@phdthesis{Weickert2023,
  author    = {Weickert, Anastasia},
  title     = {Theoretische Untersuchungen zur Aufkl{\"a}rung der reversiblen Hemmung durch kovalente Inhibitoren der Enzyme Golgi-alpha-Mannosidase und Rhodesain},
  doi       = {10.25972/OPUS-32818},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-328181},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2023},
  abstract  = {Die Entwicklung maßgeschneiderter Proteinliganden ist ein integraler Bestandteil unterschiedlicher wissenschaftlicher Disziplinen, wie z.B. Wirkstoffentwicklung. Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der reversiblen Inhibition in Form von kovalent gebundenen Enzym-Inhibitor-Komplexen der humanen Golgi-alpha-Mannosidase II (GM II) und der Cysteinprotease Rhodesain. Beide Enzyme sind erfolgversprechende Targets in der Bek{\"a}mpfung von zwei sehr unterschiedlichen Erkrankungen. Einerseits die Golgi-alpha-Mannosidase bei der Behandlung der Tumorprogression und andererseits die Cysteinprotease Rhodesain bei der Behandlung der Afrikanischen Schlafkrankheit. Die Arbeit an den zwei Enzymen unterteilt sich in zwei Teilprojekte. Die Entwicklung von maßgeschneiderten kovalent-reversiblen Inhibitoren f{\"u}r die genannten Enzyme wurde im Rahmen eines in-house entwickeltes Protokolls zwecks des rationalen Designs kovalenter Inhibitoren, durchgef{\"u}hrt. Dieses Protokoll basiert auf einer sich gegenseitig unterst{\"u}tzenden Zusammenarbeit zwischen Theorie und Experiment. Die vorliegende Arbeit befasst sich mit den theoretischen Untersuchungen mit Hilfe der quantenmechanischen (QM) als auch mit Hilfe der kombinierten quantenmechanisch/molek{\"u}lmechanischen (QM/MM) Methoden zu den genannten Enzymen. In einem ersten Schritt des Protokolls geht es um die Anwendung von Screeningverfahren. In einem Screening werden Leitstrukturen, zun{\"a}chst in L{\"o}sung (Schritt I), f{\"u}r eine weitere Untersuchung im Enzym (Schritt II) evaluiert. So k{\"o}nnen die Inhibitoren, f{\"u}r die experimentelle Mess- oder theoretische Dockingdaten vorhanden sind, als eine Leitstruktur betrachtet werden. Durch das Screening unter Verwendung der quantenmechanischen (QM-Modell) Methode kann eine Reihe von Inhibitoren nach einem sich konsistent ver{\"a}nderndem Muster erstellt werden und auf Bindungsparameter hin untersucht werden (Schritt I). Diese Parameter sind Reaktionsenergien und H{\"o}hen der Reaktionsbarriere einer Inhibitionsreaktion. Reaktionsenergien werden in dieser Betrachtung quantenmechanisch innerhalb der Born-Oppenheimer-(BO)-N{\"a}herung und im Rahmen des Konzeptes der Potentialhyperfl{\"a}chen (PES) als relative Energien zwischen den optimierten Geometrien der Produkte und der Edukte auf einer Potentialhyperfl{\"a}che f{\"u}r die Inhibitionsreaktion ermittelt. Die H{\"o}hen der Reaktionsbarrieren werden durch die relativen Energien zwischen den Geometrien der Edukte und der Zwischenstufen oder {\"U}bergangszust{\"a}nde abgesch{\"a}tzt. Unter Inhibitionsreaktion wird eine chemische Reaktion verstanden, bei der eine kovalente Bindung zwischen dem Inhibitormolek{\"u}l und den Aminos{\"a}uren in der aktiven Tasche eines Enzyms ausgebildet wird. F{\"u}r den Schritt I werden die Aminos{\"a}uren der aktiven Tasche durch kleine Molek{\"u}le, wie Essigs{\"a}ure und Methanthiol, angen{\"a}hert. Die kovalent-reversiblen Inhibitoren sollten in dieser Betrachtung nur leicht exotherme Reaktionen mit den relativen Energien im Bereich -5 bis -10 kcal/mol aufweisen. Der experimentelle Teil liefert w{\"a}hrenddessen die Synthese der neuen Inhibitoren und die Nachweise zur kovalenten Bindung mit Hilfe massenspektrometrischer Messungen (Schritt I). Die passenden Kandidaten aus dem ersten Schritt des Protokolls, d.h. Inhibitoren mit gew{\"u}nschten Bindungsparametern, werden durch die QM/MM-Berechnungen im Enzym (Schritt II) und durch die experimentellen Messungen an den Enzym-Inhibitor-Komplexen in Assays (Schritt II) analysiert. Die Untersuchungen f{\"u}r die Stufe II des Protokolls umfassen die Berechnungen der Reaktionsprofile und Minimumenergiereaktionspfade f{\"u}r die chemischen Reaktionen von Inhibitoren im Zielenzym. Ein Pfad minimaler potentieller Energie, der zwei Minima (hier Edukt und Produkt) verbindet, stellt ein Reaktionsprofil f{\"u}r eine chemische Reaktion dar. In der vorliegenden Arbeit wird dies auch als Minimumenergiepfad (MEP) bezeichnet. Der Letztere l{\"a}sst sich durch die Nudged Elastic Band (NEB)-Methode und mittels Potentialhyperfl{\"a}chen darstellen. Die Reversibilit{\"a}t der Inhibitoren wurde anhand der berechneten chemischen Reaktionen in Form von erstellten Reaktionsprofilen analysiert und diskutiert. Durch Protein-Ligand Docking (Schritt III) wird ein Screening von variierbaren Erkennungseinheiten der neuen Inhibitoren durchgef{\"u}hrt. Die Ergebnisse der Untersuchungen aus dem dritten Schritt liefern Hinweise zur Weiterentwicklung der ausgew{\"a}hlten Inhibitoren. Die letzte Stufe des in-house Protokolls besteht in der erneuten Untersuchung der optimierten Inhibitoren mit Hilfe von Theorie und Experiment (Schritt IV). Die theoretische Untersuchung anhand von QM/MM-Berechnungen {\"u}berpr{\"u}ft, ob die Inhibitionsreaktion der reaktiven Kopfgruppe nach der {\"A}nderung der Erkennungseinheit des Inhibitors weiterhin effektiv und nach dem gleichen Mechanismus mit der aktiven Seite des Enzyms ablaufen kann. Die experimentelle Untersuchung liefert, {\"a}hnlich wie im Schritt II, die messbaren Ergebnisse der Inhibition in Hinblick auf die Bindungseigenschaften und die Entstehung der Nebenprodukte. Die Untersuchungen am System Mannosidase GM II wurden in Zusammenarbeit mit den Arbeitskreisen von Prof.Dr. J. Seibel und Prof.Dr. T. Schirmeister durchgef{\"u}hrt. Die Leitstruktur zur Entwicklung des kovalent-reversiblen Inhibitors stellt der cyclische O,O-Acetal-Inhibitor (bestimmt anhand von Dockingexperimenten an der beta-L-Anhydrogulose durch Arbeitskreis Prof.Dr. J. Seibel) dar. Die Ergebnisse der theoretischen Studie liefern f{\"u}r den ersten Schritt im Rahmen des Protokolls den geeigneten Kandidaten aus einer Menge von insgesamt 22 modellierten Inhibitoren f{\"u}r die reversible Inhibition der Mannosidase GM II durch die Ausbildung einer kovalenten Bindung. Hierzu z{\"a}hlen zun{\"a}chst die thermodynamischen Modellberechnungen der Inhibitionsreaktion, welche die Reaktionsenergien f{\"u}r alle Kandidaten des Screenings liefern. Die Inhibitionsreaktion wird in diesem Schritt als Additionsreaktion von Essigs{\"a}ure an den Inhibitor-Kandidaten modelliert. F{\"u}r die Leitstruktur resultiert eine thermoneutrale Beschreibung der Reaktion mit Essigs{\"a}ure und dient im Weiteren als Referenz. Der Inhibitor Nr.7 (der cyclische N,O-Acetal-Inhibitor) zeigt mit -7,7 kcal/mol eine leicht exotherme Reaktion und somit eine bessere Triebkraft der untersuchten Reaktion im Vergleich zur Referenz. Die beiden Inhibitoren wurden dann f{\"u}r Stufe 2 des Protokolls untersucht, in der eine Analyse der Reaktionsprofile im Enzym mit Hilfe der QM/MM-Methodik durchgef{\"u}hrt wurde. Die Ergebnisse des zweiten Teils der Studie zeigen, dass der cyclische N,O-Acetal-Inhibitor eine deutlich bessere Affinit{\"a}t zur aktiven Seite der GM II im Vergleich zu seiner Leitstruktur aufweisen sollte. Dies zeigt sich auch in der deutlich h{\"o}heren Triebkraft der Inhibitionsreaktion von ca. -13 kcal/mol. Dieser Energiebeitrag ist klein