@phdthesis{Eckart2006,
  author    = {Eckart, Martin},
  title     = {Analyse einer chromosomalen Deletion und Entdeckung einer neuartigen nicht-translatierten RNA in Staphylococcus epidermidis},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-21448},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2006},
  abstract  = {Staphylococcus epidermidis ist ein wichtiger Bestandteil der gesunden Hautflora des Menschen, gleichzeitig aber auch der h{\"a}ufigste Erreger nosokomialer Infektionen bei immunsupprimierten Patienten. Die Forschungsarbeiten haben sich in den vergangenen Jahren besonders auf Faktoren und Mechanismen konzentriert, welche zur Etablierung der Spezies als Pathogen beigetragen haben. Eine typische Eigenschaft klinischer Isolate ist die F{\"a}higkeit, auf k{\"u}nstlichen Oberfl{\"a}chen Biofilme zu bilden. Gegenstand der vorliegenden Arbeit war die Untersuchung der IS-vermittelten Genomflexibilit{\"a}t und der Vergleich der Genomstruktur nosokomialer und kommensaler Isolate von S. epidermidis. Dazu wurde eine 260 kb große spontane Deletion im Chromosom des Biofilm-bildenden Stammes S. epidermidis 307 sequenziert und annotiert, von der bekannt war, dass sie durch eine homologe Rekombination zweier IS256-Kopien ausgel{\"o}st wurde. Auf dem deletierten Fragment fanden sich neben dem ica-Operon zahlreiche potentielle Virulenz-assoziierte Gene. Das {\"u}berraschende Ergebnis dieser Analyse war jedoch die Identifizierung eines neuartigen SCC-Elementes, das den rechten Rand der Deletion begrenzt. Dies ist die erste Beschreibung eines SSC-Elementes mit einer CcrC-Rekombinase, dem das Methicillin-Resistenzgen mecA fehlt. In der N{\"a}he des Rekombinasegens fand sich S.-haemolyticus-spezifische DNA. Weitere Untersuchungen zeigten, dass das SCC-Element durch die IS256/Tn4001 -vermittelte Deletion in der Mutante verk{\"u}rzt wurde. Genomvergleiche ica-positiver und ica-negativer St{\"a}mme von S. epidermidis mittels Microarrays, sowie in-silico-Analysen zweier vollst{\"a}ndiger S.-epidermidis-Genome ergaben, dass sich kommensale und pathogene St{\"a}mme in nur wenigen Faktoren unterscheiden. Diese befinden sich jedoch fast alle in einer Region um den oriC, in dessen N{\"a}he auch die Insertionsstelle f{\"u}r die SCCmec-Inseln lokalisiert ist. Das deletierte DNA-Fragment von S. epidermidis 307 konnte ebenfalls dieser Region zugeordnet werden, die offenbar eine Zone hoher genomischer Flexibilit{\"a}t darstellt, in der fremde DNA integriert werden kann. Im Rahmen dieser Arbeit konnte außerdem gezeigt werden, dass das ica-Operon diesen variablen Genomabschnitt begrenzt. Die exakte Grenze zwischen ica-positiven und ica-negativen St{\"a}mmen bildet eine Thr-tRNA, die in einer 1,4 kb großen intergenischen Region stromabw{\"a}rts des icaR-Regulatorgens lokalisiert ist. In unmittelbarer Nachbarschaft konnte ein Transkript nachgewiesen werden, welches nur in ica-positiven S. epidermidis vorkommt. Gest{\"u}tzt auf bioinformatische Analysen wurden zun{\"a}chst die Polarit{\"a}t und L{\"a}nge des Transkriptes, sowie der korrespondierende Promotor experimentell bestimmt. Demnach handelt es sich um eine 487 nt lange RNA, die entgegengesetzt zur Thr-tRNA orientiert ist und mit dieser teilweise {\"u}berlappt. Da die Nukelotid-Sequenz weder eine Ribosomen- Bindungsstelle noch einen gr{\"o}ßeren Leserahmen aufweist, ist es sehr wahrscheinlich, dass es sich um eine nicht-translatierte RNA handelt. Qualitative RT-PCR-Experimente zeigten, dass die IGRica-RNA kostitutiv exprimiert wird. Spontane IS256 -Insertionsmutanten in der Promotorregion der IGRica-RNA wiesen