@phdthesis{Berg2008,
  author    = {Berg, Thorsten},
  title     = {Virulenzregulationskaskade und Chitobiose-Metabolismus in Vibrio cholerae},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-28293},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2008},
  abstract  = {Vibrio cholerae, der Erreger der gastrointestinalen Erkrankung Cholera, ist ein Gram- negatives, fakultativ anaerobes gekr{\"u}mmtes St{\"a}bchenbakterium und zugleich der wohl bekannteste Vertreter der Familie Vibrionaceae. Es persisitiert die meiste Zeit in aquatischen {\"O}kosystemen wie Fl{\"u}ssen, Seen oder Meeresk{\"u}sten, wo das Bakterium meist mit Crustaceen oder anderen Organismen mit Chitin-haltigen Oberfl{\"a}chen assoziiert vorliegt. {\"U}ber orale Aufnahme kontaminierter Lebensmittel oder von Wasser kann das Bakterium in den menschlichen Organismus gelangen und dort den oberen D{\"u}nndarmbereich kolonisieren, wo letztlich durch verschiedene Virulenzfaktoren, aber haupts{\"a}chlich durch das Cholera-Toxin, die Symptomatik der Cholera ausgel{\"o}st wird. V. cholerae ist somit sowohl in seiner nat{\"u}rlichen Umgebung, als auch im humanen Wirt h{\"o}chst unterschiedlichen Umweltbedingungen ausgesetzt. Diese alternierenden Umweltreize stellen verschiedene Anforderungen an die Expressions- und Regulationsf{\"a}higkeiten von Proteinbiosynthesen des Bakteriums dar. Die Notwendigkeit einer raschen Adaption setzt daher vielf{\"a}ltige und komplexe Genregulationsmechanismen voraus. Im ersten Teil der hier vorliegenden Arbeit sollte die Genregulation des chs-Operons untersucht werden. Als Grundlage dienten hierbei Hinweise, nach welchen dieses Operon als putatives PTS eine Rolle f{\"u}r den Metabolismus von dem Chitin-Derivat Chitobiose spielen k{\"o}nnte. Zudem sollte der Einfluss des aus Escherichia coli bekannten Repressors Mlc auf die Expression des Operons tiefer gehend untersucht werden. Im Rahmen dieser Arbeit war es gelungen, das als ChsR benannte Protein eindeutig als spezifischen LacI-{\"a}hnlichen Repressor f{\"u}r das chs-Operon zu best{\"a}tigen. Weiter konnte auch eine cAMP-abh{\"a}ngige Expressionsinduktion best{\"a}tigt werden, welche sich allerdings nur bei inaktiven ChsR durchsetzen kann. Als spezifischer Induktor f{\"u}r den Repressor ChsR konnte Chitobiose (GlcN)2 identifiziert werden, welches zwar bei dem in dieser Arbeit verwendeten O1-Stamm SP27459-S nicht als alleinige Kohlenstoffquelle dienen kann, aber unter induktiven Konzentrationen die Repressoreigenschaft von ChsR inhibiert. Zugleich konnte ChsC als f{\"u}r den Import des Induktors Chitobiose verantwortliches Protein identifiziert werden. Weiter nicht eindeutig zu kl{\"a}ren blieb der Einfluss von Mlc auf das chs-Operon. Zwar konnte der aktivierende Effekt von Mlc auf die chs-Expression durch Komplementation best{\"a}tigt werden, der genaue Mechanismus bleibt jedoch weiterhin unbekannt und bedarf weiterer Untersuchungen. Einzig der Einfluss von Mlc auf den Chitobiose-Import konnte ausgeschlossen werden. Im zweiten Teil dieser Arbeit sollte der weitaus komplexere Mechanismus der Virulenzgenregulation untersucht werden. Im Fokus stand hierbei der Hauptvirulenz-genregulator ToxR und dessen Abh{\"a}ngigkeit von der