@phdthesis{Werthmann2009,
  author    = {Werthmann, Ruth},
  title     = {Echtzeit-Untersuchungen zur Thrombin-abh{\"a}ngigen {\"A}nderung der cAMP-Konzentration in lebenden Endothelzellen},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-46066},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2009},
  abstract  = {Das Endothel bildet eine einschichtige Zellbarriere zwischen Blut und interstitiellem Gewebe, deren Durchl{\"a}ssigkeit entscheidend durch die sekund{\"a}ren Botenstoffe Ca2+ und cAMP reguliert wird. W{\"a}hrend Ca2+ durch eine verst{\"a}rkte Kontraktion der Endothelzellen die Permeabilit{\"a}t erh{\"o}ht, f{\"o}rdert cAMP die Adh{\"a}sion der Zellen und unterst{\"u}tzt somit die Barrierefunktion. Es ist bekannt, dass Thrombin durch einen Anstieg der intrazellul{\"a}ren Ca2+-Konzentration und vermutlich auch durch eine Hemmung der cAMP-Konzentration zu einer Permeabilit{\"a}tserh{\"o}hung f{\"u}hrt. Ziel dieser Arbeit war es, Thrombin-induzierte {\"A}nderungen der cAMP-Konzentration in Echtzeit in lebenden Endothelzellen mittels Fluorescence-Resonance-Energy-Transfer (FRET) zu untersuchen. Hierf{\"u}r wurden Human-Umbilical-Vein-Endothelial-Cells (HUVECs) mit dem FRET-basierten cAMP-Sensor Epac1-camps transfiziert. Die Bindung von cAMP an Epac1-camps f{\"u}hrt zu einer Konformations{\"a}nderung des Sensors und damit zu einer Abschw{\"a}chung des FRET. Mit Hilfe dieses Sensors kann die cAMP-Konzentration mit hoher zeitlicher Aufl{\"o}sung in einzelnen lebenden Zellen gemessen werden. Untersucht wurde der Effekt von Thrombin auf die cAMP-Konzentration in Endothelzellen, deren cAMP-Konzentration durch Stimulierung endogener \&\#946;-Rezeptoren erh{\"o}ht war. Thrombin erniedrigte Ca2+-abh{\"a}ngig die cAMP-Konzentration um ca. 30 \%. Dieser Abfall der cAMP-Konzentration folgte zeitlich verz{\"o}gert dem Thrombin-induzierten Ca2+-Signal. Die cAMP-Konzentration erreichte ca. 30 s nach der Thrombinzugabe ein Minimum und stieg danach wieder an. Durch die Herunterregulierung der durch Ca2+ direkt inhibierten Adenylatzyklase 6 (AC6) mittels siRNA wurde die Thrombin-induzierte Abnahme der cAMP-Konzentration vollst{\"a}ndig aufgehoben. Dies best{\"a}tigte, dass Thrombin durch die Ca2+-vermittelte Inhibierung der AC6 eine Abnahme der cAMP-Konzentration verursacht. Ohne \&\#946;-adrenerge Stimulation f{\"u}hrte die Applikation von Thrombin zu einem langsamen Anstieg der cAMP-Konzentration, der mehrere Minuten anhielt. Dieser cAMP-Konzentrationsanstieg beruhte auf der Ca2+-abh{\"a}ngigen Aktivierung der Phospholipase A2 (PLA2). Diese setzt Arachidons{\"a}ure aus Membranphospholipiden frei, die als Substrat f{\"u}r die Synthese verschiedener Prostaglandine dient. Durch die pharmakologische Beeinflussung von Zyklooxygenasen und Prostazyklinrezeptoren konnte gezeigt werden, dass die Synthese von Prostazyklin und die anschließende Stimulation Gs-gekoppelter Prostazyklinrezeptoren zum Thrombin-induzierten Anstieg der cAMP-Konzentration f{\"u}hrte. Da die Physiologie der Endothelzellen im Gef{\"a}ß stark von Faktoren aus der unmittelbaren Umgebung beeinflusst wird, ist die Messung der {\"A}nderungen der cAMP-Konzentration in Endothelzellen, die sich innerhalb eines Gewebes befinden, von sehr großer Bedeutung. Deshalb war die Generierung transgener M{\"a}use mit einer gewebespezifischen Expression des FRET-Sensors Epac1-camps in Endothelzellen ein weiteres Ziel dieser Arbeit. Durch Anwendung eines Cre-Rekombinase/loxP-Ansatzes konnten transgene M{\"a}use generiert werden, die Epac1-camps spezifisch in Endothelzellen exprimierten. An isolierten pulmon{\"a}ren Endothelzellen konnte die Funktionalit{\"a}t des transgen exprimierten Sensors Epac1-camps nachgewiesen werden. Die Echtzeitmessung der Thrombin-induzierten {\"A}nderungen der cAMP-Konzentration verdeutlichte ein zeitlich sehr komplexes Wechselspiel zwischen Ca2+- und cAMP-Signalen, das die Barrierefunktion des Endothels maßgeblich beeinflussen wird. Die transgene Expression von Epac1-camps in Endothelzellen erm{\"o}glicht in Zukunft die Untersuchung der Thrombin-verursachten {\"A}nderungen der cAMP-Konzentration und der Permeabilit{\"a}t innerhalb eines intakten Gef{\"a}ßes.},
  subject      = {Cyclo-AMP},
  language  = {de}
}