@phdthesis{Zilian2014,
  author    = {Zilian, David},
  title     = {Neuartige, empirische Scoring-Modelle f{\"u}r Protein-Ligand-Komplexe und computergest{\"u}tzte Entwicklung von Hsp70-Inhibitoren},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-105055},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2014},
  abstract  = {Techniken des computergest{\"u}tzten Wirkstoffdesigns spielen eine wichtige Rolle bei der Entwicklung neuer Wirkstoffe. Die vorliegende Arbeit befasst sich sowohl mit der Entwicklung als auch mit der praktischen Anwendung von Methoden des strukturbasierten Wirkstoffdesigns. Die Arbeit glieder sich daher in zwei Teile. Der erste Teil besch{\"a}ftigt sich mit der Entwicklung von empirischen Scoring-Funktionen, die eine Schl{\"u}sselrolle im strukturbasierten computergest{\"u}tzen Wirkstoffdesign einnehmen. Grundlage dieser Arbeiten sind die empirischen Deskriptoren und Scoring-Funktionen aus dem SFCscore-Programmpaket. Dabei wurde zun{\"a}chst untersucht, wie sich die Zusammensetzung der Trainingsdaten auf die Vorhersagen von empirischen Scoring-Funktionen auswirkt. Durch die gezielte Zusammenstellung eines neuen Trainingsdatensatzes wurde versucht, die Spannweite der Vorhersagen zu vergr{\"o}ßern, um so vor allem eine bessere Erkennung von hoch- und niedrig-affinen Komplexen zu erreichen. Die resultierende Funktion erzielte vor allem im niedrig-affinen Bereich verbesserte Vorhersagen. Der zweite Themenkomplex besch{\"a}ftigt sich ebenfalls mit der verbesserten Separierung von aktiven und inaktiven Verbindungen. Durch den Einsatz der Machine Learning-Methode RandomForest wurden dazu Klassifizierungsmodelle abgeleitet, die im Unterschied zu den klassischen Scoring-Funktionen keinen genauen Score liefern, sondern die Verbindungen nach ihrer potentiellen Aktivit{\"a}t klassifizieren. Am Beispiel des mykobakteriellen Enzyms InhA konnte gezeigt werden, dass derartige Modelle den klassischen Scoring-Funktionen im Bezug auf die Erkennung von aktiven Verbindungen deutlich {\"u}berlegen sind. Der RandomForest-Algorithmus wurde im n{\"a}chsten Schritt auch verwendet, um eine neue Scoring-Funktion zur Vorhersage von Bindungsaffinit{\"a}ten abzuleiten. Diese Funktion wurde unter dem Namen SFCscoreRF in das SFCscore-Programmpaket implementiert. Die Funktion unterschiedet sich in einigen wesentlichen Punkten von den urspr{\"u}nglichen SFCscore-Funktionen. Zum einen handelt es sich beim RF-Algorithmus um eine nicht-lineare Methode, die im Unterschied zu den klassischen Methoden, die zur Ableitung von Scoring-Funktionen eingesetzt werden, nicht von der Additivit{\"a}t der einzelnen Deskriptoren ausgeht. Der Algorithmus erlaubt außerdem die Verwendung aller verf{\"u}gbaren SFCscore-Deskriptoren, was eine deutlich umfassendere Repr{\"a}sentation von Protein-Ligand-Komplexen als Grundlage des Scorings erm{\"o}glicht. F{\"u}r die Ableitung von SFCscoreRF wurden insgesamt 1005 Komplexe im Trainingsdatensatz verwendet. Dieser Datensatz ist somit einer der gr{\"o}ßten, die bisher f{\"u}r die Ableitung einer empirischen Scoring-Funktion verwendet wurden. Die Evaluierung gegen zwei Benchmark-Datens{\"a}tze ergab deutlich bessere Vorhersagen von SFCscoreRF im Vergleich zu den urspr{\"u}nglichen SFCscore-Funktionen. Auch im internationalen Vergleich mit anderen Scoring-Funktion konnten f{\"u}r beide Datens{\"a}tze Spitzenwerte erreicht werden. Weitere ausgiebige Testungen im Rahmen einer Leave-Cluster-Out-Validierung und die Teilnahme am CSAR 2012 Benchmark Exercise ergaben, dass auch SFCscoreRF Performanceschwankungen bei der Anwendung an proteinspezifischen Datens{\"a}tzen zeigt - ein Ph{\"a}nomen, dass bei Scoring-Funktionen immer beobachtet wird. Die Analyse der CSAR 2012-Datens{\"a}tze ergab dar{\"u}ber hinaus wichtige Erkenntnisse im Bezug auf Vorhersage von gedockten Posen sowie {\"u}ber die statistische Signifikanz bei der Evaluierung von Scoring-Funktionen. Die