@phdthesis{Wehle2016,
  author    = {Wehle, Sarah},
  title     = {In silico Studien zu Bis-Tacrinen, Chinazolinen und Chinazolinonen sowie Synthese von Chinazoliniumverbindungen als Inhibitoren von Cholinesterasen},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-139955},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2016},
  abstract  = {Die Alzheimer'sche Erkrankung wird derzeit durch die Gabe von Acetylcholinesterase- Inhibitoren (AChEI) symptomatisch behandelt. Durch die AChE-Hemmung steht mehr Acetylcholin (ACh) f{\"u}r die Neurotransmission zur Verf{\"u}gung. Bei Progression der Erkran-kung nimmt der Anteil an AChE drastisch ab, so dass die Enzymisoform Butyrylcholin- esterase (BChE) die Hydrolyse des Neurotransmitters ACh {\"u}bernimmt. In sp{\"a}ten Phasen der Alzheimer'schen Erkrankung ist daher der Einsatz selektiver BChE-Hemmer erfolgsver- sprechend. Inhibitoren k{\"o}nnen verschiedene Bindestellen in der Cholinesterase-Bindetasche adressie-ren und dadurch in dieser stabilisiert werden. Zu den Bindestellen z{\"a}hlen die katalytisch aktive Stelle (CAS) am Ende eines 20 {\AA} langen Bindetaschentunnels, die Oxyanion-Vertie-fung, die Cholinbindestelle, sowie die periphere anionische Bindestelle (PAS), welche am Bindetascheneingang lokalisiert ist. In der vorliegenden Arbeit wurden durch in silico Dockingstudien gezielt Protein-Ligand- Interaktionen untersucht, um Strukturmerkmale hochaffiner Inhibitoren von Cholinesterasen zu identifizieren. Damit soll die zuk{\"u}nftige Entwicklung von Cholinesteraseinhibitoren hinsichtlich der Affinit{\"a}t zum Enzym verbessert werden. Ferner dienten synthetische Untersuchungen eines Naturstoffes dazu, Chinazoliniumverbindungen als Leitstruktur f{\"u}r die Inhibition der Cholinesterasen zu etablieren. F{\"u}r hochaffine tri- und tetrazyklische aminsubstituierte AChE-selektive Chinazolin- und Chinazolinoninhibitoren sollte die bevorzugte Orientierung der Liganden in der Bindetasche ermittelt werden. Hierf{\"u}r ist die Lokalisation des Aminsubstituenten in der CAS (invertierter Bindemodus) oder die dortige Bindung des Chinazolin-/Chinazolinonger{\"u}stes (klassischer Bindemodus) denkbar. Anhand eines pr{\"a}ferierten einheitlichen Bindemodus sollten die Struktur-Aktivit{\"a}ts-Beziehungen erkl{\"a}rt werden. Dockingstudien zeigten die klare Pr{\"a}ferenz f{\"u}r den invertierten Bindemodus, bei dem der Aminsubstituent in der N{\"a}he der CAS platziert wird. Ein strukturelles Merkmal f{\"u}r hochaffine Inhibitoren ist ein unter Assaybedingungen protoniertes Amin, welches eine Kation-π-Wechselwirkung zu dem Indolringsystem des Tryptophans der Cholinbindestelle eingehen kann. F{\"u}r das Ligandengrundger{\"u}st wurde lediglich f{\"u}r tetrazyklische Verbindungen eine π-π-Interaktion mit der peripheren Bindestelle (PAS) am Bindetascheneingang identifiziert. Der Datensatz umfasste auch chirale Chinazolinon- und Chinazolinderivate mit hydrierter C=N-Doppelbindung, die eine schw{\"a}chere Affinit{\"a}t zu AChE zeigten. Diese ist vermutlich auf das nicht-planare Ligandengrundger{\"u}st zur{\"u}ckzuf{\"u}hren, da vor allem f{\"u}r tetrazyklische chi-rale Verbindungen die Stabilisierung des Ligandengrundger{\"u}stes durch π-π-Interaktionen am Bindetascheneingang aufgrund der Sterik entweder gar nicht, oder nur f{\"u}r ein Enantio-mer m{\"o}glich ist. Aufgrund der nanomolaren Affinit{\"a}t der achiralen Chinazolin- und Chinazolinonverbindungen wurden weitere gerichtete Wechselwirkungen in der Bindetasche erwartet. Derartige Wechselwirkungen konnten in Form von Wasserstoffbr{\"u}cken durch die Verwendung von sieben ausgew{\"a}hlten strukturellen Wassermolek{\"u}len im Docking identifiziert werden. Durch