genug, um eine Reversibilit{\"a}t der Inhibitionsreaktion gew{\"a}hrleisten zu k{\"o}nnen. Das bedeutet auch, dass der N,O-Acetal-Inhibitor im Vergleich zur Referenzstruktur eine deutlich st{\"a}rkere Inhibition bedingen sollte. Ber{\"u}cksichtigt man dann noch, dass die Reaktion laut Berechnungen nur leicht exotherm sein sollte, erh{\"a}lt man die M{\"o}glichkeit einer reversibel stattfinden kovalenten Hemmung. Zusammenfassend liefert dieser Teil der Arbeit, der mit Hilfe der QM- und QM/MM-Berechnungen durchgef{\"u}hrt wurde, ein reaktives molekulares Ger{\"u}st mit den gew{\"u}nschten Eigenschaften. Durch die theoretischen Untersuchungen (MD-Simulationen am Enzym-Inhibitor-Komplex) konnte außerdem eine zur Komplexbildung geeignete Konformation der Leitstruktur sowie des neuen Inhibitors gefunden werden. Die reversibel agierenden Acetal-Inhibitoren befinden sich in der aktiven Tasche in einer energetisch h{\"o}her liegenden Twist-Boot-Konformation und beg{\"u}nstigen mit zwei entstehenden Bindungen zum Zn2+-Ion die oktaedrische Koordination im Enzym. Als Teil dieser Arbeit wurden NEB-Berechnungen zur Bestimmung von Minimumenergiepfadendurchgef{\"u}hrt. Dies lieferte erweiterte Einblicke in der Berechnung von Reaktionsmechanismen jeweils auch in Kombination von 2- bzw. 3-dimensionalen Scans. Auch in der Beschreibung von Protonen{\"u}bertragungsreaktionen nach Grotthus, die einem Umklappen der kovalenten Bindungen entsprechen, erh{\"a}lt man hier Geometrien f{\"u}r die Teilschritte und somit eine detaillierte Beschreibung des Vorgangs. Der Mechanismus der Inhibition von GM II durch die Leitstruktur beinhaltet einen Wasser-katalysierten (oder auch Wasser-vermittelten) Ring{\"o}ffnungsschritt in der Tasche des Enzyms. Die Testrechnungen zum Protontransfer haben gezeigt, dass der Protontransfer {\"u}ber ein oder mehrere Wassermolek{\"u}le unter Verwendung von Standard-PES-Berechnungen nicht spontan stattfindet. Die Berechnung des MEP durch das Erstellen einer 3-dimensionalen Potentialhyperfl{\"a}che kann nur dann sinnvolle Ergebnisse liefern, wenn der Protontransfer vom Aspartat Asp341 zum Inhibitor {\"u}ber zwei Wassermolek{\"u}le explizit ber{\"u}cksichtigt wird. In diesem Fall ist die Berechnung der PES kein Standard und erfordert eine zus{\"a}tzliche Variation der Bindungsabst{\"a}nde O-H der beteiligten Molek{\"u}le des Protontransfers. Die Details f{\"u}r die zus{\"a}tzliche Variation der Bindungsabst{\"a}nde O-H bei der Berechnung der 3-dimensionalen PES haben die NEB-Berechnungen geliefert. Der NEB-Formalismus hat sich in der Beschreibung dieser komplexen Reaktionskoordinaten als besser geeignet erwiesen und wurde in dieser Arbeit aus diesem Grund haupts{\"a}chlich verwendet. Die Berechnung des Protonentransfers w{\"a}hrend einer Hemmungsreaktion durch zwei Wassermolek{\"u}le mit der NEB-Methode hat den MEP ermittelt, welcher zun{\"a}chst nicht auf der Grundlage eines 3-dimensionalen Scans ermittelt werden konnte. Solche QM/MM-Rechnungen wurden im Rahmen des in-house Protokolls zum ersten Mal durchgef{\"u}hrt. Dieser Protontransfer ist mit dem Grotthus-Mechanismus konform und kann plausibel anhand einer Klapp-Mechanismus-Betrachtung nachvollzogen werden. Mit Hilfe der NEB-Methode ist es m{\"o}glich MEPs effektiv und relativ schnell zu ermitteln. Es werden sowohl die Geometrien entlang des Pfades wie auch die einzelnen relativen Energien erhalten. Zur {\"U}berpr{\"u}fung der gefundenen {\"U}bergangszust{\"a}nde wurden die einzelnen Strukturen mit Hilfe der Normalmodenanalyse weiter untersucht und konnten verifiziert werden. Die MEP-Berechnungen f{\"u}r den Inhibitor Nr.1 erm{\"o}glichen die Etablierung eines Protokolls zur Berechnung eines Reaktionspfades {\"u}ber mehrere Molek{\"u}le, welches anschließend zur Berechnung des MEP f{\"u}r den Inhibitor Nr.7 angewendet wird. Das Protokoll beinhaltet in seiner einfachen Form die Ermittlung der Two-End-Komponenten einer chemischen Reaktion - Geometrien von Reaktant und Produkt. Betrifft dies eine Reaktion, die {\"u}ber mehrere Molek{\"u}le, z.B. Wassermolek{\"u}le oder deren Netzwerk, stattfindet, wird die Aufgabe komplexer. In diesem Fall ist eine Berechnung mit Hilfe des NEB-Moduls wesentlich produktiver als die Charakterisierung mit Hilfe der 3-dimensionalen PES. Der Vorteil liegt in der kollektiven Beschreibung der Reaktionskoordinaten, sodass die entscheidenden Reaktionskoordinaten und Variablen f{\"u}r die Durchf{\"u}hrung von Scans nicht einzeln bestimmt werden m{\"u}ssen. Dennoch kann es hier bei komplexen Reaktionskoordinaten auch zu Konvergenzproblemen bzw. zu langwierigen Optimierungszyklen kommen. Als weiteres Resultat liefern die durchgef{\"u}hrten MEP-Berechnungen Einblicke in die katalytischen Eigenschaften der Wassermolek{\"u}le f{\"u}r den Proton{\"u}bertragungsmechanismus nach Grotthus. Die Daten zeigen, dass die Barriere am niedrigsten wird, wenn zwei Wassermolek{\"u}le beim Protontransfer beteiligt sind. Wenn nur ein oder gar kein Wassermolek{\"u}l die Ring{\"o}ffnung katalysiert, steigt die Barriere auf 12 und 17 kcal/mol. Die Untersuchung in diesem Teil der Arbeit l{\"a}sst zudem Einblicke in die nukleophile Substitution der Vollacetale in der Enzym-Tasche der GM II erlangen. Die Rechnungen deuten darauf hin, dass die Vollacetal-Inhibitoren durch Wassermolek{\"u}le in der Tasche aktiviert werden. Die ausgebildeten Wasserstoffbr{\"u}ckenbindungen beg{\"u}nstigen die Geometrie des Enzym-Inhibitor-Komplexes. Dies bef{\"o}rdert die Ring{\"o}ffnungreaktion gleichzeitig mit dem nucleophilen Angriff des Aspartatrestes an dem C1-Atom des Inhibitors. Im Falle des gemischten Acetal-Inhibitors hingegen wird die Treibkraft bereits durch die Einf{\"u}hrung des Stickstoffatoms deutlich erh{\"o}ht. Durch die richtig angeordneten Grotthus-Wassermolek{\"u}le ist in diesem Fall die Barriere der Proton{\"u}bertragung durch das Aspartat-Aspartat-System der GM II (Asp341/Asp240) sekund{\"a}r. Betrachtet man die Schwingungsbewegung entlang der imagin{\"a}ren Moden der {\"U}bergangszust{\"a}nde, sind diese in beiden E-I-Komplexen {\"a}hnlich. Hierbei wird eine synergistische Bewegung der Bindungsabst{\"a}nde OD2-C1-O6 (Inhibitor Nr.1) bzw. OD2-C1-N (Inhibitor Nr.7) beobachtet. Die Entwicklung der kovalent-reversiblen Inhibitoren f{\"u}r das Enzym Rhodesain wurde in Zusammenarbeit mit dem Arbeitskreis Prof.Dr. T. Schirmeister durchgef{\"u}hrt. Als Leitstruktur zur Entwicklung des neuen kovalent-reversiblen Vinylsulfon-Inhibitors 4-Pyridyl-Phenylalanyl-Homophenylalanyl-alpha-Fluor-Phenylvinylsulfon dient in diesem Projekt der kovalent-irreversibel bindende Inhibitor K777, f{\"u}r den kristallographische Daten bekannt sind. Im Rahmen des Protokolls wurde eine Reihe von Inhibitoren untersucht, in denen ein alpha-H-Atom der Vinylsulfon-Einheit (im Weiteren VS f{\"u}r Vinylsulfon) durch verschiedene Gruppen X substituiert wurde. F{\"u}r den zun{\"a}chst vorgeschlagenen Cyano-Substituent (CN) in einem VS-Inhibitor ergab sich bei Berechnungen in einem polaren L{\"o}sungsmittel eine relativ niedrige Reaktionsenergie, d.h. es wurde eine reversible Reaktion vorhergesagt. Dies wurde experimentell best{\"a}tigt. Die theoretischen und experimentellen Ergebnisse von Schritt II widersprechen sich aber. W{\"a}hrend experimentell eine schwache reversible Hemmung gefunden wurde, sagten die Berechnungen keine Hemmung voraus. Tats{\"a}chlich zeigte sich im Nachhinein, dass die