@phdthesis{Gelmedin2008,
  author    = {Gelmedin, Verena Magdalena},
  title     = {Targeting flatworm signaling cascades for the development of novel anthelminthic drugs},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-33334},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2008},
  abstract  = {Echinococcus multilocularis verursacht die Alveol{\"a}re Echinokokkose (AE), eine lebendsbedrohliche Krankheit mit limitierten chemotherapeutischen M{\"o}glichkeiten. Die jetzige Anti-AE Chemotherapie basiert auf einer einzigen Wirkstoffklasse, den Benzimidazolen. Obwohl Benzimidazole in vitro parasitozid wirken, wirken sie in vivo bei AE-Behandlung lediglich parasitostatisch und rufen schwere Nebenwirkungen hervor. In F{\"a}llen operabler L{\"a}sionen erfordert die Resektion des Parasitengewebes {\"u}ber einen l{\"a}ngeren Zeitraum eine chemotherapeutische Unterst{\"u}tzung. Damit sind die jetzigen Behandlungsm{\"o}glichkeiten inad{\"a}quat und ben{\"o}tigen Alternativen. In der vorliegenden Arbeit wurden die Signalwege von Plattw{\"u}rmern analysiert, um potentielle Targets f{\"u}r neue therapeutische Ans{\"a}tze zu identifizieren. Dabei konzentrierte ich mich unter Anwendung von molekularbiologischer, biochemischer und zellbiologischer Methoden auf Faktoren, die an Entwicklung und Proliferation von E. multilocularis beteiligt sind. Darunter waren die drei MAP kinases des Parasiten EmMPK1, ein Erk1/2-Ortholog, EmMPK2, ein p38-Ortholog und EmMPK3, ein Erk7/8-Ortholog. Des Weiteren identifizierte und charakterisierte ich EmMKK2, ein MEK1/2-Ortholog des Parasiten, welches zusammen mit den bekannten Kinasen EmRaf und EmMPK1 ein Erk1/2-{\"a}hnliches MAPK Modul bildet. Ich konnte zudem verschiedene Einfl{\"u}sse von Wirtswachstumsfaktoren wie EGF (epidermal growth factor) und Insulin auf die Signalmechanismen des Parasiten und das Larvenwachstum zeigen, darunter die Phosphorylierung von Elp, ein Ezrin-Radixin-Moesin {\"a}hnliches Protein, die Aktivierung von EmMPK1 und EmMPK3 und eine gesteigerte mitotische Aktivit{\"a}t der Echinokokkenzellen. Zus{\"a}tzlich wurden verschiedene Substanzen auf ihre letale Wirkung auf den Parasiten untersucht, darunter befanden sich (1.) generelle Inhibitoren von Tyrosinkinasen (PP2, Leflunamid), (2.) gegen die Aktivit{\"a}t von Rezeptor-Tyrosin-Kinasen gerichtete Pr{\"a}parate, (3.) urspr{\"u}nglich anti-neoplastische Wirkstoffe wie Miltefosin und Perifosin, (4.) Inhibitoren von Serin/ Threonin-Kinasen, die die Erk1/2 MAPK Kaskade blockieren und (5.) Inhibitoren der p38 MAPK. In diesen Untersuchungen hat sich EmMPK2 aus den folgenden Gr{\"u}nden als vielversprechendes Target erwiesen. Aminos{\"a}uresequenz-Analysen offenbarten einige Unterschiede zu menschlichen p38 MAP Kinasen, welche sehr wahrscheinlich die beobachtete gesteigerte basale Aktivit{\"a}t des rekombinanten EmMPK2 verursachen, verglichen mit der Aktivit{\"a}t humaner p38 MAPK-\&\#945;. Zus{\"a}tzlich suggerieren die prominente Autophosphorylierungsaktivit{\"a}t von rekombinantem EmMPK2 und das Ausbleiben einer Interaktion mit den Echinococcus MKKs einen unterschiedlichen Regulierungsmechanismus im Vergleich zu den humanen Proteinen. Die Aktivit{\"a}t von EmMPK2 konnte sowohl in vitro als auch in kultivierten Metazestodenvesikeln durch die Behandlung