@phdthesis{Orth2018,
  author    = {Orth, Martin Franz},
  title     = {Generierung und funktionelle Charakterisierung von stabil transfizierten, induzierbar LASP1 spezifische shRNA exprimierenden RT4- und T24-Blasenkarzinomzelllinien},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-161309},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2018},
  abstract  = {LASP1 spielt eine Schl{\"u}sselrolle in verschiedenen physiologischen und pathologischen Prozessen, wie etwa in der Entwicklung, Zellstruktur, Zellkommunikation, Tumorgenese und Metastasierung. Die Vielseitigkeit von LASP1 ist haupts{\"a}chlich durch seine besondere Proteinstruktur bedingt, die eine Interaktion mit vielen verschiedenen Bindepartnern erm{\"o}glicht. Effekte von LASP1 werden aber wahrscheinlich nicht nur durch cytosolische Interaktion mit Bindepartnern vermittelt, sondern auch, in Folge einer Translokation in den Zellkern, durch nukle{\"a}re Interaktion, evtl. als transkriptioneller Co-Faktor. Besonders die Rolle von LASP1 in diversen Krebserkrankungen stand in den letzten Jahren im Fokus der Forschung. Sowohl in Karzinomen, als auch in Medulloblastom und Leuk{\"a}mien w{\"a}chst die Evidenz f{\"u}r eine LASP1-{\"U}berexpression, die vor allem durch fehlende microRNA Regulation und Mutationen im p53 Tumorsuppressor bedingt scheint. Die hohe LASP1-Expression konnte in vielen in vitro und in vivo Studien mit vermehrter Proliferation, Migration und/ oder Invasion von Krebszelllinien in direkten Zusammenhang gebracht werden. Dieser Effekt von LASP1 auf Tumoraggressivit{\"a}t ist eine m{\"o}gliche Erkl{\"a}rung f{\"u}r die mit hoher LASP1-Expression korrelierte schlechtere Prognose in verschiedenen Krebserkrankungen. Das Transitionalzellkarzinom ist die f{\"u}nfh{\"a}ufigste Krebserkrankung des Menschen und weist eine hohe Rezidivrate auf. Daher sind regelm{\"a}ßige Nachsorgeuntersuchungen notwendig. Angesichts bisher fehlender verl{\"a}sslicher Biomarker f{\"u}r das Transitionalzellkarzinom ist die Zystoskopie weiterhin der Goldstandard in der Nachsorge. Diese wird aber von Patienten als unangenehm empfunden, ist mit einem Infektionsrisiko verbunden, von der Erfahrung des Untersuchers abh{\"a}ngig und kostenintensiv. Tats{\"a}chlich ist das Transitionalzellkarzinom eine der teuersten Krebserkrankungen in der Nachsorge, weshalb die Entwicklung alternativer Diagnostikverfahren auch gesundheits{\"o}konomische Relevanz hat. LASP1 wurde als ein vielversprechender Biomarker des Transitionalzellkarzinom-Rezidivs identifiziert, der durch einfache Proteinmengenbestimmung mittels Western Blot im Urinpellet evaluiert werden kann. Zum damaligen Zeitpunkt gab es außerdem bereits erste Hinweise auf eine funktionelle Relevanz von LASP1 im Blasenkarzinom in vitro. Angesichts dieser Erkenntnisse wurden als Ziele dieser Arbeit formuliert, 1) die Generierung von stabil transfizierten, induzierbar LASP1 spezifische shRNA exprimierenden Transitionalzellkarzinomzelllinien, 2) die funktionelle Charakterisierung eines LASP1-Knockdowns in selbigen in vitro, und 3) der Vergleich von Eigenschaften von LASP1 im Transitionalzellkarzinom mit denen in anderen Karzinomen. F{\"u}r die zwei Transitionalzellkarzinomzelllinien T24 und RT4 konnte eine 4-5-Fache LASP1-{\"U}berexpression, verglichen mit normalem Urothel, gezeigt werden. Beide Zelllinien wurden erfolgreich mit einem induzierbar shRNA gegen LASP1 exprimierenden Konstrukt transduziert, sodass ein 50 \% LASP1-Knockdown durch Doxycyclin induziert werden kann. Bei der Evaluierung des Effektes des LASP1-Knockdowns auf die Adh{\"a}sion, Proliferation und Migration dieser Zelllinien in vitro konnte eine signifikante Reduktion der Migration in beiden Zelllinien nachgewiesen werden. Passend dazu ergab eine GSEA von TCGA Daten zum Blasenkarzinom eine Korrelation von LASP1-Expression mit diversen Gen-Sets, die mit dem Ph{\"a}notyp Metastasierung annotiert sind. Des Weiteren konnte f{\"u}r T24 und RT4 eine nukle{\"a}re LASP1-Lokalisation nachgewiesen werden, die abh{\"a}ngig von der Serin-146 Phosphorylierung war. Bioinformatische Analysen ergaben eine hochsignifikante, negative Korrelation von LASP1-Expression und miR-203 im Blasenkarzinom. Eine Korrelation von LASP1-Expression mit Prognose konnte mittels TCGA Daten f{\"u}r das Blasenkarzinom nicht festgestellt werden. Jedoch lagen lediglich Expressionsdaten auf mRNA Level vor, die meisten LASP1 mit Prognose assoziierenden Studien basieren hingegen auf Immunhistochemie, also der Expression auf Proteinlevel, welche in Blasenkrebszelllinien von der Expression auf mRNA Level abweichen kann. Die generierten Zelllinien wiesen nach lentiviraler Transduktion, Selektion und Sorten im Vergleich zum Wildtyp teilweise ver{\"a}nderte Zelleigenschaften auf, und ein Verlust des Fluoreszenzsignals des der shRNA vorangestellten tRFP wurde beobachtet. Daher m{\"u}ssen die Zellen bei weiterer Verwendung regelm{\"a}ßig mit Puromycin nachselektioniert werden und die Validit{\"a}t dieser Zellen als Modell f{\"u}r das Transitionalzellkarzinom, besonders im Xenograft Mausmodell, ist kritisch zu hinterfragen. Entsprechend sind die Ergebnisse dieser Arbeit im Einklang mit bisherigen Studien zu LASP1. Damit unterstreicht diese Arbeit einmal mehr die Relevanz von LASP1 in diversen Krebserkrankungen. Weitere Studien zum Wert von LASP1 als prognostischer oder gar diagnostischer Marker erscheinen daher vielversprechend.},
  subject      = {Biomarker},
  language  = {de}
}