experimentell gefundene Hemmung nicht-kompetitiv ist, d.h. nicht in der aktiven Tasche stattfindet. Im Rahmen des Protokolls werden dagegen nur die kompetitiv interagierenden Inhibitoren ausgewertet. An dieser Stelle lassen sich die anhand theoretischen Methoden erhaltenen Daten {\"u}ber die Reversibilit{\"a}t der Hemmung (Reaktion im aktiven Zentrum) mit den Ergebnissen aus den experimentellen Untersuchungen (Reaktion außerhalb des aktiven Zentrums) nicht vergleichen. Durch den Wechsel von CN zu Halogenen wurde schließlich eine neue Reihe von Inhibitoren auf VS-Basis entwickelt. Die Berechnungen von Reaktionsenergien in L{\"o}sung und im Enzym haben f{\"u}r diese Inhibitoren eine reversible Hemmung vorhergesagt. Allerdings findet man eine einfache Additionsreaktion an der Doppelbindung der Vinylsulfon-Gruppe. F{\"u}r X=CN wurde von einer SN2-Reaktion ausgegangen. F{\"u}r X=Br fand man, dass sich nach der Addition ein HBr-Molek{\"u}l abspaltet, sodass die Hemmung insgesamt irreversibel ist. Da die Substitutionsreaktion ein irreversibler Prozess ist und die Freisetzung von Bromwasserstoff durch die experimentellen Untersuchungen best{\"a}tigt werden konnte, scheint Fluor ein geeigneter Substituent zu sein (X=F). Hier konnte man auch experimentell eine deutlich bessere Hemmung messen. Es wurden daher die Berechnungen im Enzym f{\"u}r Systeme mit den Inhibitoren K777-X mit X=F und X=H (K777-F- und K777-H-Inhibitor) durchgef{\"u}hrt und analysiert. In der vorliegenden Arbeit wurde versucht, die Reversibilit{\"a}t des K777-F-Inhibitors gegen die Irreversibilit{\"a}t des K777-H-Inhibitors durch die quantenmechanischen Berechnungen im Rahmen des Protokolls darzulegen. Die QM/MM-Berechnungen unterteilen sich in zwei Bereiche. Zun{\"a}chst wurde das Reaktionsprofil (auch Reaktionspfad) der Additionsreaktion des K777-X-Inhibitors an die aktive Tasche von Rhodesain ausgehend von der vorhandenen Kristallstruktur (PDB-Datei) berechnet. Im Folgenden wird dieses Teilergebnis als XP-Berechnung (im Weiteren XP f{\"u}r X-ray-Pfad) bezeichnet. Alle vier PES (X=H, F, Br und Cl) weisen prinzipiell die gleiche Form auf. Es ergeben sich aber Unterschiede in den berechneten Reaktionsenergien der Additionsreaktion (-20, -16, -10 und -11 kcal/mol). Die Reaktionsenergien der Substituenten Brom und Chlor entsprechen dem Bereich f{\"u}r reversible Reaktionen (ca. -10 kcal/mol), wobei Fluor mit -16 kcal/mol einen Grenzfall darstellt. Die Konturen der beiden PES (X=H vs. X=F) sind allerdings sehr {\"a}hnlich: In beiden F{\"a}llen findet sich f{\"u}r das anionische Intermediat kein Minimum. In der Potentialhyperfl{\"a}che f{\"u}r X=F steigt die Barriere der R{\"u}ckreaktion zwischen dem Intermediat und dem nicht-kovalenten Komplex auf etwa 5 kcal/mol an, die R{\"u}ckreaktion ist im Vergleich zu dem X=H mit ca. 1,5 kcal/mol leicht exotherm. Das ver{\"a}nderte Verh{\"a}ltnis zwischen der H{\"o}he der Reaktionsbarriere und dem Betrag der Reaktionsenergie (der {\"U}bergang von der endothermen zur exothermen Reaktion) auf diesem Abschnitt der PES k{\"o}nnte dazu beitragen, dass die Gesamtreaktion insgesamt reversibel ablaufen kann. Die Reversibilit{\"a}t des Inhibitors mit dem Substituenten Fluor l{\"a}sst sich auf diesem Schritt der Untersuchung durch die Absenkung der Reaktionsenergie der Additionsreaktion auf etwa 16 kcal/mol erkl{\"a}ren, denn die irreversible Reaktionen wurden bisher mit deutlich h{\"o}heren Reaktionsenergien assoziiert. Die erhaltenen nicht-kovalenten Enzym-Inhibitor-Komplexe der XP-Berechnungen wurden in einem zweiten Teilergebnis weiter verwendet, indem der Reaktionspfad der Additionsreaktion des K777-X-Inhibitors vom nicht-kovalenten Enzym-Inhibitor-Komplex zum kovalenten Enzym-Inhibitor-Komplex hin berechnet wurde. Im Folgenden wird dieses Teilergebnis als NP-Berechnung (NP f{\"u}r Nicht-kovalente-Pfad) bezeichnet. Die Berechnung der Reaktionsprofile der Additionsreaktion des VS-Inhibitors f{\"u}r X=H und X=F am alpha-Kohlenstoffatom der VS-Kopfgruppe lieferte konsistente Ergebnisse in Bezug auf die Reaktionsenergien. {\"A}hnlich den XP-Berechnungen, wurde ebenfalls die Tendenz der Absenkung der Reaktionsenergie von -7 kcal/mol (X=H) auf -4,3 (X=F) und -0,9 kcal/mol (X=Br) beobachtet. Die Thermodynamik der Additionsreaktion wurde durch einen Wechsel des Substituenten X von H nach F in der VS-Kopfgruppe des K777-X Inhibitors beeinflusst, indem die niedrigere Energiedifferenz zwischen den Edukten und den Produkten erzielt werden konnte. F{\"u}r beide Teile der Arbeit (XP- und NP-Berechnungen) implizierte dies einen Wechsel von einem irreversiblen zum einem reversiblen Verlauf in der Beschreibung der Reaktionsprofile. Die Ergebnisse des zweiten Teils der Arbeit (NP-Berechnungen) liefern nicht nur die konsistent geringeren Reaktionsenergien (Thermodynamik) sondern auch die h{\"o}heren Reaktionsbarrieren der Additionsreaktion im Vergleich zu den Ergebnissen der XP-Berechnungen. Die {\"A}nderungen der Reaktionsbarrieren im NP-Ansatz weisen zus{\"a}tzliche Diskrepanzen auf, wenn diese jeweils mittels der PES-Scan- und CI-NEB-Dimer-Methodik berechnet werden. W{\"a}hrend die Barriere des irreversiblen Inhibitors K11777 mit dem NEB-Ansatz ca. 11 kcal/mol betr{\"a}gt und durch den PES-Scan nur um 4 kcal/mol h{\"o}her liegt, ergibt sich eine umgekehrte Situation beim {\"U}bergang zu Fluor als Substituent: Durch die NEB-Berechnung liegt die Barriere bei ca. 18 kcal/mol und durch den PES-Scan ergibt sich eine um 4 kcal/mol niedrig liegende Barriere. Um die Ergebnisse der NP-Berechnungen zu {\"u}berpr{\"u}fen, wurden diese QM/MM-Rechnungen wiederholt durchgef{\"u}hrt. In den beiden neu durchgef{\"u}hrten Berechnungen f{\"u}r die Inhibitoren K777-X mit X=H und X=F wurden nur sehr kleine Abweichungen gefunden, die kleiner als die Fehler der Berechnung sind. Die Startstrukturen f{\"u}r die Berechnung des MEP stammten aus der erneut durchgef{\"u}hrten MD-Simulation an der Geometrie des nicht-kovalenten Enzym-Inhibitor-Komplexes, welche die XP-Berechnung resultierte. Die Gesamtdauer der MD-Simulation wurde zu einem Wert von 9 ns gew{\"a}hlt, welche insgesamt 900 Startstrukturen entlang der Simulation lieferte. Die Berechnung ergab die Reaktionsenergie von -8,4 kcal/mol (-7,0 kcal/mol als erstes Ergebnis) und die relative Energie des Int-Komplexes von 13,2 kcal/mol. Somit betr{\"a}gt die Barriere der R{\"u}ckreaktion zur Freisetzung des Inhibitors K11777 (X=H) in Form von einem nicht-kovalenten Enzym-Inhibitor-Komplex einen Wert von 21,6 kcal/mol. In analoger Vorgehensweise wurde die Evaluierung der NP-Berechnung f{\"u}r den Inhibitor K777-X mit X=F durchgef{\"u}hrt. Die Reaktionsenergien in den beiden Berechnungen unterscheiden sich in einem marginalen Abstieg zu den Werten von -2,9 kcal/mol und -3,3 kcal/mol (-4,3 kcal/mol als erstes Ergebnis). Beide Berechnungen liefern zudem die relativ kleinen Anstiege der Reaktionsbarriere zu den Werten von 19,8 kcal/mol und 20,9 kcal/mol. F{\"u}r die Inhibitoren K777-X mit X=H und X=F entsprechen die gefundenen Barrieren einer verzerrten Konformation des nicht-kovalenten Enzym-Inhibitor-Komplexes, die als eine bioaktive Konformation bezeichnet werden kann. Der anionische {\"U}bergangszustand Int*, der oft in der Literatur als ein anionisches Intermediat der Additionsreaktion bezeichnet wird, wurde nur f{\"u}r den Inhibitor mit dem Substituenten Brom (K777-X mit X=Br) identifiziert. Da der {\"U}bergangszustand (Int* mit der relativen Energie von 11,1 kcal/mol) nur 1,5 kcal/mol {\"u}ber der bioaktiven Konformation (Int mit der relativen Energie von 12,6 kcal/mol) liegt und die NEB-Reaktionspfade alleine die Barrieren {\"u}bersch{\"a}tzen, besitzen die anionischen {\"U}bergangszust{\"a}nde der Additionsreaktion der Inhibitoren mit X=H und X=F eine gesch{\"a}tzte relative Energie mit vergleichbaren Abweichungen von ca. 2 kcal/mol zu den identifizierten Int-Geometrien. Die durchgef{\"u}hrten Berechnungen zeigen, dass die Substituenten X=H und X=F im Vergleich zum Brom die anionischen Geometrien der nicht-kovalenten Enzym-Inhibitor-Komplexe jedoch mangelhaft bis ausreichend stabilisieren k{\"o}nnen. Zus{\"a}tzlich liegt die gesch{\"a}tzte Energiedifferenz zwischen den Geometrien Int* und Int unter der m{\"o}glichen Fehlergrenze der Berechnungen (ca. 3-4 kcal/mol). Aus diesem Grund misslang die Optimierung in Richtung der metastabilen anionischen Geometrien Int* mit Hilfe der CI-NEB-Dimer-Methodik im Fall der VS-Inhibitoren K777-X mit X=H und X=F. Der direkte Vergleich der geometrischen Parameter der nicht-kovalenten Enzym-Inhibitor-Komplexe f{\"u}r den Inhibitor K777-F aus den XP-Berechnungen mit solchen aus den NP-Berechnungen l{\"a}sst darauf schließen, dass die Geometrien der Enzym-Inhibitor-Komplexe der XP-Berechnung nur die lokalen Minima mit der verzerrten Geometrie des Inhibitors auf der PES darstellen und die Gesamtinformation {\"u}ber die Barrieren der Reaktion durch die Ergebnisse aus der NP-Berechnung erg{\"a}nzt werden sollten. Zusammenfassend sagen die Berechnungen f{\"u}r die reaktiven Kopfgruppen der Substanzklasse der halogenierten Vinylsulfone K777-X (X=Br, Cl und F) im Vergleich zur Leitstruktur des Vinylsulfon-Inhibitors K11777 deutlich geringere exotherme Additionsreaktionen im aktiven Zentrum von Rhodesain voraus. Dar{\"u}berhinaus konnte anhand der QM/MM-Berechnungen ein experimentell gemessenen verlangsamten Verlauf der reversiblen Inhibition im Falle von X=F (Inhibitor K777-X) durch die relativ erh{\"o}hte Reaktionsbarriere im Vergleich zur Leitstruktur erkl{\"a}rt werden. Dieser Inhibitor dient zun{\"a}chst als ein erfolgreich selektiertes reaktives Ger{\"u}st des neuen Inhibitors K777-X-S3 mit X=F und S3=4-Pyridyl (K777-F-Pyr), welcher mit Hilfe des Docking-Experiments (Schritt III durch die Arbeitsgruppe Prof.Dr. T. Schirmeister) deutlich verbessert werden konnte. Die Affinit{\"a}t des durch Docking verbesserten VS-Inhibitors mit Fluor als Substituent durch die eingef{\"u}hrte Seitenkette S3=4-Pyridyl (4-Pyridyl-Phenylalanyl-Homophenylalanyl-(Phenyl)-alpha-F-Vinylsulfon) stieg im Rhodesain von 190 nM zu 32 nM (Schritt IV, experimenteller Teil). Gleichzeitig konnte durch die QM/MM-Berechnungen in Schritt IV gezeigt werden, dass die Reaktion der reaktiven Kopfgruppe im neuen Inhibitor immer noch eine kovalent-reversible Hemmung von Rhodesain darstellt, auch wenn die Erkennungseinheit ge{\"a}ndert wurde. Hierf{\"u}r kann man die beiden Reaktionsprofile der NP-Berechnungen vergleichen. Die beiden fluorierten VS-Inhibitoren weisen eine {\"A}hnlichkeit bez{\"u}glich der Barrierenh{\"o}he und der Reaktionsenergie auf. Der fluorierte Vinylsulfon-Inhibitor K777-F wurde somit als ein neuer kovalent-reversibler Vinylsulfon-Inhibitor der Cysteinprotease Rhodesain erfolgreich eingef{\"u}gt.},
  subject      = {Computational Chemistry},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Peinz2016,
  author    = {Peinz, Ulrich},
  title     = {Strukturbasiertes computergest{\"u}tztes Wirkstoffdesign an flexiblen Proteintargets: Aldose Reduktase und Hsp70},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-147103},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2016},
  abstract  = {Proteine sind dynamische makromolekulare Systeme, die nativ in verschiedenen Konfor-mationen vorliegen. Besonders Proteine mit einer ausgepr{\"a}gten intrinsischen Flexibilit{\"a}t stellen als biologische Zielstrukturen f{\"u}r das computergest{\"u}tzte strukturbasierte Wirkstoff-design auch heute noch eine große Herausforderung dar. Die vorliegende Arbeit thematisiert die computergest{\"u}tzte Identifizierung neuer Liganden mit inhibitorischer Aktivit{\"a}t f{\"u}r zwei strukturell sehr flexible Enzyme, die bei verschiedenen Krankheiten eine pathophysio-logische Rolle spielen. Ein Schwerpunkt lag in diesem Zusammenhang auf der Entwicklung virtueller Screeningverfahren, die es erm{\"o}glichten, die Flexibilit{\"a}t der Proteine ad{\"a}quat zu ber{\"u}cksichtigen. Der erste Teil der Arbeit beschreibt ein virtuelles Screeningverfahren f{\"u}r die Identifizierung von Liganden einer neuen, durch Molekulardynamik (MD) Simulationen generierten Proteinkonformation der Aldose Reduktase (AR), einem Enzym, das im Zusammenhang mit der Entstehung von Folgeerkrankungen bei Diabetes mellitus steht. Die angewandte Vorgehensweise zeigt M{\"o}glichkeiten auf, wie eine ausgepr{\"a}gte Proteinflexibilit{\"a}t mit Hilfe computerbasierter Methoden im Rahmen eines virtuellen Screenings explizit ber{\"u}cksichtigt werden kann. Die Studie war auf der einen Seite hinsichtlich methodischer Aspekte von Interesse, da dadurch sowohl eine Beurteilung der Aussagekraft computergenerierter Proteinkonformationen, als auch eine {\"U}berpr{\"u}fung der prinzipiellen Eignung MD-generierter Enzymkonformationen als Template f{\"u}r strukturbasierten Ligandendesignstudien, erfolgen konnte. Auf der anderen Seite war diese Studie aufgrund einer m{\"o}glichen Erweiterung des bekannten Konformationsraumes der AR auch aus strukturbiologischer Sicht von Interesse. Bei der Suche nach geeigneten Liganden in Molek{\"u}ldatenbanken kommerziell erh{\"a}ltlicher Verbindungen wurde eine protein- und eine ligandbasierte Strategie verfolgt. Im Rahmen des proteinbasierten Ansatzes erfolgte zun{\"a}chst eine vergleichende Strukturanalyse verschiedener AR-Ligand-Komplexstrukturen, um Informationen hinsichtlich experimentell aufgekl{\"a}rter Bindemotive, Protein-Ligand-Interaktionen sowie bestehender struktureller Differenzen zwischen der MD-Konformation und anderen Bindetaschenkonformationen der AR zu sammeln. Anschließend wurde die Bindetasche der MD-generierten Proteinstruktur hinsichtlich g{\"u}nstiger Interaktionspunkte analysiert, um aus den Erkenntnissen Pharmako-phormodelle als Filter f{\"u}r die nachfolgenden virtuellen Datenbanksuchen zu entwickeln. Als Erg{\"a}nzung zum proteinbasierten Ansatz wurde eine ligandbasierte Strategie f{\"u}r die Identifizierung potenzieller Kandidatenmolek{\"u}le verfolgt. Dabei diente ein bekannter AR-Inhibitor als Templatstruktur, bei dem aufgrund zuvor durchgef{\"u}hrter Dockingexperimente die begr{\"u}ndete Annahme bestand, dass dieser die Bindetaschenform der MD-Proteinkonfor-mation stabilisieren k{\"o}nnte. Hierbei wurde zun{\"a}chst eine Molek{\"u}ldatenbank aus kommerziell erh{\"a}ltlichen Verbindungen, die alle {\"u}ber eine bestimmte Substruktur als Ankergruppe verf{\"u}gten, aufgebaut und anschließend durch Berechnung molekularer {\"A}hnlichkeiten zu der Templatstruktur auf m{\"o}gliche Kandidatenmolek{\"u}le durchsucht. Die virtuell identifizierten Molek{\"u}le der beiden Ans{\"a}tze wurden im Anschluss mit Hilfe von Dockingsimulationen in die Bindetasche der MD-generierten Proteinkonformation gedockt und die berechneten Bindeposen mit einem Re- und Consensus-Scoringverfahren bewertet. Im n{\"a}chsten Schritt