mit SB202190 und ML3403, zwei ATP kompetitiven Pyridinylimidazolinhibitoren der p38 MAPK, in Konzentrations-abh{\"a}ngiger Weise inhibiert werden. Zudem verursachten beide Substanzen, insbesondere ML3403 die Inaktivierung von Parasitenvesikeln bei Konzentrationen, die kultivierte S{\"a}ugerzellen nicht beeintr{\"a}chtigten. Ebenso verhinderte die Anwesenheit von ML3403 die Generation von neuen Vesikeln w{\"a}hrend der Kultivierung von Echinococcus Prim{\"a}rzellen. Das Targeting von Mitgliedern des EGF-Signalwegs, insbesondere der Erk1/2-{\"a}hnlichen MAPK Kaskade mit Raf- und MEK- Inhibitoren verhinderte die Phosphorylierung von EmMPK1 in in vitro kultivierten Metazestoden. Obwohl das Parasitenwachstum unter diesen Konditionen verhindert wurde, blieb die strukturelle Integrit{\"a}t der Metazestodenvesikeln w{\"a}hrend der Langzeitkultivierung in Anwesenheit der MAPK Kaskade-Inhibitoren erhalten. {\"A}hnliche Effekte wurden beobachtet nach Behandlung mit den anderen zuvor aufgef{\"u}hrten Inhibitoren. Zusammenfassend l{\"a}sst sich festhalten, dass verschiedene Targets identifiziert werden konnten, die hoch sensibel auf die Anwesenheit der inhibitorischen Substanzen reagierten, aber nicht zum Absterben des Parasiten f{\"u}hrten, mit Ausnahme der Pyridinylimidazolen. Die vorliegenden Daten zeigen, dass EmMPK2 ein {\"U}berlebendsignal vermittelnden Faktor darstellt und dessen Inhibierung zur Behandlung der AE benutzt werden k{\"o}nnte. Dabei erwiesen sich p38 MAPK Inhibitoren der Pyridinylimidazolklasse als potentielle neue Substanzklasse gegen Echinokokken.},
  subject      = {Fuchsbandwurm},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Klengel2008,
  author    = {Klengel, Torsten},
  title     = {Molekulare Charakterisierung der Carboanhydrase Nce103 im Kontext des CO2 induzierten Polymorphismus in Candida albicans},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-34573},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2008},
  abstract  = {Die Detektion von Umweltsignalen und die gezielte zellul{\"a}re Reaktion ist eine zentrale und f{\"u}r das {\"U}berleben aller Lebewesen essentielle F{\"a}higkeit. Candida albicans, als dominierender humanpathogener Pilz, ist hochgradig verschiedenen biochemischen und physikalischen Umweltbedingungen ausgesetzt, welche sowohl die Zellmorphologie als auch die Virulenz dieses Erregers beeinflussen. In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss von Kohlendioxid, als ubiquit{\"a}r vorkommendes Gasmolek{\"u}l, auf die Zellmorphologie und Virulenz untersucht. Erh{\"o}hte Konzentrationen von Kohlendioxid stellen ein {\"a}ußerst robustes Umweltsignal dar, welches die morphologische Transition vom Hefewachstum zum hyphalen Wachstum, einem Hauptvirulenzfaktor, in Candida albicans stimuliert. In diesem Zusammenhang wurde die Rolle der putativen Carboanhydrase Nce103 durch die Generation von knock - out Mutanten untersucht. Die Disruption von NCE103 in C. albicans f{\"u}hrt zu einem Kohlendioxid - abh{\"a}ngigen Ph{\"a}notyp, welcher Wachstum unter aeroben Bedingungen (ca. 0,033\% CO2) nicht zul{\"a}sst, jedoch unter Bedingungen mit einem erh{\"o}hten CO2 Gehalt von ca. 5\% erm{\"o}glicht. NCE103 ist also f{\"u}r das Wachstum von C. albicans in Wirtsnischen mit aeroben Bedingungen essentiell. Durch Untersuchungen zur Enzymkinetik mittels Stopped - flow wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass Nce103 die Funktion einer Carboanhydrase erf{\"u}llt. Die biochemische Funktion dieser Carboanhydrase besteht in der Fixation von CO2 bzw. HCO3\&\#713; in der Zelle zur Unterhaltung der wesentlichen metabolischen Reaktionen. