@phdthesis{Stoll2008,
  author    = {Stoll, Regina},
  title     = {Einfluss der Phosphoenolpyruvat-Phosphotransferasesysteme auf die Aktivit{\"a}t des Virulenzgenregulators PrfA von Listeria monocytogenes},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-32072},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2008},
  abstract  = {Die PrfA-Aktivit{\"a}t im L. monocytogenes Stamm EGD sowie dessen prfA Deletionsmutante mit dem prfA- bzw. prfA*-Gen unter Kontrolle des prfA-Promotors auf dem High-Copy Plasmid pERL3 wurde nach Wachstum in BHI, LB (Luria-Bertani Medium) und definiertem MM untersucht. Die Medien waren versetzt mit 50 mM der PTS-Kohlenstoffquellen Glucose, Mannose oder Cellobiose oder mit der Nicht-PTS-Kohlenstoffquelle Glycerin. Mit dem Wildtyp EGD konnte in BHI und LB mit allen genannten Kohlenstoffquellen nur eine geringe PrfA-Aktivit{\"a}t beobachtet werden. In MM dagegen war die PrfA-Aktivit{\"a}t in Anwesenheit von Glycerin stark erh{\"o}ht und mit Cellobiose als einziger Kohlenstoffquelle stark reprimiert. Mit dem PrfA*-{\"u}berexprimierenden Stamm wurden unter allen Bedingungen hohe PrfA-Aktivit{\"a}t gefunden. EGD\&\#916;prfApPrfA zeigte dagegen trotz gleicher PrfA-Menge wie EGD\&\#916;prfApPrfA* nur in BHI eine hohe PrfA-Aktivit{\"a}t. Die Zugabe des Amberlites XAD4 in LB erh{\"o}ht die reduzierte PrfA-Aktivit{\"a}t in EGD\&\#916;prfApPrfA und in MM verst{\"a}rkt XAD4-Zugabe die PrfA-Aktivit{\"a}t des Wildtyps. Eine ptsH-Mutante ist in LB und MM unabh{\"a}ngig von der Zugabe einer der vier Kohlenstoffquellen nicht in der Lage zu wachsen (Stoll et al., 2008), was darauf hin deutet, dass die Aufnahme der verwendeten Kohlenstoffquelle und auch der Glycerinstoffwechsel von einem intakten PTS-Weg abh{\"a}ngig sind. In BHI stehen dagegen offensichtlich noch PTS-unabh{\"a}ngige Kohlenstoffquellen zur Verf{\"u}gung, da die ptsH-Mutante in BHI noch wachsen kann. Dies unterst{\"u}tzt auch die Beobachtung, dass die Generationszeiten von L. monocytogenes in LB und vor allem MM im Vergleich zu BHI wesentlich l{\"a}nger sind. Expressionsdaten der PTS-Gene wurden von allen drei St{\"a}mmen unter verschiedenen Wachstumsbedingungen erstellt. Die Daten deuten darauf hin, dass die PrfA-Aktivit{\"a}t mit der Expressionsst{\"a}rke und dem Phosphorylierungsstatus bestimmter PTS-Permeasen zusammenh{\"a}ngt. PTS-Permeasen bestehen immer aus mindestens drei Dom{\"a}nen, der Membran {\"u}berspannenden Zucker transportierenden Dom{\"a}ne EIIC (und EIID im Falle von Mannose spezifischen PTS) und den zwei im Zytosol l{\"o}slichen Komponenten EIIA und EIIB. EIIA wird direkt von HPr-His-P phosphoryliert, welches sein Phosphat von dem von PEP phosphorylierten EI empf{\"a}ngt. Das PTS spielt neben der Zuckeraufnahme eine Rolle in vielen regulatorischen Vorg{\"a}ngen in der Bakterienzelle, unter anderem in der Pathogenese (Barabote and Saier, 2005; Deutscher et al., 2006; Postma et al., 1993). Listerien codieren f{\"u}r alle sieben bekannten PTS-Familien, 86 Gene codieren f{\"u}r 29 komplette und einige unvollst{\"a}ndige PTS. Trotz der großen Anzahl an PTS-Genen besitzt L. monocytogenes kein vollst{\"a}ndiges PtsG, welches homolog zu E. coli oder B. subtilis ist, sondern nur ein EIIAGlc. Um die an der Glucoseaufnahme involvierten PTS-Permeasen zu identifizieren und einen m{\"o}glichen Zusammenhang zwischen diesen PTS-Permeasen und der PrfA-Aktivit{\"a}t zu untersuchen, wurden in dieser Arbeit systematisch PTS-Permeasen deletiert, welche f{\"u}r putative Beta-Glucosid-PTS (PTSGlc), Mannose-PTS (PTSMan) und Cellobiose-PTS (PTSLac) codieren. Diese Deletionsmutanten wurden bez{\"u}glich ihres Wachstumes in Gegenwart der entsprechenden PTS-Zucker und die PrfA-Aktivit{\"a}t untersucht. Deletionen von in L. monocytogenes EGD-e nur schwach exprimierten PTSGlc haben keinen Einfluss auf das Wachstum in MM mit 10 mM Glucose oder Cellobiose. Von den vier exprimierten PTSMan sind zumindest zwei eindeutig in der Lage, Glucose zu transportieren, und die Deletion dieser PTS-Permeasen, codiert von lmo0096-0098 und lmo0781-0784, erh{\"o}ht sehr deutlich die Expression des im Wildtyp wenig exprimierten Gens f{\"u}r die PTS-Permease PTSGlc(lmo0027). F{\"u}r den Cellobiose-Transport scheint von den sechs vollst{\"a}ndigen PTSLac-Permeasen vor allem PTSLac(lmo2683-2685) und nach Deletion dieses Operons, ebenfalls die PTSGlc(lmo0027)-Permease wichtig zu sein. Obwohl die multiple Deletion dieser f{\"u}r die Glucose/Mannose- bzw. Cellobiose-Aufnahme in L. monocytogenes wichtigen PTS-Permeasen das Wachstum in definiertem MM drastisch reduziert, haben diese Deletionen offensichtlich keine Auswirkung auf das intrazellul{\"a}re Wachstum, da die Infektionsrate so effizient ist wie die des Wildtyps. Auf PrfA hat die schrittweise Deletion der Glucose/Mannose-spezifischen PTS-Permeasen nach Wachstum in MM mit Glucose als einziger Kohlenstoffquelle eine aktivierende Wirkung, jedoch keine Auswirkung nach Wachstum in Cellobiose-haltigem MM. Umgekehrt verh{\"a}lt es sich mit den PTSLac-Deletionsmutanten. In vitro Transkriptionsstudien mit (teilweise phosphoryliert) aufgereinigten Lmo0096 (EIIABMan) und Lmo1017 (EIIAGlc) -Proteinen deuten auf eine direkte Interaktion zwischen PrfA und bestimmten EII-Proteinen hin. Dies konnte f{\"u}r Lmo0096 auch in Immunpr{\"a}zipitationsassays gezeigt werden. Eine {\"U}berexpression von Lmo0096 f{\"u}hrte zudem zu einer sehr deutlichen Reduktion der PrfA-Aktivit{\"a}t nach Wachstum in MM mit Glucose.},
  subject      = {Listeria monocytogenes},
  language  = {de}
}