erfolgte eine Untersuchung der Selektivit{\"a}t der Kandidatenmolek{\"u}le anhand eines Cross-Dockingexperiments an verschiedenen Bindetaschenkonformationen der AR. Auf der Grundlage aller durch das virtuelle Screeningverfahren gesammelten Informationen wurde eine finale Molek{\"u}lauswahl getroffen und sechs kommerziell verf{\"u}gbare Molek{\"u}le f{\"u}r experimentelle Untersuchungen bezogen. Die experimentelle Bestimmung der Enzyminhibition wurde dabei von Kooperationspartnern mit Hilfe eines in vitro Assays untersucht. Aufgrund einer unzureichenden L{\"o}slichkeit von vier Substanzen unter den Assaybedingungen konnte lediglich das Inhibitionspotenzial von zwei Verbindungen untersucht werden. Eine der Verbindungen zeigte bemerkenswerterweise eine inhibitorische Aktivit{\"a}t im einstelligen mikromolaren Bereich. Eine finale Beurteilung, ob die Zielsetzung dieser Studie, eine neue computergenerierte Bindetaschenkonformation der AR experi-mentell zug{\"a}nglich zu machen, durch die vorgeschlagenen Verbindungen erf{\"u}llt werden konnte, konnte zum Zeitpunkt der Anfertigung der Dissertation aufgrund ausstehender Kristallstrukturen der jeweiligen AR-Ligand-Komplexe nicht erfolgen und bleibt das Ziel zuk{\"u}nftiger Arbeiten. Die Studie zeigte jedoch deutlich, dass nicht nur experimentell aufgekl{\"a}rte Proteinstrukturen sondern auch die Nutzung von mit Hilfe computerbasierter Verfahren, wie z.B. mittels MD Simulationen, berechneter Proteinkonformationen als Templatstrukturen f{\"u}r die Identifi-zierung neuer Liganden hilfreich sein kann und daher deren Verwendung f{\"u}r diese Zielsetzung ihre Berechtigung hat. Der zweite Teil der Arbeit handelt von der computergest{\"u}tzten Identifizierung nieder-molekularer Liganden einer neuen potenziellen Bindestelle der biologischen Zielstruktur Hitzeschockprotein 70 (Hsp70), als eine neuartige Klasse von Hsp70-Inhibitoren. Hsp70 spielt eine pathophysiologische Rolle bei verschiedenen Krebserkrankungen sowie diversen weiteren Erkrankungen, wie z.B. neurodegenerativen Erkrankungen und Infektions-krankheiten. Bei der neuen potenziellen Bindestelle, die im Rahmen der vorliegenden Arbeit n{\"a}her untersucht wurde, handelte es sich um das Interdom{\"a}neninterface, der Schnittstelle zwischen der Nukleotid- und Substratbindedom{\"a}ne von Hsp70. Zum Zeitpunkt der Arbeit waren keine Liganden dieser Proteinregion in der Literatur beschrieben, weshalb es zun{\"a}chst galt, die Hypothese der Adressierbarkeit dieser Zielregion durch niedermolekulare Liganden zu verifizieren. Hierf{\"u}r wurde ein virtuelles Screening durchgef{\"u}hrt, bei dem protein- sowie ligandbasierte Suchstrategien zum Einsatz kamen. Im Rahmen des proteinbasierten Ansatzes erfolgte zun{\"a}chst eine Analyse der Hsp70 Terti{\"a}r-struktur auf potenziell vorhandene Ligandenbindestellen. Im Anschluss wurde das Interdom{\"a}neninterface auf g{\"u}nstige Interaktionspunkte f{\"u}r bestimmte Atomtypen und funktionelle Gruppen zuk{\"u}nftiger Liganden untersucht. Basierend auf diesen Informationen wurde ein Pharmakophormodell als Filter f{\"u}r nachfolgende virtuelle Datenbanksuchen entwickelt. Bei dem ligandbasierten Ansatz fungierte der bekannte Hsp70-Ligand Apoptozol als Templatstruktur f{\"u}r die virtuelle Datenbanksuche, da die Ergebnisse eines vorab durchge-f{\"u}hrten Cross-Dockingexperiments deutlich auf eine Bindung des Molek{\"u}ls an das Interdom{\"a}neninterface hinwiesen. Diese Dockingstudie lieferte erste wertvolle Hinweise hinsichtlich der Bindestelle und potenzieller Bindemodi des Molek{\"u}ls an Hsp70. Im Anschluss an die virtuellen Datenbanksuchen wurden die identifizierten Kandidaten-molek{\"u}le hinsichtlich m{\"o}glicher Bindemodi und Bindungsaffinit{\"a}ten mittels Docking-simulationen in Verbindung mit einem Re- und Consensus-Scoringverfahren untersucht. Abschließend wurden neun ausgew{\"a}hlte Kandidatenmolek{\"u}le von kommerziellen Anbietern bezogen und mit Hilfe von in vitro Assays von Kooperationspartnern innerhalb der Klinischen Forschergruppe 216 auf ihre zytotoxische Aktivit{\"a}t gegen{\"u}ber Multiplen Myelomzellen untersucht. Dabei konnte f{\"u}r f{\"u}nf der neun getesteten Verbindungen bereits bei Konzentrationen im ein- bzw. zweistelligen mikromolaren Bereich eine Aktivit{\"a}t gemessen werden, was einer formalen Trefferquote von 56\% entspricht. Weiterhin wurde und wird in Folgearbeiten von Kooperationspartnern versucht, eine Bindung der ausgew{\"a}hlten Kandidatenmolek{\"u}le an Hsp70 n{\"a}her zu charakterisieren und sowohl am separierten Protein, als auch in der Targetzelle nachzuweisen. Dar{\"u}ber hinaus wurde zus{\"a}tzlich ein fragmentbasierter Ansatz, basierend auf einer bestimmten Substruktur, die als eine Art Ankergruppe fungieren sollte, verfolgt. Dabei diente bei der virtuellen Suche in Molek{\"u}ldatenbanken kommerzieller Anbieter ein Molek{\"u}lfragment als Suchanfrage. Aus dem identifizierten Molek{\"u}lsatz wurden Verbindungen unterschied-lichster struktureller Klassen f{\"u}r nachfolgende Dockingexperimente ausgew{\"a}hlt. Die berechneten Bindeposen wurden einem Re-Scoringverfahren f{\"u}r eine zus{\"a}tzliche Absch{\"a}tzung der Bindungsaffinit{\"a}t unterzogen. Schließlich wurden die f{\"u}nf vielver-sprechendsten Verbindungen f{\"u}r nachfolgende experimentelle Untersuchungen kommerziell bezogen. Die Ergebnisse der nachfolgenden r{\"o}ntgenkristallographischen Aufkl{\"a}rung der Protein-Ligand-Komplexe lagen bei der Anfertigung der vorliegenden Dissertation noch nicht abschließend vor und sind Bestandteil aktueller Forschungarbeiten. Mit den durchgef{\"u}hrten virtuellen Screeningverfahren konnten erstmals potenzielle Liganden des Hsp70-Interdom{\"a}neninterfaces als eine neuartige Klasse von Hsp70-Inhibitoren identifiziert werden. Weiterhin k{\"o}nnen die identifizierten, zytotoxisch aktiven Verbindungen als Leitstrukturen zuk{\"u}nftiger Inhibitordesignstudien dienen, mit dem Ziel sowohl die Zytotoxizit{\"a}t dieser Molek{\"u}le zu optimieren, als auch Struktur-Wirkungsbeziehungen f{\"u}r die Entwicklung von Inhibitoren mit verbesserten biologischen Aktivit{\"a}tsprofilen abzuleiten. Ein weiterer Schwerpunkt der Arbeit lag auf der computerbasierten Charakterisierung der Proteinflexibilit{\"a}t von Hsp70 mit Hilfe von MD Simulationen. In diesem Zusammenhang erfolgte eine Untersuchung intrinsischer Proteinbewegungen sowie des Konformations-raumes anhand von verschiedenen Hsp70-Enzymstrukturen. Die durchgef{\"u}hrten MD Simulationen waren zum Zeitpunkt der Arbeit die ersten Untersuchungen dieser Art, die nicht nur an einer einzelnen Dom{\"a}ne, sondern an ganzen Zweidom{\"a}nenstrukturen von Hsp70 erfolgten. Die generierten Trajektorien best{\"a}tigten die {\"u}berdurchschnittlich hohe Flexibilit{\"a}t der Zielstruktur Hsp70. Die im Rahmen der Studie identifizierten, zum Zeitpunkt der Arbeit noch nicht beschriebenen Proteinkonformere erweiterten das Spektrum der bekannten Hsp70-Proteinkonformationen erheblich und lieferten m{\"o}gliche Enzymkonformationen, die als Templatstrukturen f{\"u}r zuk{\"u}nftige strukturbasierte Wirkstoffdesignstudien dienen k{\"o}nnen. Dar{\"u}ber hinaus st{\"u}tzten die Beobachtungen die Hypothese der prinzipiellen Eignung des Interdom{\"a}neninterfaces von Hsp70 als eine Bindestelle f{\"u}r neue Inhibitoren. Auf der Grundlage der gewonnenen Informationen war es weiterhin m{\"o}glich, eine erste Hypothese hinsichtlich eines potenziellen inhibitorischen Wirkmechanismus der Liganden des Interdom{\"a}neninterfaces zu formulieren. Abschließend l{\"a}sst sich festhalten, dass durch die vorliegende Arbeit viele neue strukturbiologische Erkenntnisse {\"u}ber Hsp70 gewonnen wurden. Dennoch besteht weiterer Forschungsbedarf, um die Strukturbiologie von Hsp70 umfassend aufzukl{\"a}ren. M{\"o}glicher-weise k{\"o}nnen in zuk{\"u}nftigen Studien Enzymstrukturen aufgekl{\"a}rt werden, die die Existenz der in silico erzeugten und in der Arbeit beschriebenen Proteinkonformere best{\"a}tigen.},
