@phdthesis{Hoffmann2008,
  author    = {Hoffmann, Tanja},
  title     = {Herstellung und Charakterisierung von Antik{\"o}rpern gegen das Prion-Protein mit inhibitorischer Wirkung auf die Prionreplikation in Zellkultur},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-33998},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2008},
  abstract  = {Der Verlauf von Prionenerkrankungen wird durch die Akkumulation einer abnormal gefalteten Isoform des zellul{\"a}ren Prion-Proteins PrPC bestimmt. Diese infekti{\"o}se Isoform, die PrPSc genannt wird, entsteht, indem sie mit PrPC interagiert und dieses die Konformation von PrPSc {\"u}bernimmt. Die Konversion des zellul{\"a}ren Prion-Proteins PrPC in seine pathogene Isoform PrPSc und die damit verbundene PrPSc-Akkumulation sind demnach die wesentlichen Merkmale von Prionenerkrankungen und bieten m{\"o}gliche therapeutische Ansatzpunkte. Studien aus den letzten Jahren haben gezeigt, dass Antik{\"o}rper, die gegen PrPC und/oder PrPSc gerichtet sind, in vitro und in vivo in den Konversionsprozess eingreifen k{\"o}nnen und so die PrPSc-Akkumulation inhibieren (Enari et al., 2001; Feraudet et al., 2005b; Kim et al., 2004; Miyamoto et al., 2005; Pankiewicz et al., 2006; White et al., 2003). Das Ziel der vorliegenden Arbeit war somit die Generation neuer Anti-PrP-Antik{\"o}rper, welche die PrPSc-Konversion effizient hemmen k{\"o}nnen und somit die Auswahl an Anti-PrP-Antik{\"o}rpern f{\"u}r therapeutische und diagnostische Zwecke zu erweitern. Insgesamt wurden sieben Anti-PrP-Antik{\"o}rper mittels „Hybridom"-Technik hergestellt. Zwei der Antik{\"o}rper (B2-31-166 und B2-43-133) resultierten aus einer Fusion mit Milzzellen von Prnp0/0-M{\"a}usen, die zuvor mit fibrill{\"a}rem PrP immunisiert wurden. Bei f{\"u}nf Antik{\"o}rpern (7-12-5, 12-29, 48-11-5, 103-8 und 110-10) wurde f{\"u}r die Immunisierung rekombinantes PrP verwendet. Alle Antik{\"o}rper detektierten rekombinantes PrP sowie natives und denaturiertes PrPC und PrPSc. Die bestimmten Avidit{\"a}ten und die relativ einheitlichen Dissoziationskonstanten (KD-Konstante) waren mit kommerziellen Referenzantik{\"o}rpern vergleichbar. Das Epitop des Antik{\"o}rpers B2-31-166 wurde im unstrukturierten N-Terminus von PrP lokalisiert (Reste 96-110), w{\"a}hrend die Antik{\"o}rper 7-12-5, 12-29 und 48-11-5 PrP im globul{\"a}ren C-Terminus binden (Reste 158-176). Das Epitop der Antik{\"o}rper 103-8, 110-10 und B2-43-133 wurde ebenfalls im C-Terminus bestimmt (Reste 142-157). Diese Antik{\"o}rper binden PrP im Bereich der Helix 1 (Reste 144-152), einem Epitop, das bereits h{\"a}ufiger f{\"u}r inhibitorisch wirksame Antik{\"o}rper bestimmt wurde. Drei der sieben Anti-PrP-Antik{\"o}rper (7-12-5, 12-29 und B2-31-166) hemmten die PrPSc-Akkumulation in Prion-infizierten N2a-Zellen (ScN2a-Zellen) nicht. Der Antik{\"o}rper 48-11-5 f{\"u}hrte zu einer unvollst{\"a}ndigen Reduktion des PrPSc-Gehalts, die sich auch durch die Verl{\"a}ngerung des Applikationszeitraums nicht verst{\"a}rken ließ. Dagegen inhibierten die Antik{\"o}rper 103-8, 110-10 und B2-43-133 die PrPSc-Akkumulation vollst{\"a}ndig. Dieser Effekt wurde auf eine spezifische Interaktion der Antik{\"o}rper mit PrP zur{\"u}ckgef{\"u}hrt, da ein zytotoxischer Effekt, der den PrPSc-Gehalt unspezifisch h{\"a}tte verringern k{\"o}nnen, nicht beobachtet wurde. Bei der Analyse der Infektiosit{\"a}t von ScN2a-Zellen zeigte sich jedoch, dass der Antik{\"o}rper 110-10 zwar die PrPSc-Akkumulation inhibierte, aber die Infektiosit{\"a}t der Zellen nicht reduzieren konnte. Die Behandlung mit dem Antik{\"o}rper 103-8 reduzierte die Infektiosit{\"a}t der ScN2a-Zellen zwar, jedoch setzte 30 Tage nach Abschluss der Behandlung eine erneute PrPSc-Akkumulation in ScN2a-Zellen ein. Dagegen reduzierte die Behandlung mit dem Antik{\"o}rper B2-43-133 die Infektiosit{\"a}t der ScN2a-Zellen vollst{\"a}ndig. Des Weiteren wurde bei diesen Zellen auch nach 36 Tagen Kultivierung ohne Antik{\"o}rper keine erneute PrPSc-Akkumulation detektiert. Die starke inhibitorische Wirkung dieses Antik{\"o}rpers wird zus{\"a}tzlich durch einen sehr niedrigen IC50-Wert (0,31 nM) unterst{\"u}tzt, der mit kommerziellen Referenzantik{\"o}rpern vergleichbar ist. Zusammenfassend sprechen diese Ergebnisse daf{\"u}r, dass von den sieben neu generierten Anti-PrP-Antik{\"o}rpern der Antik{\"o}rper B2-43-133 ein Kandidat f{\"u}r weiterf{\"u}hrende Experimente mit therapeutischem Hintergrund ist. Welchen Mechanismus die Anti-PrP-Antik{\"o}rper f{\"u}r die Inhibition nutzen, konnte nicht gekl{\"a}rt werden. Obwohl der Antik{\"o}rper B2-43-133 die Verweildauer von PrPC auf der Zelloberfl{\"a}che (Retention) verl{\"a}ngerte, wodurch hypothetisch die gebundenen PrPC-Molek{\"u}le der PrPSc-Konversion entzogen werden k{\"o}nnen, wurde dies f{\"u}r einen Referenzantik{\"o}rper, welcher einen {\"a}hnlichen inhibitorischen Effekt besitzt, nicht beobachtet. Dies spricht entweder daf{\"u}r, dass die Verl{\"a}ngerung der Retention nur ein weiteres Charakteristikum der Antik{\"o}rper ist und ein anderer Mechanismus genutzt wird, oder daf{\"u}r, dass verschiedene Antik{\"o}rper verschiedene Mechanismen nutzen k{\"o}nnen. Auch die Hypothese, dass die inhibitorische Wirkung des Antik{\"o}rpers durch eine Komplexbildung mit PrP vermittelt wird, konnte nicht best{\"a}tigt werden, da eine stabile Komplexbildung des Antik{\"o}rpers B2-43-133 mit rekombinantem PrP zu einer Erh{\"o}hung des IC50-Werts im Vergleich zu freiem Antik{\"o}rper f{\"u}hrte.},
  subject      = {Monoklonaler Antik{\"o}rper},
  language  = {de}
}