diese Wassermolek{\"u}le werden Wasserstoffbr{\"u}cken vom Ligandengrundger{\"u}st zum Protein vermittelt. Diese Wechselwirkungen scheinen essentiell f{\"u}r die Stabilisierung hoch-affiner Chinazolin- und Chinazolinoninhibitoren in der AChE-Bindetasche zu sein. Zwei photochrome Bis-Tacrin-Konstitutionsisomere (Ring-ge{\"o}ffnete und Ring-geschlossene Form) inhibieren die AChE und zeigen einen unterschiedlichen Effekt in der Hemmung der Amyloid-β Fibrillenbildung. Die Fibrillenbildung wird durch eine unbesetzte periphere Bindestelle (PAS) am Eingang der AChE-Bindetasche katalysiert, weshalb eine unterschiedliche Interaktion der Liganden mit ebendieser Bindestelle vermutet wird. Dockingstudien lieferten f{\"u}r beide Konstitutionsisomere einen {\"a}hnlichen Bindemodus, der vor dem Hintergrund der {\"a}hnlichen IC50-Werte von 4.3 und 1.8 nM f{\"u}r die Ring-ge{\"o}ffnete und Ring-geschlossene Form plausibel erscheint. Durch die Auswahl einer geeigneten R{\"o}ntgenstruktur wurden Dockingl{\"o}sungen erhalten, bei denen ein Tacrinsubstituent in der PAS bindet und dort π-π-Interaktionen mit einem Tryptophan und einem Tyrosin eingeht. Eine solche Lage des PAS-bindenden Tacrinsubstituenten ist energetisch bevorzugt und dr{\"u}ckt sich durch bessere Scores gegen{\"u}ber Dockingl{\"o}sungen, bei denen dieser auf der Protein-oberfl{\"a}che lokalisiert ist, aus. Der andere Tacrinsubstituent bindet in der CAS wie dies von bereits kristallisierten Tacrinderivaten bekannt ist. Mittels molekulardynamischer Simulati-onen wurde die Stabilit{\"a}t der Protein-Dockingl{\"o}sungs-Komplexe beider Konstitutionsiso-mere verglichen. Dabei wurde die bessere Stabilisierung des CAS-bindenden Tacrinsubsti-tuenten f{\"u}r die Ring-ge{\"o}ffnete Form des Liganden ermittelt. Ferner zeigt sich f{\"u}r die Ring-ge{\"o}ffnete Inhibitorform w{\"a}hrend der Simulation der Einstrom von sechs Wassermolek{\"u}len in einen Hohlraum der PAS. Dies hat zur Folge, dass der PAS-bindende Tacrinsubstituent w{\"a}hrend der H{\"a}lfte der Simulationszeit durch Wasserstoffbr{\"u}cken in der PAS stabilisiert wird. Ein Wasserstoffbr{\"u}ckennetzwerk diesen Ausmaßes kann f{\"u}r die Ring-geschlossene Inhibitorform nicht ermittelt werden. Die bessere Hemmung der Amyloid-β Fibrillenbildung der Ring-ge{\"o}ffneten Inhibitorform wird daher auf die bessere Stabilisierung des Liganden durch Wasserstoffbr{\"u}cken in der AChE-Bindetasche zur{\"u}ckgef{\"u}hrt. F{\"u}r carbamatsubstituierte Tetrahydrochinazolinverbindungen sollten die bevorzugten Interaktionen in der BChE-Bindetasche ermittelt werden. Die Carbamatverbindungen sind pseudo-irreversible Inhibitoren und zeigen eine zeitabh{\"a}ngige Hemmung mit diversen Interaktionszust{\"a}nden zwischen Protein und Ligand. Dar{\"u}ber hinaus stellen Dockingstudien in der BChE bislang eine Herausforderung dar, da es derzeit nur zwei R{\"o}ntgenstrukturen dieses Enzyms mit reversiblen Liganden gibt, weshalb kaum Studien zur Identifikation einer geeigneten Bewertungsfunktion durchgef{\"u}hrt werden k{\"o}nnen. Im Docking wurde sich f{\"u}r die Analyse des reversiblen Anlagerungskomplexes entschieden, da das Docking des tetraedrischen {\"U}bergangszustandes energetisch entartete Dockingl{\"o}sungen lieferte. Eine weitere Herausforderung stellte die Gr{\"o}ße der BChE-Bindetasche dar, die auch im reversiblen Docking entartete Dockingl{\"o}sungen lieferte. Aufgrund einer {\"a}hnlichen {\"U}bertragungsrate aller getesteten Inhibitoren wurde eine konservierte Lage des Carbamates in der Bindetasche angenommen. Deshalb wurde eine repr{\"a}sentative Dockingl{\"o}sung einer Referenzverbindung als Ausgangspose f{\"u}r einen Modelling-Ansatz gew{\"a}hlt, die hinsichtlich