  subject      = {Arzneimittelforschung},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Zilian2014,
  author    = {Zilian, David},
  title     = {Neuartige, empirische Scoring-Modelle f{\"u}r Protein-Ligand-Komplexe und computergest{\"u}tzte Entwicklung von Hsp70-Inhibitoren},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-105055},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2014},
  abstract  = {Techniken des computergest{\"u}tzten Wirkstoffdesigns spielen eine wichtige Rolle bei der Entwicklung neuer Wirkstoffe. Die vorliegende Arbeit befasst sich sowohl mit der Entwicklung als auch mit der praktischen Anwendung von Methoden des strukturbasierten Wirkstoffdesigns. Die Arbeit glieder sich daher in zwei Teile. Der erste Teil besch{\"a}ftigt sich mit der Entwicklung von empirischen Scoring-Funktionen, die eine Schl{\"u}sselrolle im strukturbasierten computergest{\"u}tzen Wirkstoffdesign einnehmen. Grundlage dieser Arbeiten sind die empirischen Deskriptoren und Scoring-Funktionen aus dem SFCscore-Programmpaket. Dabei wurde zun{\"a}chst untersucht, wie sich die Zusammensetzung der Trainingsdaten auf die Vorhersagen von empirischen Scoring-Funktionen auswirkt. Durch die gezielte Zusammenstellung eines neuen Trainingsdatensatzes wurde versucht, die Spannweite der Vorhersagen zu vergr{\"o}ßern, um so vor allem eine bessere Erkennung von hoch- und niedrig-affinen Komplexen zu erreichen. Die resultierende Funktion erzielte vor allem im niedrig-affinen Bereich verbesserte Vorhersagen. Der zweite Themenkomplex besch{\"a}ftigt sich ebenfalls mit der verbesserten Separierung von aktiven und inaktiven Verbindungen. Durch den Einsatz der Machine Learning-Methode RandomForest wurden dazu Klassifizierungsmodelle abgeleitet, die im Unterschied zu den klassischen Scoring-Funktionen keinen genauen Score liefern, sondern die Verbindungen nach ihrer potentiellen Aktivit{\"a}t klassifizieren. Am Beispiel des mykobakteriellen Enzyms InhA konnte gezeigt werden, dass derartige Modelle den klassischen Scoring-Funktionen im Bezug auf die Erkennung von aktiven Verbindungen deutlich {\"u}berlegen sind. Der RandomForest-Algorithmus wurde im n{\"a}chsten Schritt auch verwendet, um eine neue Scoring-Funktion zur Vorhersage von Bindungsaffinit{\"a}ten abzuleiten. Diese Funktion wurde unter dem Namen SFCscoreRF in das SFCscore-Programmpaket implementiert. Die Funktion unterschiedet sich in einigen wesentlichen Punkten von den urspr{\"u}nglichen SFCscore-Funktionen. Zum einen handelt es sich beim RF-Algorithmus um eine nicht-lineare Methode, die im Unterschied zu den klassischen Methoden, die zur Ableitung von Scoring-Funktionen eingesetzt werden, nicht von der Additivit{\"a}t der einzelnen Deskriptoren ausgeht. Der Algorithmus erlaubt außerdem die Verwendung aller verf{\"u}gbaren SFCscore-Deskriptoren, was eine deutlich umfassendere Repr{\"a}sentation von Protein-Ligand-Komplexen als Grundlage des Scorings erm{\"o}glicht. F{\"u}r die Ableitung von SFCscoreRF wurden insgesamt 1005 Komplexe im Trainingsdatensatz verwendet. Dieser Datensatz ist somit einer der gr{\"o}ßten, die bisher f{\"u}r die Ableitung einer empirischen Scoring-Funktion verwendet wurden. Die Evaluierung gegen zwei Benchmark-Datens{\"a}tze ergab deutlich bessere Vorhersagen von SFCscoreRF im Vergleich zu den urspr{\"u}nglichen SFCscore-Funktionen. Auch im internationalen Vergleich mit anderen Scoring-Funktion konnten f{\"u}r beide Datens{\"a}tze Spitzenwerte erreicht werden. Weitere ausgiebige Testungen im Rahmen einer Leave-Cluster-Out-Validierung und die Teilnahme am CSAR 2012 Benchmark Exercise ergaben, dass auch SFCscoreRF Performanceschwankungen bei der Anwendung an proteinspezifischen Datens{\"a}tzen zeigt - ein Ph{\"a}nomen, dass bei Scoring-Funktionen immer beobachtet wird. Die Analyse der CSAR 2012-Datens{\"a}tze ergab dar{\"u}ber hinaus wichtige Erkenntnisse im Bezug auf Vorhersage von gedockten Posen sowie {\"u}ber die statistische Signifikanz bei der Evaluierung von Scoring-Funktionen. Die Tatsache, dass empirische Scoring-Funktionen innerhalb eines bestimmten chemischen Raums trainiert wurden, ist ein wichtiger Faktor f{\"u}r die protein-abh{\"a}ngigen Leistungsschwankungen, die in dieser Arbeit beobachtet wurden. Verl{\"a}ssliche Vorhersagen sind nur innerhalb des kalibrierten chemischen Raums m{\"o}glich. In dieser Arbeit wurden verschiedene Ans{\"a}tze untersucht, mit denen sich diese ``Applicability Domain'' f{\"u}r die SFCscore-Funktionen definieren l{\"a}sst. Mit Hilfe von PCA-Analysen ist es gelungen die ``Applicability Domain'' einzelner Funktionen zu visualisieren. Zus{\"a}tzlich wurden eine Reihe numerischer Deskriptoren getestet, mit den die Vorhersageverl{\"a}sslichkeit basierend auf der ``Applicability Domain'' abgesch{\"a}tzt werden k{\"o}nnte. Die RF-Proximity hat sich hier als vielversprechender Ausgangspunkt f{\"u}r weitere Entwicklungen erwiesen. Der zweite Teil der Arbeit besch{\"a}ftigt sich mit der Entwicklung neuer Inhibitoren f{\"u}r das Chaperon Hsp70, welches eine vielversprechende Zielstruktur f{\"u}r die Therapie des multiplen Myeloms darstellt. Grundlage dieser Arbeiten war eine Leitstruktur, die in einer vorhergehenden Arbeit entdeckt wurde und die vermutlich an einer neuartigen Bindestelle in der Interface-Region zwischen den beiden großen Dom{\"a}nen von Hsp70 angreift. Die Weiterentwicklung und Optimierung dieser Leitstruktur, eines Tetrahydroisochinolinon-Derivats, stand zun{\"a}chst im Vordergrund. Anhand detaillierter Docking-Analysen wurde der potentielle Bindemodus der Leitstruktur in der Interfaceregion von Hsp70 untersucht. Basierend auf diesen Ergebnissen wurde eine Substanzbibliothek erstellt, die von Kooperationspartnern innerhalb der KFO 216 synthetisiert und biologisch getestet wurde. Die Struktur-Wirkungsbeziehungen, die sich aus diesen experimentellen Daten ableiten lassen, konnten teilweise gut mit den erstellten Docking-Modellen korreliert werden. Andere Effekte konnten anhand der Docking-Posen jedoch nicht erkl{\"a}rt werden. F{\"u}r die Entwicklung neuer Derivate ist deswegen eine umfassendere experimentelle Charakterisierung und darauf aufbauend eine Verfeinerung der Bindungsmodelle notwendig. Strukturell handelt es sich bei Hsp70 um ein Zwei-Dom{\"a}nen-System, dass verschiedene allostere Zust{\"a}nde einnehmen kann. Um die Auswirkungen der daraus folgenden Flexibilit{\"a}t auf die Stabilit{\"a}t der Struktur und die Bindung von Inhibitoren zu untersuchen, wurden molekulardynamische Simulationen f{\"u}r das Protein durchgef{\"u}hrt. Diese zeigen, dass das Protein tats{\"a}chlich eine {\"u}berdurchschnittlich hohe Flexibilit{\"a}t aufweist, die vor allem durch die relative Bewegung der beiden großen Dom{\"a}nen zueinander dominiert wird. Die Proteinkonformation die in der Kristallstruktur hscaz beobachtet wird, bleibt jedoch in