Tatsache, dass empirische Scoring-Funktionen innerhalb eines bestimmten chemischen Raums trainiert wurden, ist ein wichtiger Faktor f{\"u}r die protein-abh{\"a}ngigen Leistungsschwankungen, die in dieser Arbeit beobachtet wurden. Verl{\"a}ssliche Vorhersagen sind nur innerhalb des kalibrierten chemischen Raums m{\"o}glich. In dieser Arbeit wurden verschiedene Ans{\"a}tze untersucht, mit denen sich diese ``Applicability Domain'' f{\"u}r die SFCscore-Funktionen definieren l{\"a}sst. Mit Hilfe von PCA-Analysen ist es gelungen die ``Applicability Domain'' einzelner Funktionen zu visualisieren. Zus{\"a}tzlich wurden eine Reihe numerischer Deskriptoren getestet, mit den die Vorhersageverl{\"a}sslichkeit basierend auf der ``Applicability Domain'' abgesch{\"a}tzt werden k{\"o}nnte. Die RF-Proximity hat sich hier als vielversprechender Ausgangspunkt f{\"u}r weitere Entwicklungen erwiesen. Der zweite Teil der Arbeit besch{\"a}ftigt sich mit der Entwicklung neuer Inhibitoren f{\"u}r das Chaperon Hsp70, welches eine vielversprechende Zielstruktur f{\"u}r die Therapie des multiplen Myeloms darstellt. Grundlage dieser Arbeiten war eine Leitstruktur, die in einer vorhergehenden Arbeit entdeckt wurde und die vermutlich an einer neuartigen Bindestelle in der Interface-Region zwischen den beiden großen Dom{\"a}nen von Hsp70 angreift. Die Weiterentwicklung und Optimierung dieser Leitstruktur, eines Tetrahydroisochinolinon-Derivats, stand zun{\"a}chst im Vordergrund. Anhand detaillierter Docking-Analysen wurde der potentielle Bindemodus der Leitstruktur in der Interfaceregion von Hsp70 untersucht. Basierend auf diesen Ergebnissen wurde eine Substanzbibliothek erstellt, die von Kooperationspartnern innerhalb der KFO 216 synthetisiert und biologisch getestet wurde. Die Struktur-Wirkungsbeziehungen, die sich aus diesen experimentellen Daten ableiten lassen, konnten teilweise gut mit den erstellten Docking-Modellen korreliert werden. Andere Effekte konnten anhand der Docking-Posen jedoch nicht erkl{\"a}rt werden. F{\"u}r die Entwicklung neuer Derivate ist deswegen eine umfassendere experimentelle Charakterisierung und darauf aufbauend eine Verfeinerung der Bindungsmodelle notwendig. Strukturell handelt es sich bei Hsp70 um ein Zwei-Dom{\"a}nen-System, dass verschiedene allostere Zust{\"a}nde einnehmen kann. Um die Auswirkungen der daraus folgenden Flexibilit{\"a}t auf die Stabilit{\"a}t der Struktur und die Bindung von Inhibitoren zu untersuchen, wurden molekulardynamische Simulationen f{\"u}r das Protein durchgef{\"u}hrt. Diese zeigen, dass das Protein tats{\"a}chlich eine {\"u}berdurchschnittlich hohe Flexibilit{\"a}t aufweist, die vor allem durch die relative Bewegung der beiden großen Dom{\"a}nen zueinander dominiert wird. Die Proteinkonformation die in der Kristallstruktur hscaz beobachtet wird, bleibt jedoch in ihrer Grundstruktur in allen vier durchgef{\"u}hrten Simulationen erhalten. Es konnten hingegen keine Hinweise daf{\"u}r gefunden werden, dass die Mutationen, welche die f{\"u}r die strukturbasierten Arbeiten verwendete Kristallstruktur im Vergleich zum Wildtyp aufweist, einen kritischen Einfluss auf die Gesamtstabilit{\"a}t des Systems haben. Obwohl die Interface-Region zwischen NBD und SBD also in allen Simulationen erhalten bleibt, wird die Konformation in diesem Bereich doch wesentlich durch die Dom{\"a}nenbewegung beeinflusst und variiert. Da dieser Proteinbereich den wahrscheinlichsten Angriffspunkt der Tetrahydroisochinolinone darstellt, wurde der Konformationsraum detailliert untersucht. Wie erwartet weist die Region eine nicht unerhebliche Flexibilit{\"a}t auf, welche zudem, im Sinne eines ``Induced-Fit''-Mechanismus, durch die Gegenwart eines Liganden (Apoptozol) stark beeinflusst wird. Es ist daher als sehr wahrscheinlich anzusehen, dass die Dynamik der Interface-Region auch einen wesentlichen Einfluss auf die Bindung der Tetrahydroisochinolinone hat. Molekuardynamische Berechnungen werden deswegen auch in zuk{\"u}nftige Arbeiten auf diesem Gebiet eine wichtige Rolle spielen. Die Analysen zeigen zudem, dass die Konformation der Interface-Region eng mit der Konformation des gesamten Proteins - vor allem im Bezug auf die relative Stellung von SBD und NBD zueinander - verkn{\"u}pft ist. Das untermauert die Hypothese, dass die Interface-Bindetasche einen Angriffspunkt f{\"u}r die Inhibtion des Proteins darstellt.},