periplasmatischen Protease DegS. Anhand unterschiedlicher Experimente auf Promotoraktivit{\"a}ts-, mRNA- und Proteinebene konnte eine Abnahme der ToxR-Aktivit{\"a}t in der degS-Knockout Mutante beobachtet werden, was auf eine Aktivierung von ToxR durch DegS schließen l{\"a}sst. Weiter konnte eine Abh{\"a}ngigkeit der Aktivit{\"a}t von ToxR von der ebenfalls DegS-abh{\"a}ngigen RpoE-Signalkaskade ausgeschlossen werden. Auch konnte gezeigt werden, dass die Integrit{\"a}t von ToxR durch ToxS, nicht aber durch DegS bestimmt wird. Der exakte Mechanismus der DegS-induzierten ToxR-Aktivierung konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht mehr ermittelt werden. Es wurden jedoch Hinweise darauf gewonnen, dass eine direkte ToxR-DegS-Interaktion im periplasmatischen Raum stattfinden k{\"o}nnte. Die in dieser Arbeit gewonnen Erkenntnisse hinsichtlich der ToxR-Regulation durch DegS bieten sowohl eine interessante neue Perspektive der Funktionsweise der periplasmatischen Protease DegS, als auch eine breite Grundlage f{\"u}r weitergehende Untersuchungen bez{\"u}glich der Aktivierung des wichtigsten Virulenzregulators ToxR in V. cholerae.},
  subject      = {Cholerae},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Klug2003,
  author    = {Klug, Michael},
  title     = {Phasenvariation bei Legionella pneumophila: Vergleichende Proteomanalyse von virulenten und avirulenten Legionella pneumophila-St{\"a}mmen unter Anwendung der zweidimensionalen Gelelektrophorese},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-7464},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2003},
  abstract  = {Vergleichende Proteomanalyse eines avirulenten und virulenten Stammes von Legionella pneumophila Sg1 Subgruppe OLDA unter Anwendung der zweidimensionalen Gelelektrophorese. Die St{\"a}mme unterliegen einer spontanen LPS-Phasenvariation und unterscheiden sich ph{\"a}notypisch in multiplen Eigenschaften. Es zeigten sich different exprimierte Proteine der Membranoberfl{\"a}che, der LPS-Biosynthese und des Bakterienstoffwechsels.},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Klengel2008,
  author    = {Klengel, Torsten},
  title     = {Molekulare Charakterisierung der Carboanhydrase Nce103 im Kontext des CO2 induzierten Polymorphismus in Candida albicans},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-34573},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2008},
  abstract  = {Die Detektion von Umweltsignalen und die gezielte zellul{\"a}re Reaktion ist eine zentrale und f{\"u}r das {\"U}berleben aller Lebewesen essentielle F{\"a}higkeit. Candida albicans, als dominierender humanpathogener Pilz, ist hochgradig verschiedenen biochemischen und physikalischen Umweltbedingungen ausgesetzt, welche sowohl die Zellmorphologie als auch die Virulenz dieses Erregers beeinflussen. In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss von Kohlendioxid, als ubiquit{\"a}r vorkommendes Gasmolek{\"u}l, auf die Zellmorphologie und Virulenz untersucht. Erh{\"o}hte Konzentrationen von Kohlendioxid stellen ein {\"a}ußerst robustes Umweltsignal dar, welches die morphologische Transition vom Hefewachstum zum hyphalen Wachstum, einem Hauptvirulenzfaktor, in Candida albicans stimuliert. In