@phdthesis{Degel2006,
  author    = {Degel, Bj{\"o}rn},
  title     = {Synthese und Testung elektrophiler Verbindungen als Inhibitoren der sekretorischen Aspartat-Proteasen (SAPs) von Candida albicans},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-18339},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2006},
  abstract  = {In den letzten Jahren haben Pilzinfektionen zugenommen und bakterielle Infektionen nahezu {\"u}berholt, wof{\"u}r vor allem der massive Einsatz von Medikamenten sowie operative Eingriffe verantwortlich sind. Einer der gef{\"a}hrlichsten Ausl{\"o}ser schwerer Pilzinfektionen, die innere Organe sch{\"a}digen und sehr schwer zu behandeln sind, ohne dabei den Wirtsorganismus zu sch{\"a}digen, ist der opportunistische Hefepilz Candida albicans. Da aufgrund der immer gr{\"o}ßer werdenden Zahl von Resistenzen von Candida albicans nur ein relativ kleines Repertoire f{\"u}r die Therapie zur Verf{\"u}gung steht, war das Ziel der vorliegenden Arbeit die Synthese einer Reihe peptidischer Inhibitoren mit elektrophilen Bausteinen als potentielle irreversible Inhibitoren der sekretorischen Aspartat-Proteasen (SAPs) des Hefepilzes Candida albicans und deren Testung an dem am st{\"a}rksten exprimierten SAP-Isoenzym SAP2 sowie anderen Proteasen. Dabei sollte gekl{\"a}rt werden, ob neben der HIV-1-Protease auch andere Aspartat-Proteasen durch cis-konfigurierte Epoxide irreversibel hemmbar sind, ob andere elektrophile Ringe sowie elektronenarme Michael-Systeme in der Lage sind, als irreversible Aspartat-Protease-Inhibitoren zu fungieren, und ob die Z-Konfiguration der Olefine f{\"u}r die Hemmung von Aspartat-Proteasen ebenso wichtig ist wie die cis-Konfiguration bei Epoxiden. Die Aziridin-2-carboxylat-Bausteine wurden als Racemate {\"u}ber Cromwell-Synthese gewonnen und die Aziridin-2,3-dicarboxylat-Bausteine stereoselektiv aus Tartraten dargestellt. Die Oxiran-2-carboxylat-Bausteine wurden enantioselektiv ausgehend von Threonin bzw. als Racemate {\"u}ber Darzens-Glycidester-Synthese dargestellt. Die Synthese der Oxiran-2,3-dicarboxylat-Bausteine gelang mittels tertButylhydroperoxid / BuLi aus den Maleaten. Die Z-Olefinbausteine wurden durch Kupplung von Alkoholen bzw. AS an Maleins{\"a}ureanhydrid erhalten oder {\"u}ber Wittig- bzw. Horner-Wadsworth-Emmons-Reaktion dargestellt. Die Kupplung von AS bzw. Peptiden an die elektrophilen Bausteine erfolgte mit g{\"a}ngigen AS- / Peptidkupplungsmethoden. Die als irreversible Inhibitoren der SAP2 konzipierten Verbindungen wurden in einem neu entwickelten fluorimetrischen FRET-Assay auf ihre SAP2-Hemmung getestet. Dazu wurde ein Verd{\"u}nnungsassay nach Kitz und Wilson durchgef{\"u}hrt und die zunehmende Fluoreszenz durch das Spaltprodukt der enzymatischen Hydrolyse des Substrats bei 540 nm detektiert (Anregung 355 nm). Als Substrat diente das Undecapeptid Dabcyl-Arg-Lys-Pro-Ala-Leu-Phe / Phe-Arg-Leu-Glu(EDANS)-ArgOH (/ markiert die Spaltstelle). Von den Inhibitoren wurden IC50-, k2nd- und, falls m{\"o}glich, ki- und Ki-Werte ermittelt. Von den 41 an der SAP2 getesteten AS- / Peptid-verkn{\"u}pften Verbindungen stellen die beiden Aziridine A-07 und A-08 mit k2nd-Werten im mittleren f{\"u}nfstelligen Bereich [M-1min-1] die besten Inhibitoren dar. Bis auf zwei Verbindungen zeigen alle aktiven Verbindungen an der SAP2 sinkende IC50-Werte bei l{\"a}ngerer Inkubationszeit und somit eine zeitabh{\"a}ngige und irreversible Hemmung. Zur Untersuchung der Selektivit{\"a}t wurden die Verbindungen mittels kontinuierlicher Assays an den Cystein-Proteasen Cathepsin B (human), Cathepsin L (Paramecium tetraurelia) und Rhodesain (Trypanosoma brucei rhodesiense) getestet. Als Substrat wurde dabei Cbz-Phe-Arg-AMC verwendet. Erfreulicherweise waren bis auf das E-konfigurierte Olefin E-Ol-04 alle Verbindungen an den Cystein-Proteasen inaktiv. Die Ergebnisse zeigen, dass neben den HIV-Proteasen auch die sekretorische Aspartat-Protease SAP2 durch cis-konfigurierte Epoxide irreversibel hemmbar ist. Desweiteren zeigt sich, dass mit Aziridinen auch andere elektrophile Ringe als irreversible Aspartat-Protease-Inhibitoren fungieren k{\"o}nnen. An der SAP2 zeigen sich die Aziridine sogar aktiver. Auch elektronenarme Michael-Systeme sind in der Lage Aspartat-Proteasen zu hemmen, auch wenn ihre Hemmung deutlich schw{\"a}cher ist als die der Aziridine. Die Ergebnisse zeigen jedoch, dass nicht, wie angenommen, die Z-Konfiguration der Olefine entscheidend ist, sondern dass E-Olefine sogar bessere Hemmungen aufweisen. In Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Joachim Morschh{\"a}user und Dr. Peter Staib vom Institut f{\"u}r Molekulare Infektionsbiologie der Universit{\"a}t W{\"u}rzburg, konnte gezeigt werden, dass die Aziridine A-07 und A-08 neben dem isolierten Enzym auch die SAP2-Produktion in Candida albicans-Zellkulturen hemmen ohne auf die Pilzzellen toxisch zu wirken. Neben der Hemmung der SAP2 wirken die Aziridine A-07 und A-08 auch antiplasmodial. Bei Testungen am Malaria-Erreger Plasmodium falciparum zeigten beide Aziridine einen IC50-Wert im unteren mikromolaren Bereich. Der Grund der Hemmung des Parasiten ist jedoch noch unklar, da A-07 und A-08 weder an den isolierten Cystein-Proteasen des Malaria-Erregers Falcipain 2 und 3 aktiv sind, noch dessen Aspartat-Protease Plasmepsin II hemmen.},
  subject      = {Candida albicans},
  language  = {de}
}