@phdthesis{Rienmueller2014,
  author    = {Rienm{\"u}ller, Florian Christian},
  title     = {Untersuchung der oxidativen und pH-abh{\"a}ngigen Regulation der vakuol{\"a}ren Protonen-ATPase und calciumabh{\"a}ngigen vakuol{\"a}ren Membranleitf{\"a}higkeiten von Arabidopsis thaliana},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-104891},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2014},
  abstract  = {Im Rahmen der hier vorliegenden Arbeit konnten neue Erkenntnisse zur oxidativen, pH- und ATP-abh{\"a}ngigen Regulation der V-ATPase-Funktion in Mesophyllvakuolen von A. thaliana erarbeitet werden. Dazu wurden Patch-Clamp-Experimente an der vakuol{\"a}ren Protonen-ATPase durchgef{\"u}hrt, die eine elektrophysiologische Untersuchung der Protonentransporteigenschaften und deren Regulation erm{\"o}glichten. Zus{\"a}tzlich gestattete die Anwendung von intrazellul{\"a}ren Mikroelektroden zusammen mit einem Fluoreszenz-Bildgebungsverfahren an intakten Wurzelrhizodermiszellen von A. thaliana Keimlingen die in vivo Untersuchung von vakuol{\"a}ren Membranleitf{\"a}higkeiten und deren Regulation durch cytosolisches Calcium. Durch die Patch-Clamp-Technik konnte die Spannungsabh{\"a}ngigkeit der V-ATPase bei verschiedenen luminalen pH-Werten erfasst werden. Mit Hilfe thermodynamischer Berechnungen konnte daraus eine Abnahme der Protonentransportrate pro hydrolysiertem ATP-Molek{\"u}l bei gleichzeitigem Anstieg der vakuol{\"a}ren Protonenkonzentration berechnet werden. Durch die Kombination verschiedener pH-Werte in Cytosol bzw. Vakuole und zus{\"a}tzlich ansteigenden ATP-Konzentrationen konnten tiefere Einblicke in die pH-abh{\"a}ngige Regulation der V-ATPase-Aktivit{\"a}t erlangt werden. Es konnte aufgezeigt werden, dass eine Abweichung des vakuol{\"a}ren pH-Wertes wesentlich st{\"a}rker auf die ATP-Bindungsaffinit{\"a}t und Transportkapazit{\"a}t des Enzyms wirkt, als {\"A}nderungen der Protonenkonzentration auf cytosolischer Seite. Daraus konnte abgeleitet werden, dass cytosolische bzw. luminale pH-{\"A}nderungen auf das gesamte Membran-durchquerende Enzym wirken und jeweils auf die andere Membranseite der V-ATPase weitergegeben werden. Zus{\"a}tzlich wurden die in dieser Arbeit erhobenen Daten zur V-ATPase im Rahmen einer Zusammenarbeit von Prof. Dr. Ingo Dreyer (Universidad Politecnica, Madrid, Spanien) f{\"u}r die Erstellung eines mathematischen Modells genutzt. Es untermauert einen R{\"u}ckkopplungsmechanismus der Protonenkonzentration auf die maximale Protonentransportrate (vmax) und die ATP-Affinit{\"a}t (Km) und schl{\"a}gt eine pH-abh{\"a}ngige Dissoziation der Protonen von der V-ATPase, auch unter ung{\"u}nstigen intrazellul{\"a}ren Bedingungen, vor. Die Ausweitung der Regulationsstudien unter Einbeziehung verschiedener Mutanten konnte in Zusammenarbeit mit Jun. Prof. Dr. Thorsten Seidel und Mitarbeitern (Universit{\"a}t Bielefeld, Deutschland) eine oxidative Inhibierung der V-ATPase-Aktivit{\"a}t durch den Wegfall von Disulfidbr{\"u}cken innerhalb des Pumpproteins erfassen und m{\"o}gliche Auswirkungen von Disulfidbindungen auf die Protonenkopplungsrate aufzeigen. Mit Hilfe von intrazellul{\"a}ren Mikroelektroden konnte im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit der Nachweis erbracht werden, dass vakuol{\"a}re Leitf{\"a}higkeiten von Atrichoblasten in A. thaliana durch Stressfaktoren - verursacht durch den Einstich von intrazellul{\"a}ren Mikroelektroden - deutliche Ver{\"a}nderungen zeigen. Durch die Kombination der Zwei-Elektroden-Spannungsklemme mit einem Fluoreszenz-Bildgebungsverfahren konnte eine Methode zur simultanen Aufzeichnung von Calcium{\"a}nderungen und elektrischen Membranleitf{\"a}higkeiten an Trichoblastenvakuolen entwickelt werden. Dadurch konnte in weiterf{\"u}hrenden Untersuchungen in vivo nachgewiesen werden, dass ein transienter Anstieg der cytosolischen Calciumkonzentration zu einer reversiblen Zunahme der Str{\"o}me von vakuol{\"a}ren Membranleitf{\"a}higkeiten f{\"u}hrt, deren unbekannter Ursprung allerdings bereits bekannten Transportproteinen noch zugeordnet werden muss.},
  subject      = {Ackerschmalwand},
  language  = {de}
}