ph{\"a}notypisch eine deutlich verminderte Biofilmbildung auf. Daher ist zu vermuten, dass die IGRica-RNA in die Regulation dieses wichtigen Virulenzfaktors involviert ist. In der vorliegenden Arbeit konnte weiterhin gezeigt werden, dass S. epidermidis das in vielen Spezies konservierte Hfq-Protein exprimiert, welches ein Bindungspartner und Chaperon f{\"u}r zahlreiche regulatorische RNAs darstellt. gel-shift-Experimente mit rekombinantem Hfq-Protein aus S. epidermidis ergaben jedoch keine nachweisbare Wechselwirkung der IGRica-RNA mit diesem Faktor in vitro. Insgesamt hat die Studie gezeigt, dass S. epidermidis eine Spezies mit einer außerordentlich hohen Genomflexibilit{\"a}t ist, die sich haupts{\"a}chlich in einer bestimmten Genomregion abspielt und f{\"u}r die IS-Elemente von besonderer Bedeutung sind. Die Identifizierung von DNA aus anderen Staphylokokken-Arten in dieser Region zeigt, dass S. epidermidis zu horizontalem Gentransfer {\"u}ber Speziesgrenzen hinweg in der Lage ist. Dies, sowie die Daten zur neuen SCC-Kassette, unterstreichen die Bedeutung von S. epidermidis als Reservoir f{\"u}r die Entwicklung neuartiger Resistenz- und Virulenzdeterminanten, die gerade im Krankenhausmilieu auf Spezies mit h{\"o}herem Virulenzpotential {\"u}bertragen werden k{\"o}nnen und so einen wichtigen Faktor f{\"u}r die anhaltende Problematik nosokomialer Infektionen mit S. aureus darstellen. Die Entdeckung einer RNA mit m{\"o}glicherweise regulatorischer Funktion ist der erste Faktor dieser Art, der - abgesehen von einigen phylogenetisch hoch konservierten RNAs - bisher in S. epidermidis nachgewiesen wurde. Die funktionale Analyse der IGRica-RNA und die Suche nach weiteren regulatorischen RNAs in Staphylokokken er{\"o}ffnen ein Forschungsfeld, das zum besseren Verst{\"a}ndnis der Lebensweise dieser bedeutenden Erreger beitragen kann.},
  subject      = {Staphylococcus epidermis},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Hennig2006,
  author    = {Hennig, Susanne},
  title     = {Modulation der Biofilmbildung in Staphylococcus epidermidis und funktionale Charakterisierung der IS256 Transposase},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-20984},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2006},
  abstract  = {Staphylokokken, insbesondere Staphylococcus aureus sowie der Koagulase-negative Staphylococcus epidermidis, haben sich in den letzten Jahren als dominante Erreger nosokomialer Infektionen etabliert. Diese erstaunliche Anpassung an eine neue {\"o}kologische Nische beruht bei S. epidermidis vor allem auf drei Faktoren: (i) der F{\"a}higkeit, Biofilme auf abiotischen Oberfl{\"a}chen auszubilden, (ii) dem Erwerb multipler Antibiotikaresistenzen und (iii) einer hohen genotypischen Variabilit{\"a}t. Ein markantes Beispiel f{\"u}r genotypische Variabilit{\"a}t ist die Phasenvariation der Biofilmbildung durch Insertion und pr{\"a}zise Exzision der Insertionssequenz IS256 aus dem ica-Operon. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde der „OFF-ON" Mechanismus der Phasenvariation, die pr{\"a}zise Exzision von IS256, untersucht. Dabei wurde demonstriert, dass IS256 inklusive der 8 bp target site Duplikation in einem Transposase-unabh{\"a}ngigen Prozess vollst{\"a}ndig aus dem Chromosom entfernt wird, ohne chromosomale Umordnungen oder neue Insertionen. Pr{\"a}zise Exzision war hingegen abh{\"a}ngig von der Integrit{\"a}t der target site Duplikationen. Auch nach Insertion von IS256-Derivaten auf einem Plasmidsystem (spc::IS256) konnte pr{\"a}zise Exzision Transposase-unabh{\"a}ngig erfolgen. Die Wahrscheinlichkeit der Exzision f{\"u}r