  subject      = {Arzneimittelforschung},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Zellner2005,
  author    = {Zellner, Elisabeth},
  title     = {Wechselwirkungen zwischen Replikationsproteinen und Origin-DNA w{\"a}hrend Proliferation und terminaler Differenzierung},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-15263},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2005},
  abstract  = {Ein Teil dieser Arbeit befasste sich mit der Fragestellung, ob beim {\"U}bergang von Proliferation zu Teilungsruhe und Differenzierung irreversible Ver{\"a}nderungen in der Zusammensetzung des pr{\"a}replikativen Komplexes auftreten. Ein daf{\"u}r geeignetes System ist die murine C2C12-Zell-Linie, die durch Kultivierung in Hungermedium zu Myotuben differenziert werden k{\"o}nnen. FACS-Analyse und BrdU-Einbau ergaben, dass in den Muskelzellen keine signifikante DNA-Synthese mehr stattfindet. Die Fluktuation von Replikationsproteinen wurde im Verlauf der terminalen Differenzierung untersucht. Gleiche Mengen an Kern- und Cytoplasma-Extrakten von proliferierenden, konfluenten und sich differenzierenden Zellen wurden durch SDS-PAGE aufgetrennt und im Immunblot mit Antik{\"o}rpern gegen Replikationsproteine untersucht ORC1, CDC6, MCM6 und Geminin konnten nach 132 h nicht mehr detektiert werden, w{\"a}hrend ORC2, ORC3, MCM3, CDT1 und CDC45 zwar noch vorhanden waren, jedoch in geringerer Menge als in proliferierenden Zellen. Weiterhin wurde die Menge an Replikationsproteinen in durch Serummangel transient aus dem Zellzyklus ausgetretenen G0-Phase-Zellen und Zellen, die durch Serum reaktiviert wurden, untersucht. Die Replikationsproteine waren in quieszenten C2C12- und 3T3-Zellen gleichermaßen wie in den terminal differenzierten Zellen in verringerter Menge vorhanden. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass eine Restimulierung von quieszenten, nicht aber terminal differenzierten Zellen, die erneute Expression von Replikationsproteinen zur Folge hat. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Chromatin-Immunpr{\"a}zipitations-Experimente (ChIP) mit proliferierenden und terminal differenzierten C2C12-Zellen durchgef{\"u}hrt. Eine preRC-Assemblierungsstelle befindet sich im OBR-Bereich der murinen rRNA-Gene von -2519 bis -2152 (Fragment B). In proliferierenden C2C12-Zellen konnte die Bindung von ORC1-5, CDC6, CDT1, MCM3, MCM6, CDC45 und HP1\&\#61537; an Fragment B nachgewiesen werden. W{\"a}hrend der terminalen Differenzierung werden ORC1, CDC6, CDT1 und CDC45 von der preRC-Bindungsstelle entfernt, ORC2-5, MCM3, MCM6 und HP1\&\#61537; bleiben an Fragment B gebunden. Die Bindung von preRC-Proteinen an Fragment B sollte durch Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSAs) in vitro detailliert untersucht werden. Dazu mussten zun{\"a}chst preRC-Proteine nativ aus dem Kernextrakt proliferierender FM3A-Zellen durch Ionenaustausch- und Gelfiltrations-Chromatographie angereichert werden. Proteine in den Fraktionen B4 bis B12 bilden einen DNA-Protein-Komplex mit Fragment B. Die ATP-Abh{\"a}ngigkeit der Bildung des DNA-Protein-Komplexes wurde nachgewiesen. Die Ausbildung des DNA-Protein-Komplexes erfolgt sequenzspezifisch an Fragment B. Durch Zugabe spezifischer Antik{\"o}rper gegen ORC3 und CDT1 zur Bindungsreaktion konnte die Ausbildung des DNA-Protein-Komplexes reduziert werden. Es konnte gezeigt werden, dass die Bildung des DNA-Protein-Komplexes unabh{\"a}ngig von ATP-Hydrolyse erfolgt und dass