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die Induktion hyphalen Wachstums durch CO2 in C. albicans nicht durch den Transport von CO2 mittels des Aquaporins Aqy1 beeinflusst wird. CO2 bzw. HCO3\&\#713; aktiviert in der Zelle direkt eine Adenylylcyclase (Cdc35), welche sich grundlegend von den bisher gut charakterisierten G-Protein gekoppelten Adenylylcylasen unterscheidet. Die Generation von cAMP beeinflusst in der Folge direkt die Transkription hyphenspezifischer Gene und nachfolgend die morphologische Transition vom Hefewachstum zum elongierten, hyphalen Wachstum. Dieser Mechanismus konnte sowohl in Candida albicans als auch in Cryptococcus neoformans nachgewiesen werden, was auf einen panfungal konservierten Signaltransduktionsmechanismus schliessen l{\"a}sst. Die Inhibition dieser spezifischen Kaskade er{\"o}ffnet neue Ans{\"a}tze zur Entwicklung spezifischer antimykotischer Wirkstoffe.},
  subject      = {Candida},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Peterson2008,
  author    = {Peterson, Lisa},
  title     = {CEACAM3-mediated phagocytosis of human-specific bacterial pathogens involves the adaptor molecule Nck},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-46378},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2008},
  abstract  = {Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecules (CEACAMs) are exploited by human-specific pathogens to anchor themselves to or invade host cells. Interestingly, human granulocytes express a specific isoform, CEACAM3, that can direct efficient, opsonin-independent phagocytosis of CEACAM-binding Neisseria, Moraxella and Haemophilus species. As opsonin-independent phagocytosis of CEACAM-binding Neisseria depends on Src-family protein tyrosine kinase (PTK) phosphorylation of the CEACAM3 cytoplasmic domain, we hypothesized that an SH2-containing protein might be involved in CEACAM3-initiated, phagocytosis-promoting signals. Accordingly, we screened glutathione-S-transferase (GST) fusion proteins containing SH2 domains derived from a panel of signaling and adapter molecules for their ability to associate with CEACAM3. In vitro pull-down assays demonstrated that the SH2 domain of the adapter molecule Nck (GST-Nck SH2), but not other SH2 domains such as the Grb2 SH2 domain, interact with CEACAM3 in a phosphotyrosine-dependent manner. Either deletion of the cytoplasmic tail of CEACAM3, or point-mutation of a critical arginine residue in the SH2 domain of Nck (GST-NckSH2R308K) that disrupts phosphotyrosine binding, both abolished CEACAM3-Nck-SH2 interaction. Upon infection of human cells with CEACAM-binding Neisseria, full-length Nck comprising an SH2 and three SH3 domains co-localized with tyrosine phosphorylated CEACAM3 and associated bacteria as analyzed by immunofluorescence staining and confocal microscopy. In addition, Nck could be detected in CEACAM3 immunoprecipitates confirming the interaction in vivo. Importantly, overexpression of a GFP-fusion protein of the isolated Nck SH2 domain (GFP-Nck-SH2), but not GFP or GFP-Nck SH2 R308K reduced CEACAM3-mediated phagocytosis of CEACAM-binding Neisseria suggesting that the adaptor molecule Nck plays an important role in CEACAM3-initiated signaling leading to internalization and elimination of human-specific pathogens.},