die vollst{\"a}ndige IS256-Sequenz betrug in diesem System ca. 1x10-11 pro Generation und Zelle. Ab einer Verk{\"u}rzung der Mikrohomologien zwischen den 8 bp target site Duplikationen auf 6 bp war pr{\"a}zise Exzision nicht mehr nachweisbar. Bei Verk{\"u}rzung der IS256-Sequenz auf ca. 160 bp (target site Duplikation und inverted repeats blieben intakt) wurde die Wahrscheinlichkeit der pr{\"a}zisen Exzision ca. dreifach erh{\"o}ht. Diese Beobachtungen unterst{\"u}tzen die Hypothese, dass diese Form der illegitimen Rekombination durch replicational slippage verursacht wird. Gleichzeitig weisen die Daten darauf hin, dass bei der Phasenvariation durch IS256 Insertions- und Exzisionsh{\"a}ufigkeit im Ungleichgewicht stehen. W{\"a}hrend der Durchf{\"u}hrung der Experimente zur pr{\"a}zisen Exzision aus icaC wurden nach mehrt{\"a}giger Passage h{\"a}ufig Varianten isoliert, die trotz noch vorhandener icaC::IS256 Insertion starke Biofilmbildner waren. Derartige biofilmpositive, PIA-negative Phasenvarianten wiesen im Atomic force Mikroskop einen anderen Ph{\"a}notyp als der Wildtyp auf. Anstelle von f{\"a}diger extrazellul{\"a}rer Substanz wie beim Wildtyp wurde verst{\"a}rkt eine polymorphe, aus globul{\"a}ren Untereinheiten bestehende Matrix produziert. Im Gegensatz zum Wildtyp, der in einem vorrangig polysaccharidbasierten Biofilm wuchs, wurde dieser alternative Biofilm durch Proteinkomponenten vermittelt. Die Regulation des proteinogenen Biofilms unterschied sich vom PIA-Biofilm. Zugabe von 4 \% NaCl inhibierte den proteinogenen Biofilm vollst{\"a}ndig, w{\"a}hrend es im Wildtyp die Biofilmbildung induzierte. Zusatz von 3 \% Ethanol im Medium bewirkte eine wesentlich st{\"a}rkere Induktion der Biofilmbildung als beim Wildtyp. Die Transkriptmenge des accumulation associated protein, aap, war in der Phasenvariante im Vergleich zum Wildtyp erh{\"o}ht. Dies spiegelte sich auch auf Proteinebene in einer erh{\"o}hten Expression von Aap wider. Die Daten zeigen, dass S. epidermidis {\"u}ber einen alternativen Mechanismus der Biofilmbildung verf{\"u}gt, der zu einer Modulation der IS256-bedingten Phasenvariation der Biofilmbildung f{\"u}hren kann. Im dritten Teil dieser Arbeit wurde die spezifische DNA-Bindung der IS256 Transposase in vitro n{\"a}her charakterisiert. Dazu wurde die IS256 Transposase heterolog {\"u}berexprimiert und mittels eines N-terminalen Calmodulin binding tag CBP)gereinigt. Im Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSA) band die CBP-Transposase spezifisch an IRL bzw. IRR DNA-Fragmente, zeigte jedoch eine leicht erh{\"o}hte Affinit{\"a}t zum IRR. Durch Atomic force Mikroskopie ließ sich die Bindung der CBP-Transposase an die inverted repeats innerhalb eines circle junction DNA-Fragments sowie unspezifische DNA-Endbindung nachweisen. Deletionen innerhalb der DNA-Sequenz des linken und rechten inverted repeats und anschließende EMSA-Experimente demonstrierten, dass die Transposase den inneren Bereich der inverted repeats erkennt und bindet. EMSA-Experimente mit verk{\"u}rzten Transposasederivaten wiesen darauf hin, dass sich das DNA-Bindungsmotiv in der N-terminalen Dom{\"a}ne der Transposase befindet. Die identifizierte Proteinregion (Aa100-130) umfasste zwei a-Helices, getrennt durch einen kurzen turn, mit typischen Charakteristika eines Helix-turn-helix Motivs. Durch Punktmutationen wurden sechs konservierte Aminos{\"a}uren in diesem Bereich ausgetauscht und der Effekt im EMSA {\"u}berpr{\"u}ft. Austausch von L103 und L127 gegen den Helixbrecher Prolin hatte keinen Effekt auf das Bindungsverhalten. Die Mutationen Y111A, G114W, T117A und R118A hingegen f{\"u}hrten zu einer stark abgeschw{\"a}chten Bindung bzw. zum Verlust des Bindungsverm{\"o}gens. Damit wurde erstmals die DNA-Bindungsdom{\"a}ne eines Elements der IS256-Familie n{\"a}her beschrieben.},