diesem Zusammenhang wurde die Rolle der putativen Carboanhydrase Nce103 durch die Generation von knock - out Mutanten untersucht. Die Disruption von NCE103 in C. albicans f{\"u}hrt zu einem Kohlendioxid - abh{\"a}ngigen Ph{\"a}notyp, welcher Wachstum unter aeroben Bedingungen (ca. 0,033\% CO2) nicht zul{\"a}sst, jedoch unter Bedingungen mit einem erh{\"o}hten CO2 Gehalt von ca. 5\% erm{\"o}glicht. NCE103 ist also f{\"u}r das Wachstum von C. albicans in Wirtsnischen mit aeroben Bedingungen essentiell. Durch Untersuchungen zur Enzymkinetik mittels Stopped - flow wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass Nce103 die Funktion einer Carboanhydrase erf{\"u}llt. Die biochemische Funktion dieser Carboanhydrase besteht in der Fixation von CO2 bzw. HCO3\&\#713; in der Zelle zur Unterhaltung der wesentlichen metabolischen Reaktionen. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die Induktion hyphalen Wachstums durch CO2 in C. albicans nicht durch den Transport von CO2 mittels des Aquaporins Aqy1 beeinflusst wird. CO2 bzw. HCO3\&\#713; aktiviert in der Zelle direkt eine Adenylylcyclase (Cdc35), welche sich grundlegend von den bisher gut charakterisierten G-Protein gekoppelten Adenylylcylasen unterscheidet. Die Generation von cAMP beeinflusst in der Folge direkt die Transkription hyphenspezifischer Gene und nachfolgend die morphologische Transition vom Hefewachstum zum elongierten, hyphalen Wachstum. Dieser Mechanismus konnte sowohl in Candida albicans als auch in Cryptococcus neoformans nachgewiesen werden, was auf einen panfungal konservierten Signaltransduktionsmechanismus schliessen l{\"a}sst. Die Inhibition dieser spezifischen Kaskade er{\"o}ffnet neue Ans{\"a}tze zur Entwicklung spezifischer antimykotischer Wirkstoffe.},
  subject      = {Candida},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Halscheidt2007,
  author    = {Halscheidt, Anja},
  title     = {Das RpoS-Protein aus Vibrio cholerae : Funktionsanalyse und Charakterisierung der Proteolyse-Kaskade},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-27325},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2007},
  abstract  = {In der vorliegenden Arbeit wurde zun{\"a}chst die Konservierung bekannter RpoS-assoziierter Funktionen f{\"u}r das V. cholerae Homolog untersucht. Dabei ergab die ph{\"a}notypische Analyse der rpoS-Deletionsmutante, dass analog zu der Bedeutung als Regulator des Station{\"a}rphasen-Wachstums in E. coli, definierte Zelldichte-abh{\"a}ngige Eigenschaften in V. cholerae gleichermaßen der Kontrolle von RpoS unterliegen. In weiterf{\"u}hrenden Experimenten konnte daraufhin die Konservierung der entsprechenden Promotorstrukturen {\"u}ber die funktionelle Komplementierung rpoS-abh{\"a}ngiger Gene durch das jeweils speziesfremde Protein aufgedeckt werden. Dahingegen konnte die Bedeutung von RpoS bei der Auspr{\"a}gung der generellen Stress-Resistenz u. a. in E. coli f{\"u}r das V. cholerae Homolog {\"u}ber den gew{\"a}hlten experimentellen Ansatz nicht belegt werden. So wurden in Survival-Assays f{\"u}r keine der getesteten Stress-Bedingungen signifikante Unterschiede zwischen rpoS-Mutante und Wildtyp ermittelt. Die in E. coli gezeigte intrazellul{\"a}re Anreicherung des