  subject      = {Adaptorproteine},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Kotzsch2008,
  author    = {Kotzsch, Alexander},
  title     = {BMP Ligand-Rezeptor-Komplexe: Molekulare Erkennung am Beispiel der Spezifischen Interaktion zwischen GDF-5 und BMPR-IB},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-31040},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2008},
  abstract  = {Knochenwachstumsfaktoren (Bone Morphogenetic Proteins, BMPs) sind ubiquit{\"a}re, sekretierte Proteine mit vielf{\"a}ltigen biologischen Funktionen. Die Vielfalt an zellul{\"a}ren Prozessen, die durch BMPs reguliert werden, von der Knochenentwicklung und Organhom{\"o}ostase bis hin zur Neurogenese, erstaunt - und wirft angesichts von teils redundanten, teils spezifischen Funktionen der BMPs Fragen zu den Mechanismen ihrer Signal{\"u}bermittlung auf. Die Signaltransduktion von BMPs erfolgt wie bei den strukturell verwandten TGF-\&\#946;s und Activinen durch die ligandeninduzierte Oligomerisierung von transmembranen Serin/Threonin-Kinaserezeptoren, von denen zwei Typen - Typ I und Typ II - existieren. Einer Vielzahl von mehr als 18 BMP-Liganden stehen nach derzeitigem Erkenntnisstand nur vier Typ I und drei Typ II Rezeptorsubtypen f{\"u}r die Bildung von heteromeren Rezeptorkomplexen zur Verf{\"u}gung. Ein BMP-Ligand kann hochspezifisch nur einen bestimmten Rezeptorsubtyp oder in einer promisken Art und Weise mehrere Rezeptorsubtypen binden. Trotz dieser Bindungspromiskuit{\"a}t {\"u}ben BMPs ihre biologische Funktion {\"u}berwiegend hochspezifisch aus, d.h. abh{\"a}ngig vom Liganden werden spezifische zellul{\"a}re Prozesse reguliert. Somit stellt sich die Frage, wie die Bildung von heteromeren Ligand-Rezeptor-Komplexen und die Aktivierung definierter intrazellul{\"a}rer Signalkaskaden zusammenh{\"a}ngen und wie letztlich ein bestimmtes BMP-Signal durch einen „Flaschenhals", repr{\"a}sentiert durch die begrenzte Anzahl an Rezeptorsubtypen, in das Zellinnere {\"u}bermittelt wird. Die Interaktionen zwischen BMP-2 / GDF-5 und den Typ I Rezeptoren BMPR-IA / BMPR-IB sind ein Paradebeispiel f{\"u}r Bindungspromiskuit{\"a}t und -spezifit{\"a}t. W{\"a}hrend BMP-2 beide Rezeptoren BMPR-IA und BMPR-IB mit gleicher Bindungsaffinit{\"a}t bindet („promiske Interaktion"), zeigt GDF-5 eine 15-20fach h{\"o}here Bindungsaffinit{\"a}t zu BMPR-IB („spezifische" Interaktion). Dieser Unterschied ist scheinbar gering, aber physiologisch {\"u}beraus relevant. Um Einblick in die Mechanismen der molekularen Erkennung zwischen den Bindungspartnern zu gewinnen, wurden bin{\"a}re und tern{\"a}re Komplexe aus den Liganden BMP-2 oder GDF-5, den extrazellul{\"a}ren Dom{\"a}nen der Typ I Rezeptoren BMPR-IA oder BMPR-IB sowie der extrazellul{\"a}ren Dom{\"a}ne des Typ II Rezeptors ActR-IIB untersucht. Die hier vorliegende Arbeit beschreibt die strukturelle und funktionelle Analyse dieser Ligand-Rezeptor-Komplexe. Um den