@phdthesis{Streker2005,
  author    = {Streker, Karin},
  title     = {Charakterisierung neuer Zielstrukturen f{\"u}r die Antibiotikatherapie gegen Staphylococcus aureus und Entwicklung eines konditionalen In-vivo-Expressionssystems},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-12747},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2005},
  abstract  = {Bislang inhibieren antibakterielle Substanzen in erster Linie die Zellwandsynthese, den DNA- und RNA-Stoffwechsel sowie die Proteinsynthese. In dieser Arbeit wurde ein erster Versuch unternommen, neue Zielstrukturen f{\"u}r die Antibiotika-Therapie in S. aureus zu finden. Insgesamt wurden 10 Gene untersucht, die Funktion von 7 dieser Gene war in S. aureus unbekannt. Zun{\"a}chst sollte herausgefunden werden, ob diese 10 Zielgene: topB, polA, nusG, SA1857, SA1444, SA1063, SA0453, SA0241, SA0245, SA0367, f{\"u}r S. aureus essentiell sind. Es wurde versucht, jedes dieser Gene in S. aureus zu deletieren. Außer den Genen SA1444, SA0245 und nusG konnten alle Zielgene deletiert werden und waren daher f{\"u}r S. aureus nicht essentiell. Die Deletionsmutanten \&\#916;topB, \&\#916;polA, \&\#916;SA1857, \&\#916;SA1063, \&\#916;SA0453, \&\#916;SA0241, \&\#916;SA0367 wurden außerdem in einem Sepsismodell in M{\"a}usen untersucht und waren nicht attenuiert. Gene, die weder in vitro noch in vivo essentiell sind, sind nur von geringem Interesse f{\"u}r die Entwicklung neuer Antibiotika. Zur Untersuchung essentieller Gene in S. aureus wurden vier verschiedene konditionale Expressionssystem untersucht. Bei drei dieser Systeme wurde der wildtypische Promotor gegen einen regulierbaren Promotor ausgetauscht. Bei einem weiteren System handelte es sich um einen Antisense-RNA-Ansatz. Zur {\"U}berpr{\"u}fung der konditionalen Expressionssysteme („proof-of-principle") wurden die bekannten essentiellen Gene ligA und dnaE in S. aureus mutiert. Eines dieser konditionalen Expressionssysteme, das pLL30/Pspac/pMJ8426-System, konnte erfolgreich in S. aureus angewandt werden. Die konditionale Expression von ligA und von SA0245 wurde mit diesem System erzielt. Der Temperatur-sensitive Shuttle-Vektor pLL30 dieses konditionalen Expressionssystems enth{\"a}lt eine Insertionskassette, die das Antibiotikaresistenzgen cat (Chloramphenicol-Acetyltransferase) sowie den regulierbaren Promotor Pspac enth{\"a}lt. Ein wesentliches Merkmal des pLL30/Pspac/pMJ8426-Systems ist die stabile Integration des Resistenzmarkers cat und des Pspac-Promotors durch ein doppeltes Crossover Ereignis vor dem Zielgen. Der Temperatur-sensitive Shuttle-Vektor pLL30 kann anschließend durch mehrfaches Subkultivieren der Bakterien bei nicht permissiver Temperatur eliminiert werden. Der Repressor LacI wird auf einem Extra-Plasmid pMJ8426 kodiert und wird nach erfolgter Integration des Pspac-Promotors vor dem Zielgen in die Bakterien transformiert. Mehrere Kopien des Repressorplasmids erm{\"o}glichen eine gute Repression an Pspac. Durch die Zugabe des Induktors IPTG kann der Repressor LacI inaktiviert und die Gen-Expression induziert werden. Insbesondere konnte dieses konditionale Expressionssystem erfolgreich im Tiermodell angewandt werden. Ein weiterer Schwerpunkt dieser Arbeit bildete die genetische und funktionelle Charakterisierung von SA0367. Durch biochemische Untersuchungen wurde gezeigt, dass dieses Gen f{\"u}r eine FMN-enthaltende Oxidoreduktase codiert. Auf Grundlage der in dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnisse zur Funktion des Proteins wurde das Gen SA0367, in Analogie zum orthologen Gen nfrA aus B. subtilis, in nfrA umbenannt. Die Oxidoreduktase NfrA oxidiert NADPH in Gegenwart von FMN. In Gegenwart von NADPH und FMN zeigt das Enzym NfrA außerdem Nitroreduktase- und eine leichte Disulfidreduktase-Aktivit{\"a}t. Induktionsexperimente im Wildtyp zeigten, dass nfrA durch oxidativen Stress, verursacht von Diamide oder Nitrofurantoin, und durch Ethanol induziert wird. Ethanol und oxidativer Stress f{\"u}hrt zu Denaturierung von Proteinen. NfrA k{\"o}nnte an der Reparatur gesch{\"a}digter Proteine beteiligt sein. Die Induktion von nfrA in S. aureus erfolgt unabh{\"a}ngig vom alternativen Sigmafaktor SigB. Durch Primer Extension-Experimente wurde eine putative PerR-Box vor dem nfrA-Gen identifiziert. Diese k{\"o}nnte f{\"u}r die Regulation von nfrA wichtig sein. Außerdem wird nfrA w{\"a}hrend des gesamten Wachstumszyklus von einem SigAabh{\"a}ngigen Promotor exprimiert. Die Deletionsmutante \&\#916;nfrA zeigt nur in Gegenwart hoher Ethanolkonzentrationen von 6,5 \% einen leichten Wachstumsnachteil im Vergleich zum Wildtyp. Außerdem weist die \&\#916;nfrA-Mutante eine h{\"o}here Resistenz gegen{\"u}ber Nitrofurantoin auf. In weiteren Untersuchungen wurde begonnen die Funktion der Ser/Thr-Kinase SA1063 durch Microarray-Experimente aufzukl{\"a}ren. Hierbei wurde deutlich, dass dieses Gen eine regulatorische Rolle bei der Zellwandsynthese in S. aureus spielen k{\"o}nnte.},
  subject      = {Staphylococcus aureus},
  language  = {de}
}