Sigmafaktors unter diversen Stress-Situationen konnte ebenfalls nicht nachgewiesen werden. Hinsichtlich der potentiellen Stellung von RpoS als globaler Regulator f{\"u}r Virulenz-assoziierte Gene, unterst{\"u}tzen und erg{\"a}nzen die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit die gegenw{\"a}rtige Theorie, wonach RpoS das Abl{\"o}sen der V. cholerae Zellen vom Darm-Epithel f{\"o}rdert. Die postulierte Bedeutung des alternativen Sigmafaktors in der letzten Phase der Pathogenese wurde {\"u}ber die RpoS-abh{\"a}ngige Sekretion der Mukin-degradierenden Protease HapA und die hier unabh{\"a}ngig nachgewiesene Transkriptionskontrolle von Chemotaxis-Genen best{\"a}tigt. In E. coli gilt als entscheidender Parameter f{\"u}r die dargelegten RpoS-Funktionen die intrazellul{\"a}re Konzentration des Masterregulators. Deshalb war ein weiteres zentrales Thema dieser Arbeit die Regulation des RpoS-Levels in V. cholerae. Neben der Identifizierung von Bedingungen, welche die RpoS-Expression beeinflussen, wurde vorrangig der Mechanismus der Proteolyse analysiert. Dabei wurden als RpoS-degradierende Komponenten in V. cholerae die Homologe des Proteolyse-Targetingfaktors RssB und des Protease-Komplexes ClpXP identifiziert. Die weitere Untersuchung der RpoS-Proteolyse ergab außerdem, dass bestimmte Stress-Signale den Abbau stark verz{\"o}gern. Interessanterweise resultierten die gleichen Signale jedoch nicht in der Akkumulation von RpoS. Als weiterer Unterschied zu der bekannten Proteolysekaskade in E. coli zeigte sich, dass das V. cholerae Homolog der RssB-aktivierenden Kinase ArcB (FexB) an der RpoS-Proteolyse nicht beteiligt ist. Indessen deuten die Ergebnisse weiterf{\"u}hrender Experimente auf den Einfluss der Kinasen CheA-1 und CheA-3 des V. cholerae Chemotaxis-Systems auf die RpoS-Degradation. Aus diesem Grund wurde in der vorliegenden Arbeit ein zu E. coli abweichendes Modell der RpoS-Proteolyse postuliert, in welchem die aktiven CheA-Kinasen den Targetingfaktor RssB phosphorylieren und somit den Abbau einleiten. Die Beteiligung von MCP-Rezeptoren an der Kontrolle der intrazellul{\"a}ren RpoS-Konzentration und damit an der Transkription der Chemotaxisgene selbst, beschreibt erstmalig ein Regulationssystem, wonach innerhalb der Chemotaxis-Kaskade die Rezeptoraktivit{\"a}t wahrscheinlich {\"u}ber einen positiven „Feedback-Loop" mit der eigenen Gen-Expression gekoppelt ist. Dar{\"u}ber hinaus deutete sich die Beteiligung der ATP-abh{\"a}ngigen Protease Lon an der RpoS-Proteolyse-Kaskade in V. cholerae an. Die Inaktivierung der in E. coli unter Hitzeschock-Bedingungen induzierten Protease resultierte in einem extrem beschleunigten RpoS-Abbau. Ein letztes Teilprojekt dieser Arbeit adressierte die Regulationsmechanismen der V. cholerae Osmostress-Adaptation. W{\"a}hrend in E. coli der alternative Sigmafaktor dabei eine zentrale Rolle spielt, konnte die Beteiligung des V. cholerae RpoS an der Osmostress-Regulation jedoch nicht aufgedeckt werden. Daf{\"u}r ergab die Funktionsanalyse eines neu definierten Osmostress-Sensors (OsmRK) die Kontrolle von ompU durch dieses Zwei-Komponentensystems unter hypertonen Bedingungen. Dieses Ergebnis {\"u}berraschte, da bislang nur der Virulenzfaktor ToxR