuelle Sensitivit{\"a}t gegen{\"u}ber ionisierender Strahlung auch auf epigenetischer Ebene beobachtet werden kann. In einem zweiten Projekt wurden Gesamtblutproben von Patienten mit Werner-Syndrom, einer segmental progeroiden Erkrankung, und gesunden Kontrollen analysiert, um mit dem vorzeitigen Altern in Verbindung stehende DNA-Methylierungs-Ver{\"a}nderungen zu identifizieren. Werner-Syndrom konnte nicht mit einer globalen Hypomethylierung, jedoch mit einer erh{\"o}hten DNA-Methylierung der ribosomalen DNA und einem erh{\"o}hten epigenetischen Alter assoziiert werden. Das vorzeitige Altern geht demzufolge mit spezifischen epigenetischen Ver{\"a}nderungen einher, die eine Beschleunigung der mit dem normalen Altern auftretenden DNA-Methylierungs-Ver{\"a}nderungen darstellen. Im Rahmen dieser Arbeit konnte die Bedeutung epigenetischer Mechanismen im Prozess des Alterns hervorgehoben werden und gezeigt werden, dass sowohl exogene Faktoren, wie ionisierende Strahlung, als auch endogene Faktoren, wie das in Werner-Syndrom-Patienten mutiert vorliegende WRN-Gen, altersassoziierte DNA-Methylierungs-Ver{\"a}nderungen beeinflussen k{\"o}nnen.},
  subject      = {Methylierung},
  language  = {de}
}