  subject      = {Staphylococcus epidermis},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Loessner2002,
  author    = {L{\"o}ßner, Isabel},
  title     = {Die Rolle des bakteriellen Insertionselements IS256 bei der Modulation der Biofilmbildung in Staphylococcus epidermdis},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-3258},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2002},
  abstract  = {Staphylococcus epidermidis z{\"a}hlt zu den h{\"a}ufigsten Erregern nosokomialer Infektionen im Zusammenhang mit implantierten Fremdk{\"o}rpern. Diese Bakterien zeigen eine außergew{\"o}hnliche ph{\"a}notypische und genotypische Variabilit{\"a}t, von der auch die Expression wichtiger virulenz- und resistenzassoziierter Gene betroffen ist. M{\"o}glicherweise verf{\"u}gen Staphylokokken damit {\"u}ber Anpassungsstrategien, die sie f{\"u}r das {\"U}berleben unter wechselnden Umweltbedingungen ben{\"o}tigen. In der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle von bakteriellen Insertionssequenzen (IS) bei der Genomplastizit{\"a}t von Staphylococcus epidermidis untersucht. Im Mittelpunkt des Interesses stand dabei das Insertionselement IS256 und sein Einfluß auf die Biofilmbildung von Staphylococcus epidermidis. Die F{\"a}higkeit von S. epidermidis, an Oberfl{\"a}chen zu haften und Biofilme zu bilden ist von der Pr{\"a}senz und Expression des ica-Operons abh{\"a}ngig, das Enzyme f{\"u}r die Synthese eines Exopolysaccharids (PIA) kodiert. Die PIA-Produktion ist {\"a}ußerst variabel und hat damit Einfluß auf das Virulenz- und Kolonisierungsverhalten dieser Bakterien. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde gezeigt, daß die ver{\"a}nderliche PIA-Produktion bei S. epidermidis im wesentlichen auf drei Mechanismen zur{\"u}ckzuf{\"u}hren ist, an denen das IS-Element IS256 urs{\"a}chlich beteiligt ist. Zun{\"a}chst konnte durch den Vergleich der IS256-spezifischen Hybridisierungsmuster eines biofilmbildenden S. epidermidis-Wildtypstammes und dessen PIA-negativer Spontanvarianten gezeigt werden, daß die multiplen IS256-Kopien im Genom dieses Stammes außerordentlich aktiv sind. Die n{\"a}here Analyse der Varianten ergab bei einem Teil der PIA-negativen Abk{\"o}mmlinge umfangreiche IS256-vermittelte genomische Umordnungen als Ursache f{\"u}r den Verlust der Biofilmbildung. Eine weitere Gruppe von Biofilm-negativen Varianten wies IS256-Insertionen im ica-Gencluster auf. Die Verteilung der Insertionsstellen im ica-Operon ließ darauf schließen, daß es sich bei dem icaC-Gen um einen Hot-spot f{\"u}r die Integration von IS256 handelt. Solche ica::IS256-Insertionen konnten bereits in zahlreichen S. epidermidis St{\"a}mmen nachgewiesen werden. Da diese Insertionen reversibel sind, bilden sie eine wesentliche Ursache f{\"u}r die Phasenvariation der Biofilmbildung von S. epidermidis. Bei einer dritten Gruppe von Varianten konnten Deletionen verschieden großer DNA-Abschnitte im S. epidermidis-Chromosom beobachtet werden, die zu einem Verlust der ica-Gene und damit der F{\"a}higkeit, Biofilme auszubilden, f{\"u}hrte. Um die Frage zu kl{\"a}ren, welche Gene in der Umgebung des ica-Operons liegen und durch die Deletion von bis zu 250 kb-großen DNA-Fragmenten verloren gehen, wurde eine Cosmid-Genbank des S. epidermidis -Wildtypstammes erstellt. Die durch Nukleotidsequenzierung erhaltenen Informationen wurden mit der in der