der Interaktionen in der Bindetasche ausgew{\"a}hlt wurde. Diese Interaktionen sind: 1) Eine Wasserstoffbr{\"u}ckendistanz zwischen der Carbamat-Carbonylgruppe und der Oxyanion-Vertiefung sowie 2) eine Distanz, die den nucleophilen Angriff des Serins auf den Carbamatkohlenstoff erlaubt. Im Modelling-Ansatz wurde die repr{\"a}sentative Bindepose dazu verwendet die entsprechenden Inhibitoren in der Bindetasche aufzubauen. Die bevorzugte Position der N-Methylgruppe wurde f{\"u}r beide Enantiomere {\"u}ber die berechneten Spannungsenergien der Bindeposen abgesch{\"a}tzt. F{\"u}r die S-Enantiomere ergab sich die pr{\"a}ferierte Bindung mit quasi-„axialer" Methlygruppe und f{\"u}r die R-Enantiomere mit quasi-„{\"a}quatorialer" Stellung dieser. Die Carbamatstrukturen liegen somit mit der Heptylkette in der Acyltasche und die Ligandengrundger{\"u}ste werden in einer Seitentasche der BChE-Bindetasche platziert, in der hydrophobe Wechselwirkungen dominieren. Zus{\"a}tzlich zu den hochaffinen Chinazolinonverbindungen sollten artverwandte Chinazolini-umverbindungen als Leitstruktur f{\"u}r Cholinesteraseinhibitoren untersucht werden. Zun{\"a}chst erfolgten Studien zur chemischen Reaktivit{\"a}t und Stabilit{\"a}t des Naturstoffes Dehydroevodiamin (DHED) sowie seines Benz-Derivates (Benz-DHED). Insbesondere Benz-DHED war unter den bisher verwendeten und in der Literatur beschriebenen Synthesemethoden instabil. Die Untersuchungen erforderten daher zun{\"a}chst die Einf{\"u}hrung einer geeigneten Syntheseroute, in diesem Fall die Oxidation mit KMnO4, einhergehend mit der Verbesserung der Ausbeute und ohne Nebenproduktbildung. F{\"u}r die zuk{\"u}nftige Synthese von Derivaten wurde die Verwendung einer geeigneten Lewis-S{\"a}ure-labilen Schutzgruppe herausgearbeitet. Die untersuchten Chinazoliniumverbindungen zeigen die Eigenschaft, dass sie in Abh{\"a}ngigkeit der Reaktionsbedingungen in zwei Formen (Ring-ge{\"o}ffnet und Ring-geschlossen = Chi-nazoliniumsalz) isoliert werden k{\"o}nnen. Mittels UV/Vis-Untersuchungen wurde das Gleich-gewicht dieser Spezies aufgekl{\"a}rt und in w{\"a}ssrigen alkalischen L{\"o}sungen die Anreicherung einer dritten, bislang nicht in diesem Zusammenhang beschriebenen, Spezies beobachtet. Als biologisch aktive Spezies konnte die Chinazoliniumform identifiziert werden. In Dockingstudien der Chinazoliniumform von Benz-DHED, nach dem f{\"u}r Carbamatverbindungen entwickelten Modelling-Ansatz, konnte auch hierf{\"u}r die Stabilisierung der Docking- l{\"o}sung {\"u}ber eine Wasserstoffbr{\"u}cke in der BChE-Bindetasche zu einem strukturellen Wassermolek{\"u}l identifiziert werden. Dies verdeutlicht erneut, dass die Ber{\"u}cksichtigung von Wassermolek{\"u}len in Dockingstudien dazu dienen kann zus{\"a}tzliche Protein-Ligand-Interaktionen festzustellen. Auf Grundlage der Forschung zu Chinazoliniumverbindungen kann die zuk{\"u}nftige Inhibitorentwicklung von Strukturen basierend auf dieser Substanzklasse erfolgen. Die durchgef{\"u}hrten synthetischen und theoretischen Studien liefern wichtige Beitr{\"a}ge zum Verst{\"a}ndnis der Wechselwirkungen zwischen Inhibitoren und Cholinesterasen, die in der zuk{\"u}nftigen Inhibitorentwicklung Anwendung finden k{\"o}nnen.},
  subject      = {Cholinesteraseinhibitor},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Kapkova2005,
  author    = {Kapkov{\´a}, Petra},
  title     = {Biologische Untersuchungen zu Inhibitoren der Acetylcholinesterase und Erzeugung von neuen Leitstrukturen mittels "Random Chemistry"},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-11931},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2005},
