@phdthesis{Bahr2003,
  author    = {Bahr, Chris},
  title     = {Untersuchungen zur Expression und subzellul{\"a}ren Lokalisation von Isoformen des Adaptorproteins Kanadaptin},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-5310},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2003},
  abstract  = {Auf der Suche nach Bindeproteinen des renalen HCO3-/Cl- Anionenaustauschers 1 (renAE1) wurde 1998 von Chen et al. in der Maus das Protein Kanadaptin entdeckt. Immunzytochemisch ließ sich Kanadaptin in der Niere des Kaninchens nur im Zytoplasma des Sammelrohrepithels nachgewiesen. In renAE1-exprimierenden, s{\"a}uresezernierenden Schaltzellen (A-Schaltzellen) beobachtete man eine zus{\"a}tzlich vesikul{\"a}re Immunfluoreszenz. Eine Immunfluoreszenz der basolateralen Membran, wie sie f{\"u}r renAE1 typisch ist, wurde nicht entdeckt. Aufgrund der Tatsache, dass es sich bei den granul{\"a}ren Strukturen um renAE1-positive Vesikel handelte, wurde von Chen et al. postuliert, dass Kanadaptin am Transport von renAE1 zur basolateralen Plasmamembran s{\"a}uresezernierender Schaltzellen beteiligt ist. Kanadaptin wurde wenige Jahre sp{\"a}ter in nicht renAE1-exprimierenden, kultivierten Zellen auch im Zellkern detektiert. Die nukle{\"a}re Translokation erfolgte abh{\"a}ngig von Importin a/b und von einer aminoterminalen Kernlokalisationssequenz (NLS). In der vorliegenden Arbeit wurde die Expression von Kanadaptin detailiert untersucht. In allen uns zur Verf{\"u}gung stehenden humanen Zelllinien (z. B. U-373, SW-480 und Hep-G2, A-431, MCF-7, PC-3) wurde Kanadaptin sowohl auf Protein- als auch auf Transkriptionsebene (RT-PCR) nachgewiesen. In M{\"a}useembryonen wurde Kanadaptin im Western-Blot erstmals am 9. Embryonaltag detektiert. An gefriergetrockneten Epon-Semid{\"u}nnschnitten der Rattenniere wurde bei immunzytochemischen Untersuchungen {\"u}berraschenderweise eine besonders starke Immunreaktivit{\"a}t in epithelialen Zellen des proximalen Tubulus gefunden, nicht aber im Sammelrohrepithel, einschließlich der renAE1-exprimierenden A-Schaltzellen. In allen Kanadaptin-positiven Zellen war die Immunfluoreszenz von granul{\"a}rer Struktur. Eine nukle{\"a}re Immunreaktion, wie sie f{\"u}r kultivierte Zellen beschrieben wurde, ließ sich nicht beobachten. Mit Hilfe eines gegen die Cytochromoxidase Untereinheit I gerichteten Antik{\"o}rpers konnten die granul{\"a}ren Strukturen als Mitochondrien identifiziert werden. Durch {\"A}nderung der Fixierungs- und Permeabilisierungsbedingungen konnte in kultivierten Zellen neben der nukle{\"a}ren Lokalisation Kanadaptin immunzytochemisch auch in Mitochondrien nachgewiesen werden. Immunelektronenmikroskopische Untersuchungen zeigten schließlich, dass Kanadaptin in Mitochondrien lokalisiert. Auch in Mitochondrien kultivierter Zellen und im Darmepithel der Ratte wurde Kanadaptin biochemisch nachgewiesen. Neben dem in verschiedenen Geweben/Zellen der Ratte und des Menschen detektierten Kanadaptin mit einem Molekulargewicht von 57 kD wurde aus retins{\"a}ure-behandelten menschlichen teratokarzinomen Hodenzellen (NT2/D1 Zellen) eine neue 89 kD-Isoform von Kanadaptin isoliert. Beide Kanadaptin-Isoformen sind stark homolog zueinander und besitzen eine fast identische Dom{\"a}nenstruktur. Gegen{\"u}ber dem Kanadaptin der Maus enth{\"a}lt die menschliche Isoform jedoch eine aminoterminale Extension von 264 Aminos{\"a}uren sowie eine 25 Aminos{\"a}uren umfassende karboxyterminale Insertion. Innerhalb der aminoterminalen Extension konnte eine Gabelkopfdom{\"a}ne (FHA-Dom{\"a}ne) identifiziert werden. FHA-Dom{\"a}nen sind phosphorylierungsabh{\"a}ngige Protein-Protein-Bindedom{\"a}nen und finden sich haupts{\"a}chlich in nukle{\"a}ren Proteinen. Basierend auf diesen Erkenntnissen, lag der Fokus im zweiten Teil der Arbeit auf Untersuchungen zur subzellul{\"a}ren Lokalisation von humanem Kanadaptin, mit besonderer Ber{\"u}cksichtigung des FHA-Dom{\"a}nen-enthaltenen Aminoterminus. Hierzu wurde die humane Kanadaptin-cDNA aus retins{\"a}urebehandelten NT2/D1-Zellen mit Hilfe der RT-PCR kloniert und in eukaryontische Expressionsvektoren inseriert. Subzellul{\"a}re Lokalisations-untersuchungen an transient transfektierten Zellen ergaben, dass die menschliche Isoform im Zellkern lokalisiert. Weitere Lokalisationsstudien zeigten, dass die nukle{\"a}re Akkumulation der Kanadaptin-Isoformen durch unterschiedliche NLSs reguliert wird. So zeigten fr{\"u}here Untersuchungen, dass die Translokation vom Kanadaptin der Maus fast vollst{\"a}ndig von der aminoterminalen NLS1 abh{\"a}ngig ist (H{\"u}bner et al., 2002). Im Gegensatz dazu war die nukle{\"a}re Lokalisation der humanen Kanadaptin-Isoform NLS1 unabh{\"a}ngig. Den gr{\"o}ßten Einfluß zeigte die karboxyterminale NLS2. Ein Grund daf{\"u}r ist m{\"o}glicherweise eine zus{\"a}tzliche karboxyterminale Insertion, die die humane Kanadaptinisoform gegen{\"u}ber dem Kanadaptin der Maus besitzt. Diese k{\"o}nnte dazu f{\"u}hren, dass die karboxyterminale NLS2 f{\"u}r die Kerntranslokationsmaschinerie besser zug{\"a}nglich ist. Die Untersuchungen zeigten dar{\"u}ber hinaus, dass der FHA-Dom{\"a}ne enthaltene Aminoterminus m{\"o}glicherweise an nukle{\"a}re Strukturen bindet.},
  subject      = {Kanadaptin},
  language  = {de}
}