ihrer Grundstruktur in allen vier durchgef{\"u}hrten Simulationen erhalten. Es konnten hingegen keine Hinweise daf{\"u}r gefunden werden, dass die Mutationen, welche die f{\"u}r die strukturbasierten Arbeiten verwendete Kristallstruktur im Vergleich zum Wildtyp aufweist, einen kritischen Einfluss auf die Gesamtstabilit{\"a}t des Systems haben. Obwohl die Interface-Region zwischen NBD und SBD also in allen Simulationen erhalten bleibt, wird die Konformation in diesem Bereich doch wesentlich durch die Dom{\"a}nenbewegung beeinflusst und variiert. Da dieser Proteinbereich den wahrscheinlichsten Angriffspunkt der Tetrahydroisochinolinone darstellt, wurde der Konformationsraum detailliert untersucht. Wie erwartet weist die Region eine nicht unerhebliche Flexibilit{\"a}t auf, welche zudem, im Sinne eines ``Induced-Fit''-Mechanismus, durch die Gegenwart eines Liganden (Apoptozol) stark beeinflusst wird. Es ist daher als sehr wahrscheinlich anzusehen, dass die Dynamik der Interface-Region auch einen wesentlichen Einfluss auf die Bindung der Tetrahydroisochinolinone hat. Molekuardynamische Berechnungen werden deswegen auch in zuk{\"u}nftige Arbeiten auf diesem Gebiet eine wichtige Rolle spielen. Die Analysen zeigen zudem, dass die Konformation der Interface-Region eng mit der Konformation des gesamten Proteins - vor allem im Bezug auf die relative Stellung von SBD und NBD zueinander - verkn{\"u}pft ist. Das untermauert die Hypothese, dass die Interface-Bindetasche einen Angriffspunkt f{\"u}r die Inhibtion des Proteins darstellt.},
  subject      = {Arzneimittelforschung},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Schauer2011,
  author    = {Schauer, Stefanie},
  title     = {Untersuchungen zu Cyclodextrinkomplexen von typischen nichtsteroidalen Antiphlogistika},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-69701},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2011},
  abstract  = {Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden die Wechselwirkungen zwischen nat{\"u}rlichen Cyclodextrinen und den Substanzen Ibuprofen, Ketoprofen, Naproxen, Flurbiprofen, Felbinac und Fenbufen aus der Gruppe der nichtsteroidalen Antiphlogistika charakterisiert. Ausgehend davon sollte beurteilt werden, ob anhand der Grundstruktur oder der funktionellen Gruppen eines Gastes vorhergesagt werden kann, in welchem Ausmaß solche Wechselwirkungen auftreten und welche Struktur die sich bildenden Komplexe aufweisen. Alle Substanzen weisen die st{\"a}rksten Wechselwirkungen in w{\"a}ssriger L{\"o}sung mit β-Cyclodextrin auf. Lediglich Flurbiprofen bildet auch mit γ-Cyclodextrin in gr{\"o}ßerem Umfang Komplexe. F{\"u}r die Mehrzahl der Gastmolek{\"u}le werden Isothermen vom Bs-Typ, f{\"u}r Fenbufen und Naproxen hingegen A-Typ-Isothermen erhalten. Durch die gute L{\"o}slichkeit der Komplexe kann eine deutliche L{\"o}slichkeitssteigerung f{\"u}r diese beiden Gastmolek{\"u}le in Wasser erreicht werden. Der Vorgang der Komplexbildung ist f{\"u}r alle Gastsubstanzen ein spontan ablaufender Prozess. Die Assoziationskonstanten K1:1 bei 25°C bewegen sich zwischen 1000 M-1 und 5000 M-1, f{\"u}r Flurbiprofen betr{\"a}gt sie etwa 14000 M-1 und f{\"u}r Ibuprofen sogar {\"u}ber 40000 M-1. Eine Betrachtung des Oktanol-Wasser-Verteilungskoeffizienten legt nahe, dass die Lipophilie der Gastmolek{\"u}le eine entscheidende Gr{\"o}ße f{\"u}r das Ausmaß der Komplexbildung darstellen k{\"o}nnte. Eine Untersuchung bei variierenden pH-Werten zeigte, dass steigende pH-Werte und ein damit erh{\"o}hter Dissoziationsgrad der Gastmolek{\"u}le durchgehend zu abnehmenden Assoziationskonstanten f{\"u}hrten. L{\"o}slichkeitsstudien bei verschiedenen Temperaturen zeigten entgegen des erwarteten Absinkens der Assoziationskonstanten mit steigender Temperatur keine eindeutige Tendenz. F{\"u}r Naproxen und Ketoprofen konnten lineare Van't Hoff Plots erstellt werden. Kalorimetrische Versuche lieferten f{\"u}r Ibuprofen erg{\"a}nzende Werte f{\"u}r die Assoziationskonstante und die Gibbs'sche Freie Enthalpie, die mit den Ergebnissen der L{\"o}slichkeitsstudien vergleichbar waren. Danach ist die Komplexbildung f{\"u}r diese Stoffe enthalpie- und entropiegetrieben. Job's Plots deuten auf eine St{\"o}chiometrie von 1:1 f{\"u}r Ibuprofen, Flurbiprofen und Felbinac hin. Obwohl es in der Literatur Hinweise darauf gibt, dass f{\"u}r die anderen Molek{\"u}le dieselbe St{\"o}chiometrie vorliegt, sind nach den Ergebnissen auch Komplexe h{\"o}herer Ordnung m{\"o}glich. Mit Hilfe von Docking-Studien konnten plausible Komplexstrukturen erhalten werden. Sie deuten auf das Auftreten eines Induced-Fit's des Cyclodextrins und die Ausbildung von intermolekularen Wasserstoffbr{\"u}ckenbindungen hin. Verschiedene Techniken wurden angewendet, um feste Komplexzubereitungen herzustellen, um weitere Informationen {\"u}ber die gebildeten Komplexe im festen Zustand zu erhalten. Mittels thermoanalytischer Verfahren wurde versucht, den im Cyclodextrin eingeschlossenen Gastmolek{\"u}lanteil zu bestimmen. In lyophilisierten L{\"o}sungen lag der noch als ungebunden detektierbare Wirkstoffanteil meistens am niedrigsten. FT-IR-Spektren der Komplexzubereitungen und ihrer physikalischen Mischungen zeigten, dass auch im festen Zustand meist Einschlusskomplexe gebildet werden, bei denen der aromatische Teil des Gastes und die Carbonylgruppe in der Cyclodextrinkavit{\"a}t lokalisiert sind. Lediglich Felbinac weist ein davon abweichendes Verhalten auf. Diese Erkenntnisse werden meist durch die Ergebnisse der zweidimensionalen 1H-NMR-Studien best{\"a}tigt, die Einblick in die Komplexstruktur im w{\"a}ssrigen Medium gew{\"a}hrten. Hier nehmen die Modellsubstanzen verschiedene Orientierungen in der Cyclodextrinkavit{\"a}t ein. M{\"o}glicherweise liefern diese einen Erkl{\"a}rungsansatz f{\"u}r das besondere Verhalten der Gastmolek{\"u}le Naproxen und Fenbufen in den L{\"o}slichkeitsstudien. Die Carboxylgruppe nimmt eine Position ein, in der eine St{\"o}rung der intramolekularen Wasserstoffbr{\"u}ckenbindungen des Cyclodextrins m{\"o}glich wird, was f{\"u}r die erh{\"o}hte L{\"o}slichkeit des Wirtes verantwortlich sein k{\"o}nnte. Insgesamt hat sich gezeigt, dass die Grundstruktur und die funktionellen Gruppen des Gastmolek{\"u}ls erheblichen Einfluss auf die Struktur und die Eigenschaften ihrer Cyclodextrinkomplexe und auf die St{\"a}rke der Wechselwirkung zwischen Wirt und Gast haben. Die Lipophilie der Gastmolek{\"u}le scheint zudem eine tragende Rolle zu spielen. Da die Auspr{\"a}gung der Komplexbildung somit eine Summe aus vielen Einzelfaktoren ist, k{\"o}nnen Vorhersagen f{\"u}r ein vorliegendes System nur unter erheblichen Einschr{\"a}nkungen getroffen werden und es gilt, immer den Einzelfall zu betrachten.},
  subject      = {Cyclodextrine},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Sippel2010,
  author    = {Sippel, Martin},
  title     = {Computational Structure-based Design Approaches: Targeting HIV-1 Integrase and the Macrophage Infectivity Potentiator of Legionella pneumophila},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-51247},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2010},