  abstract  = {Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene Inhibitoren der Acetylcholinesterase (AChE) untersucht, die als potentielle Substanzen zur Behandlung von Morbus Alzheimer eingesetzt werden k{\"o}nnen. Die Hemmwirkung der einzelnen Substanzen wurde mittels Ellman-Test {\"u}berpr{\"u}ft. Gemeinsames Strukturmerkmal der Substanzklasse, von der im ersten Teil der Arbeit ausgegangen wurde, war das Grundger{\"u}st des AChE-Reaktivators TMB4 [1,1´-Trimethylen-bis(4-Formyl-Pyridiniumbromid)-Dioxim]. Anhand der biologischen Daten konnte beobachtet werden, dass die Art der Substitution die inhibitorische Aktivit{\"a}t der Verbindungen wesentlich beeinflusst. Am wirksamsten von allen Bispyridinium-Derivaten zeigte sich das 2,6-chlorierte Derivat DUO3 (IC50 = 0.34 \&\#956;M), gefolgt von monobenzyl-substituiertem UNO3, bismethylsubstituiertem TBM und unsubstituiertem TMB4. Weiterhin wurde der Bindungsmodus der DUO-Substanzen im aktiven Zentrum der AChE untersucht. Die Docking-Studien an Substanzen der DUO-Klasse zeigten ein einheitliches Bindungsmodel, welches folgende Wechselwirkungen be-inhaltet: \&\#960;-\&\#960;-„stacking" zwischen dem Benzylring einer DUO-Substanz und dem Trp84 am Grunde der Bindetasche des Enzyms, face-to-face Wechselwirkung (\&\#960;-\&\#960; und Kation-\&\#960;) zwischen dem Pyridiniumring und Trp334 oder Phe331 der aromatischen Furche. Bei 60\% der gedockten Strukturen wurde eine face-to-face-Wechselwirkung an der anionischen peripheren Seite (PAS) der AChE-Tasche festgestellt. Weiterhin wurden neue optimierte Inhibitoren entwickelt. Die Bispyridinium-Struktur der DUO-Derivate wurde um den aus der Furche herausragenden Benzylring gek{\"u}rzt. Als Leitstrukturen dienten die AChE-aktivsten Substanzen DUO3 (2,6-Cl-Derivat) und DUO12 (2-Cl-Derivat) sowie ein bisphthalimidomethyl-substituiertes TMB4-Derivat (WDUO). Die aktivste Verbindung der Pyridinium-Klasse war die Phthalimid-Phenyl-substituierte Substanz 3c (IC50 = 0.073 \&\#956;M). Ihre inhibitorische Aktivit{\"a}t gegen{\"u}ber AChE befand sich im Bereich der des Tacrins (IC50 = 0.044 \&\#956;M). Sie zeigte eine sehr gute AChE-Selektivit{\"a}t; die BChE hemmte sie um den Faktor 34 schw{\"a}cher. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde nicht nur das rationale Design angewandt, um zu viel versprechenden Kandidaten bez{\"u}glich klinischen Einsatzes zu gelangen. Auch das Verfahren der „Random Chemistry" kam zum Einsatz, um neue und interessante Strukturen zu erzeugen, die eventuell bessere Eigenschaften als die Ausgangssubstanz besitzen. Der Grundgedanke dieses Verfahrens liegt in der Ausnutzung der durch gamma-Strahlen (60Co-Quelle) induzierten Radiolyse des L{\"o}sungsmittels, welches seine prim{\"a}ren Produkte zur chemischen Reaktion mit dem in ihm gel{\"o}sten Stoff zur Verf{\"u}gung stellt. Aus den entstandenen Produkten wurden durch spezifische biologische Testung (Inhibition der AChE) positiv reagierende Komponenten herausselektiert. Die Proben wurden zuerst im Ganzen auf ihre F{\"a}higkeit, die AChE zu hemmen, gepr{\"u}ft. Nach der bioaktivit{\"a}tsgeleiteten Fraktionierung und Subfraktionierung mittels HPLC erwies sich die Tacrin/MeOH-Probe als die, mit dem interessantesten Aktivit{\"a}tsprofil. Die Charakterisierung der entstandenen Verbindungen bez{\"u}glich ihrer Vielf{\"a}ltigkeit erfolgte mittels ESI-Massenspektrometrie und UV-Spektroskopie. Die Substanz mit h{\"o}chster Hemmwirkung gegen{\"u}ber AChE (Peak E der Tacrin/MeOH-Probe) wurde nach der Isolierung der Reinheitspr{\"u}fung und Strukturaufkl{\"a}rung mittels NMR-, FTIR- und (Tandem)-ESI-Massenspektrometrie zugef{\"u}hrt und auf ihre biologische Wirkung hin untersucht.},
  subject      = {Acetylcholinesterase},
  language  = {de}
}