Genom-Datenbank zur Verf{\"u}gung stehenden Sequenz des 1. A ZUSAMMENFASSUNG 2 Referenzstammes S. epidermidis RP62A verglichen und in einer Genkarte zusammengefaßt. Neben einzelnen Unterschieden zwischen den beiden S. epidermidis-St{\"a}mmen fiel vor allem auf, daß mehrere der von der Deletion betroffenen Leseraster f{\"u}r Proteine mit {\"A}hnlichkeiten zu oberfl{\"a}chenassoziierten Proteinen kodieren, die an der Adh{\"a}renz der Bakterien beteiligt sein k{\"o}nnten. Daneben finden sich aber auch Leserahmen mit {\"A}hnlichkeiten zu Transportsystemen und zahlreiche mobile genetische Elemente. Diese Ergebnisse lassen vermuten, daß das ica-Operon von S. epidermidis m{\"o}glicherweise Teil einer Pathogenit{\"a}tsinsel ist. Die Analyse der Deletionsrandbereiche einer Mutante ergab, daß der Verlust von mehr als 200 kb DNA durch homologe Rekombination zwischen zwei IS256-Elementen vermittelt wurde, die im Wildtypstamm in gleicher Orientierung zueinander vorlagen. Da IS256 offensichtlich eine wichtige Rolle bei der Genomplastizit{\"a}t von S. epidermidis spielt, konzentrierte sich der zweite Teil der Arbeit auf die Aufkl{\"a}rung des Transpositionsmechanismus dieses IS-Elements. Dabei konnte gezeigt werden, daß IS256 eine alternative Transpositionsreaktion nutzt, die durch die Bildung zirkul{\"a}rer, extrachromosomaler DNA-Molek{\"u}le gekennzeichnet ist. Diese DNA-Zirkel bestehen aus einer vollst{\"a}ndigen IS256-Kopie, bei der die beiden Enden des Elementes durch eine variable Anzahl von Nukleotiden fremder DNA als Br{\"u}cke miteinander verbunden sind. Es konnte gezeigt werden, daß diese kurzen DNA-Abschnitte aus der Nachbarschaft der fr{\"u}heren IS256-Insertionsstelle stammen, wobei sowohl stromaufw{\"a}rts als auch stromabw{\"a}rts liegende Nukleotidsequenzen nachgewiesen wurden. Neben diesen vollst{\"a}ndigen IS256-Zirkeln wurden aber auch Molek{\"u}le gefunden, bei denen entweder das rechte oder das linke Ende von IS256 fehlten. Die Daten legen nahe, daß beide IS256-Enden an der Zirkelbildung teilnehmen k{\"o}nnen und im Unterschied zu anderen zirkelbildenden Insertionssequenzen, die Strangtransferreaktion w{\"a}hrend der Zirkularisierung mit geringer Spezifit{\"a}t verl{\"a}uft. Ringf{\"o}rmige IS256-Molek{\"u}le konnten sowohl in S. epidermidis als auch in rekombinanten S. aureus und E. coli-St{\"a}mmen nachgewiesen werden, was auf eine untergeordnete Rolle speziesspezifischer Faktoren bei diesem Prozeß schließen l{\"a}ßt. Dagegen konnte durch die Einf{\"u}hrung einer Mutation in das putative Transposasegen des Elementes gezeigt werden, daß dieses Genprodukt f{\"u}r die IS256-Zirkularisierung essentiell ist. Es ist zu vermuten, daß die Bildung zirkul{\"a}rer IS256-Molek{\"u}le die Voraussetzung f{\"u}r die pr{\"a}zise Exzision des Elementes w{\"a}hrend der Phasenvariation der Biofilmproduktion bildet. Außerdem ist die Generierung stabiler Mutationen durch das Zur{\"u}cklassen von Teilen der duplizierten Zielsequenz oder durch die Vermittlung kleinerer Deletionen w{\"a}hrend der Zirkelbildung vorstellbar. Dar{\"u}ber hinaus bilden die multiplen Kopien des Elementes im Genom Kreuzungspunkte f{\"u}r homologe Rekombinationsereignisse. IS256 stellt damit sehr wahrscheinlich einen wesentlichen Faktor f{\"u}r die Flexibilit{\"a}t des Genoms von S. epidermidis dar. Die detaillierte Aufkl{\"a}rung der molekularen Mechanismen, die die Transposition von IS256 beeinflussen, k{\"o}nnten daher wertvolle Einblicke in die genetischen Anpassungsstrategien dieses bedeutenden nosokomialen Pathogens geben.},
  subject      = {Staphylococcus epidermis},
  language  = {de}
}