  abstract  = {Die vorliegende Arbeit thematisiert das computergest{\"u}tzte strukturbasierte Design auf dem Gebiet der HIV-1-Integrase und des Macrophage Infectivity Potentiator (MIP) von Legionella pneumophila. Die durchgef{\"u}hrten Studien geben wertvolle Aufschl{\"u}sse {\"u}ber den Wirk-mechanismus einer bekannten Integrase-Inhibitorenklasse and zeigt dar{\"u}ber hinaus einen neuartigen Ansatz zur Integrase-Inhibition auf. Im Falle des MIP-Enzyms konnten zwei niedermolekulare Inhibitoren ermittelt werden. Die Integrase-Studien ergaben wertvolle Informationen im Hinblick auf das Design neuer Inhibitoren. Docking-Experimente konnten die Hypothese weiter untermauern, nach der die Klasse der Diketos{\"a}ure-Inhibitoren nicht als freie Liganden, sondern als Metallion-Komplexe an das aktive Zentrum der Integrase binden. Die Ergebnisse dieser Studie helfen dabei, das Verst{\"a}ndnis {\"u}ber den Wirkmechanismus dieser wichtigen Klasse von Integrase-Inhibitoren weiter zu vertiefen. Um der Entwicklung von Integrase-Inhibitoren einen neuen Impuls zu geben, wurde eine neue Strategie zur Inhibition dargelegt: Anstatt an das aktive Zentrum soll eine neue Inhibitor-Klasse an das Dimerisierungs-Interface eines Integrase-Monomers binden, die katalytisch notwendige Dimerisierung verhindern und somit die enzymatische Aktivit{\"a}t st{\"o}ren. Das Hauptproblem hierbei bestand in den fehlenden Strukturdaten des freien Monomers. Hierzu wurden Molekulardynamik-Simulationen durchgef{\"u}hrt, um n{\"a}here strukturelle Informationen zu erhalten. Momentaufnahmen unterschiedlicher Konformationen dienten als Input-Strukturen f{\"u}r eine Docking-Studie mit dem peptidischen Inhibitor YFLLKL, um dessen Bindemodus aufzukl{\"a}ren. Hierbei zeigte sich, dass dieser Ligand an eine Interface-Konformation bindet, die durch eine Y-f{\"o}rmige Bindestelle charakterisiert ist. Im n{\"a}chsten Schritt sollte diese Protein-Konformation mit kleinen, nicht-peptidischen Molek{\"u}len adressiert werden. Die erste Strategie bestand darin, ein Pharmakophor-Modell zu erstellen, das zur Suche nach Molek{\"u}len mit einer guten Komplementarit{\"a}t zur Y-f{\"o}rmigen Bindetasche geeignet ist. Das folgende virtuelle Screening ergab zehn Verbindungen, die eine gute Komplementarit{\"a}t und g{\"u}nstige hydrophobe Wechselwirkungen aufwiesen. Leider zeigte keine der Verbindungen eine reproduzierbare Aktivit{\"a}t im Integrase-Assay. Hierbei verbleiben jedoch gewisse Zweifel, da in dem Assay die Zugabe von BSA vorgeschrieben war, das m{\"o}glicherweise die hydrophoben Inhibitor-Kandidaten gebunden hat. Die erw{\"a}hnte erste Strategie wurde {\"u}berdacht: In einem zweiten Ansatz galt die Hauptaufmerksamkeit der Abs{\"a}ttigung von wasserstoffbr{\"u}ckenbildenden Resten. Diese waren zuvor von den eher hydrophoben Verbindungen nicht optimal abges{\"a}ttigt worden. Zwei Pharmakophor-Modelle wurden erstellt und in einem virtuellen Screening eingesetzt: Docking-Studien der Hits zeigten jedoch, dass nach wie vor viele wasserstoffbr{\"u}ckenbildende Reste des Proteins nicht vom Liganden abges{\"a}ttigt wurden. Nach abschließender eingehender Betrachtung der Bindemoden der verbliebenen Molek{\"u}le aus dem virtuellen Screening konnten nur acht f{\"u}r weitere Testungen ausgew{\"a}hlt werden (Ergebnisse der experimentellen Testung durch Kooperationspartner stehen noch aus). Diese geringe „Ausbeute" an geeigneten Verbindungen f{\"u}r das Integrase-Dimerisierungsinterface zeigt, wie schwer dieses Target zu adressieren ist: Das Interface weist eine schnell wechselnde Abfolge von basischen, sauren und hydrophoben Resten auf. Im Gegensatz zu anderen Protein-Protein-Interfaces zeigt das Integrase-Interface keine „aufger{\"a}umte" Bindetasche mit klar voneinander getrennten hydrophoben und hydrophilen Bereichen. F{\"u}r das zweite Enzym, MIP, konnten mit Hilfe des strukturbasierten Designs zwei niedermolekulare Inhibitoren gefunden werden. Beide Verbindungen f{\"u}hrten zu einer deutlichen Abnahme der katalytischen Aktivit{\"a}t. Soweit bekannt, sind bisher keinerlei niedermolekulare MIP-Inhibitoren ver{\"o}ffentlicht. Der Vergleich von MIP mit der humanen PPIase FKBP12 zeigte eine gr{\"o}ßtenteils {\"a}hnliche Tasche, die jedoch einen entscheidenden Unterschied aufweist, n{\"a}mlich in der Orientierung des Restes Tyr109. Die detaillierte Betrachtung der Strukturdaten beider Enzyme konnte schließlich eine Erkl{\"a}rung liefern, warum ein ketoacyl-substituiertes Pipecolinderivat nicht an MIP bindet, ein sulfonsubstituiertes Pipecolinderivat hingegen das Enzym inhibiert. Die Erkenntnisse {\"u}ber das Inhibitoren-Design f{\"u}r Legionella-MIP k{\"o}nnen auch auf andere Organismen (z.B. Trypanosomen) {\"u}bertragen werden, bei denen ebenfalls (homologes) MIP ein Pathogenit{\"a}tsfaktor ist.},
  subject      = {Legionella pneumophila},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Muehlbacher2003,
  author    = {M{\"u}hlbacher, J{\"o}rg},
  title     = {Molecular Modelling und Chiralit{\"a}t: Aufkl{\"a}rung der absoluten Konfiguration von Natur- und Wirkstoffen mit ungew{\"o}hnlichem Circular-Dichroismus},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-6120},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2003},
  abstract  = {Der Einsatz von computerchemischen Verfahren zur Vorhersage, Best{\"a}tigung oder Erkl{\"a}rung von Molek{\"u}leigenschaften hat sich zu einem Wissenschaftszweig innerhalb der Chemie entwickelt, der sowohl im universit{\"a}ren Umfeld als auch in der Industrie eine unverzichtbare Rolle einnimmt. So hat die in unserem Arbeitskreis in Zusammenarbeit mit Prof. J. Fleischhauer entwickelte und immer wieder erweiterte Methode zur Berechnung des Circular-Dichroismus (CD) organischer Molek{\"u}le schon in vielen F{\"a}llen die Arbeit experimentell arbeitender Naturstoffchemiker unseres Arbeitskreises und die vieler Kooperationspartner erleichtert. Im Rahmen der Strukturaufkl{\"a}rung wurde die Methode als effizientes Verfahren zur eindeutigen Zuordnung der absoluten Konfiguration von neuartigen chiralen Natur- und Wirkstoffen eingesetzt. In der vorliegenden Arbeit wurde die zusammen mit Prof. J. Fleischhauer etablierte Molekulardynamik-Methodik (MD-Methodik) - neben der schon vorher angewandten Boltzmann-Methodik (BM-Methodik) - zur Untersuchung des Circular-Dichroismus flexibler Verbindungen eingesetzt. Begonnen wurden die Studien mit der Evaluierung des Verfahrens an besonders flexiblen Molek{\"u}len, um im Anschluß den Circular-Dichroismus von Substanzen untersuchen zu k{\"o}nnen, deren CD-Spektren auf den ersten Blick sehr ungew{\"o}hnlich erschienen oder nicht den g{\"a}ngigen Vorstellungen vom chiroptischen Verhalten organischer Molek{\"u}le entsprachen. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen sehr deutlich, daß der Circular-Dichroismus komplexer organischer Verbindungen immer vorsichtig zu interpretieren ist. Zwar ist der einfachste Weg zur Aufkl{\"a}rung der Absolutkonfiguration eines Molek{\"u}ls derjenige, das CD-Spektrum der unbekannten Verbindung mit dem einer bereits aufgekl{\"a}rten Substanz sehr {\"a}hnlicher Konstitution zu vergleichen. Doch wie an den untersuchten Beispielen deutlich gezeigt wurde, kann trotz vermeintlich guter {\"U}bereinstimmung von CD-Spektren leicht eine falsche Zuordnung erfolgen. Einzig bei Enantiomeren oder sehr einfachen Derivaten enantiomerer Grundstruktur kann man durch den Vergleich experimenteller CD-Spektren eine sichere Aussage treffen. Sobald jedoch die CD-Spektren von Diastereomeren oder gar konstitutionell verschiedenen Substanzen verglichen werden sollen, ist immer {\"a}ußerste Vorsicht geboten.},
  subject      = {Naturstoff},
  language  = {de}
}