Einfluss struktureller Flexibilit{\"a}t auf die BMP Typ I Rezeptor Erkennung n{\"a}her zu analysieren, wurde zudem die Struktur von BMPRIA in freiem Zustand mittels NMR-Spektroskopie aufgekl{\"a}rt. Aus Mutagenesedaten und der Kristallstruktur des GDF-5•BMPR-IB-Komplexes lassen sich im Vergleich zu bekannten Kristallstrukturen Merkmale ableiten, mit denen die Ligand-Rezeptor-Bindung und -Erkennung charakterisiert werden kann: (1) Die Hauptbindungsdeterminanten in Komplexen von BMPR-IA und BMPR-IB mit ihren Liganden sind unterschiedlich. W{\"a}hrend in Komplexen mit BMPR-IB ein hydrophobes Motiv die Bindungsaffinit{\"a}t bestimmt, tr{\"a}gt in Komplexen mit BMPR-IA eine polare Interaktion signifikant zur Bindungsenergie bei. Ein Vergleich der Strukturen von freien und gebundenen Liganden und Typ I Rezeptoren zeigt, dass interessanterweise diese Hauptbindemotive erst bei der Ligand-Rezeptor-Interaktion entstehen, sodass ein „induced fit" vorliegt und die Molek{\"u}le entsprechend „aufeinander falten". (2) Die Bindungsspezifit{\"a}t wird durch periphere Schleifen in den Typ I Rezeptoren bestimmt. Wie Untersuchungen von Punktmutationen in BMPR-IA zeigen, die einer krebsartigen Darmerkrankung (Juvenile Polyposis) zugrunde liegen, f{\"u}hrt erst die „richtige" Kombination aus Flexibilit{\"a}t in den Schleifen und Rigidit{\"a}t des Rezeptorgrundger{\"u}sts zu signalaktiven Typ I Rezeptoren mit einer potentiell den Liganden komplement{\"a}ren Oberfl{\"a}che. Die mangelnde sterische Komplementarit{\"a}t von Ligand- und Rezeptoroberfl{\"a}chen f{\"u}hrt zu der niedrigeren Bindungsaffinit{\"a}t von GDF-5 zu BMPR-IA im Vergleich zu BMPR-IB. Interessanterweise zeigen die hier vorgestellten, hochaufgel{\"o}sten Strukturdaten, dass die Orientierungen/Positionen der Typ I Rezeptoren BMPR-IA und BMPR-IB in den Bindeepitopen der Liganden BMP-2 und GDF-5 variieren. Unter der Voraussetzung, dass die extrazellul{\"a}re Dom{\"a}ne, das Transmembransegment und die intrazellul{\"a}re Dom{\"a}ne der Typ I Rezeptoren ein starres Element bilden, sollte sich die unterschiedliche Orientierung der extrazellul{\"a}ren Dom{\"a}nen der Typ I Rezeptoren in der Anordnung der Kinasedom{\"a}nen widerspiegeln und sich auf die Signaltransduktion auswirken. M{\"o}glicherweise ist eine bestimmte Anordnung der Kinasedom{\"a}nen der Typ I und Typ II Rezeptoren f{\"u}r eine effiziente Phosphorylierung bzw. Signaltransduktion erforderlich. Der Vergleich mehrerer Ligand-Typ I Rezeptor-Komplexe zeigt, dass die unterschiedliche Orientierung dieser Rezeptoren m{\"o}glicherweise vom Liganden abh{\"a}ngt. Angesichts der Bindungspromiskuit{\"a}t unter BMP-Liganden und -Rezeptoren k{\"o}nnten so spezifische Signale {\"u}bermittelt und spezifische biologische Funktionen reguliert werden. Die in dieser Arbeit vorgestellten Erkenntnisse tragen wesentlich zur strukturellen Charakterisierung der Ligand-Rezeptor-Erkennung in der BMP-Familie bei. Die Frage, warum trotz strukturell hoch homologer Liganden und Rezeptoren und weitgehend konservierten Bindeepitopen eine teils promiske und teils spezifische Interaktion m{\"o}glich ist, kann nun f{\"u}r die Liganden BMP-2 und GDF-5 sowie den beiden Typ I Rezeptoren BMPR-IA und BMPR-IB beantwortet werden.},
  subject      = {Cytokine},
  language  = {de}
}