als Regulator f{\"u}r das Außenmembranporin beschrieben wurde. Die nachgewiesene ompU-Transkriptionskontrolle durch zwei Regulatoren f{\"u}hrte zu der Hypothese eines unbekannten regulativen Netzwerkes, welchem mindestens 52 weitere Gene zugeordnet werden konnten. Insgesamt ist festzuhalten, dass die in dieser Arbeit durchgef{\"u}hrte molekulare Charakterisierung der RpoS-Proteolyse in V. cholerae Beweise f{\"u}r eine m{\"o}gliche Verbindung zwischen der Transkriptionskontrolle f{\"u}r Motilit{\"a}ts- und Chemotaxisgene mit der Chemotaxis-Reizwahrnehmung erbrachte. Eine derartige intermolekulare Verkn{\"u}pfung wurde bislang f{\"u}r keinen anderen Organismus beschrieben und stellt somit eine neue Variante der Signaltransduktion innerhalb der Virulenz-assoziierten Genregulation dar.},
  subject      = {V. cholerae},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Schild2005,
  author    = {Schild, Stefan},
  title     = {Bedeutung der Lipopolysaccharidstrukturen bei pathogenen Vibrio cholerae St{\"a}mmen f{\"u}r die Ausbildung von Cholera und Abgrenzung zu Umweltisolaten},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-12989},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2005},
  abstract  = {Obwohl inzwischen {\"u}ber 200 verschiedene Serogruppen von V. cholerae bekannt sind, wurden Ausbr{\"u}che der Cholera haupts{\"a}chlich von St{\"a}mmen der unbekapselten Serogruppe O1 und der bekapselten Serogruppe O139 verursacht. Die Komponenten des Lipopolysaccharids (LPS) von O1 und O139, sowie die Kapsel von O139 tragen zur Kolonisierung im Gastrointestinaltrakt bei. Um die Funktion des LPS und der Kapsel als Virulenzfaktor n{\"a}her zu untersuchen, wurden Adh{\"a}sionsstudien mit definierten LPS- und/ oder Kapsel-Mutanten beider pathogener Serogruppen durchgef{\"u}hrt. Dazu wurde die Mukus-produzierende humane Darmzelllinie HT-29-Rev MTX verwendet. Im Vergleich zum jeweiligen Wildtyp (Wt) konnte f{\"u}r eine O Antigen-Mutante von O1 eine Reduktion um 85\%, f{\"u}r eine O Antigen/ Kapsel-Mutante von O139 eine Reduktion um 70\% in der Adh{\"a}sionsrate festgestellt werden. Ein Beitrag von ToxR regulierten Genprodukten ist ebenfalls m{\"o}glich. Weiterhin wurden mit WavJ und WavD zwei Genprodukte der Kernoligosaccharid -Biosynthese charakterisiert, welche bislang nur in dem wa*-Genclustertyp 1 der klinischen Isolate nachgewiesen worden sind. Es konnte gezeigt werden, dass beide Genprodukte an der Biosynthese des Kern OS beteiligt sind, wobei WavJ mit hoher Wahrscheinlichkeit die Heptosyl-IV-Transferase darstellt. Die wavDJ-Doppelmutanten beider Serogruppen wiesen eine erh{\"o}hte Sensitivit{\"a}t gegen{\"u}ber Novobiocin auf. Dagegen konnte eine Attenuation der Mutanten im Mausmodell nur f{\"u}r die Serogruppe O139 demonstriert werden. Ein Schl{\"u}sselenzym der LPS-Biosynthese stellt die Oberfl{\"a}chenpolymer:Lipid A-Kern OS-Ligase (WaaL), kurz O Antigen-Ligase genannt, dar. In dieser Arbeit wurden die in der Prim{\"a}rstruktur stark unterschiedlichen Ligasen aus einem pathogenen (P27459) und apathogenen (V194) V. cholerae Isolat strukturell und funktionell analysiert. Es wurde gezeigt, dass die Aktivit{\"a}t beider Ligasen von der Anwesenheit eines N-Acetylglucosamins (GlcNAc) im Kernoligosaccharid abh{\"a}ngig ist. Dieser Zucker wird durch das Genprodukt WavL transferiert, welchem in dieser Arbeit die Aktivit{\"a}t einer N-Acetylglucosaminyltransferase zugeordnet werden konnte. Das Gen wavL wurde in allen zur Verf{\"u}gung stehenden V. cholerae Isolaten nachgewiesen und stellt wahrscheinlich eine generelle Voraussetzung des Kern OS f{\"u}r eine O Antigen-Anheftung dar. Im Gegensatz dazu, diskriminiert die An- bzw. Abwesenheit einer Galaktose (Gal) im Kern OS die Spezifit{\"a}t der Ligasen von V. cholerae P27459 bzw. V194. Dabei ist die Aktivit{\"a}t der Galaktosyltransferase WavM, essentiell f{\"u}r die Aktivit{\"a}t der Gal-abh{\"a}ngigen Ligase von V194. Die Gal-unabh{\"a}ngige Ligase von P27459 wird hingegen durch die Anwesenheit von Gal im Kern OS inhibiert. Hybridfusionen der beiden Ligasen deuten an, dass die Erkennungsdom{\"a}ne f{\"u}r Gal in der C-terminalen H{\"a}lfte lokalisiert ist. Erstmals wurde die Topologie einer Ligase durch PhoA- und LacZ-Fusionen analysiert. Die Suche nach konservierten Aminos{\"a}uren (AS) in verschiedenen Ligasen f{\"u}hrte zur Identifizierung der Motive R(X3)L und H(X10)G in zwei periplasmatischen Schleife. Ein Austausch des R oder des H in diesen Motiven f{\"u}hrte zum Verlust der Ligase-Aktivi{\"a}t von WaaL aus V. cholerae und S. enterica. Damit geben diese Motive einen ersten Hinweis auf das aktive Zentrum des Enzyms. Desweiteren wurde nach m{\"o}glichen O Antigen-Transportern bei V. cholerae gesucht, welche bislang noch nicht identifiziert worden waren. {\"U}ber die Anpassungen von V. cholerae an aquatische {\"O}kosysteme, insbesondere hinsichtlich der wechselnden Osmolarit{\"a}t, ist nahezu nichts bekannt. Durch ein in dieser Arbeit konstruiertes und etabliertes Transposonsystem konnten 3600 Mutanten erzeugt und auf Wachstumsdefekte unter hypertonischen Bedingungen untersucht werden. Eine dieser osmosensitiven Mutanten wies eine Insertion in dem Locus VCA0565 auf, welcher f{\"u}r eine putative Sensor-Histidinkinase kodiert. Mit dem Regulator, kodiert durch VCA0566, stellt VCA0565 das putative Zwei-Komponentensystem OsmRK dar. Transkriptomanalysen von osmR/ K-Mutanten lieferten keine Erkl{\"a}rung des Wachstumsdefekts unter hypertonischen Bedingungen, zeigten aber eine Vernetzung der durch OsmR/ K regulierten Gene mit dem ToxR-Regulon auf. Analysen der Außenmembran demonstrierten, dass eine Mutation von osmR/ K zu einer Repression von OmpU unter hohen Salzkonzentrationen f{\"u}hrt. Vergleichende Experimente mit weiteren Mutanten deuteten an, dass es in osmR/ K- und toxS-Mutanten unter erh{\"o}hten Salzkonzentrationen zur Degradation von ToxR kommt. W{\"a}hrend die Deregulation von OmpU in osmR/ K-Mutanten nur unter Salzstress zu beobachten war, f{\"u}hrte in der toxS-Mutante auch ein Membranstress durch Zugabe von Protamin zu einer Repression von OmpU. Die zu OsmR/ K nah verwandten putativen Zwei-Komponentensysteme EnvZ/ OmpR und VCA0257/ VCA0256 hatten unter keiner der getesteten Bedingungen einen Einfluss auf die Proteine der AM. Weiterhin wurde eine C-terminale Degradation von HutA unter hypertonischen Bedingungen aufgedeckt.},
  subject      = {Vibrio cholerae},
  language  = {de}
}