Diadenosin-Tetraphosphat (Ap4A) die Bindung von preRC-Proteinen an die DNA nicht signifikant stimuliert. Zur Eingrenzung der preRC-Bindungsstelle wurden sowohl am 5´- als auch am 3´-Ende partiell deletierte B-Fragmente eingesetzt. Mit den um 100 bp verk{\"u}rzten Fragmenten kann der DNA-Protein-Komplex weiterhin gebildet werden. Deletionen von 200 bp entweder vom 5´- oder 3´-Ende verhindern hingegen die Ausbildung des DNA-Protein-Komplexes. Auf einem 119 bp langen Fragment (-2365 bis -2247), das zentral in Fragment B gelegen ist, kann sich der DNA-Protein-Komplex in einer ATP-stimulierten Weise wiederum ausbilden. Die Analyse dieses Bereiches zeigte, dass sich darin zwei auff{\"a}llige 9 bp-Sequenzen (CTCGGGAGA) befinden, die im Abstand von 63 bp wiederholt werden (-2343 bis -2335; -2280 bis -2272) und die durch die 200 bp-Deletionen ganz oder teilweise eliminiert wurden. Durch ortsgerichtete Mutagenese mittels PCR wurden innerhalb dieser 9 bp-Wiederholungen die Basen C zu A, T zu G und umgekehrt ausgetauscht. In vier sukzessiven Klonierungen wurden je 4 bp ersetzt (S1 bis S4), wobei die erhaltenen Konstrukte als Ausgangs-DNA f{\"u}r die nachfolgende Klonierung dienten. Die Substitutionen S1, S2 und S3 beeintr{\"a}chtigten die Ausbildung des DNA-Protein-Komplexes im Wesentlichen nicht. Wurden jedoch 8 bp in beiden 9 bp-Wiederholungen ersetzt (S4), war die Ausbildung des DNA-Protein-Komplexes nahezu vollst{\"a}ndig inhibiert. S4 hat außerdem eine leichte reduzierte elektrophoretische Mobilit{\"a}t der proteinfreien DNA-Fragmente zur Folge. Vermutlich stellen die 9 bp-Sequenzen jedoch keine Konsensus-Sequenz f{\"u}r die Bindung der preRC-Proteine per se dar, sondern haben vielmehr Effekte auf die Ausbildung spezifischer Sekund{\"a}r-Strukturen, die wiederum das Binden der preRC-Proteine an diese Region im OBR der murinen rRNA-Gene erlauben k{\"o}nnten.},
  subject      = {Replikation},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Wagner2003,
  author    = {Wagner, Nicole},
  title     = {Charakterisierung der Kernmembranproteine Lamin-B-Rezeptor und Bocksbeutel von Drosophila melanogaster},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-7245},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2003},
  abstract  = {Funktionelle Charakterisierung neuer Proteine der inneren Kernmembran von Drosophila melanogaster: Drosophila Lamin B Rezeptor (dLBR), ein integrales Membranprotein der inneren Kernmembran; Bocksbeutel alpha und Bocksbeutel beta, LEM-Dom{\"a}nen Proteine sowie deren potentiellen Interaktionspartner Drosophila Barrier-to-Autointegration Factor (dBAF).},
  subject      = {Taufliege},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Stuermer2004,
  author    = {St{\"u}rmer, Andrea},
  title     = {Interaktionen und Lokalisationen der Replikationsproteine der Maus},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-9563},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2004},
  abstract  = {Die Initiation der DNA-Replikation in Eukaryonten ist ein hochkonservierter Prozess, der in drei Stufen unterteilt werden kann. Im ersten Schritt bindet der „origin recognition complex" (ORC) an Replikationsorigins innerhalb chromosomaler DNA, wodurch eine Assemblierung des pr{\"a}replikativen Komplexes an diesen Startpunkten ausgel{\"o}st wird. An den ORC lagern sich anschließend die Proteine CDC6 und RLF-B/CDT1 an, die beide schließlich f{\"u}r die Rekrutierung des heterohexameren MCM-Komplexes verantwortlich sind. Durch die Aktivit{\"a}t der Kinase CDC7/DBF4 wird der Origin f{\"u}r den Start der DNA-Replikation lizenziert, sobald die finale Anlagerung des Initiationsfaktors CDC45 den pr{\"a}replikativen Komplex vervollst{\"a}ndigt hat. Ein Ziel der vorliegenden Arbeit war es, das komplexe Netzwerk von Protein-Protein-Interaktionen zwischen den verschiedenen Initiationsfaktoren durch FRET-Studien aufzukl{\"a}ren. Es konnten Interaktionen zwischen MCM5 und MCM3, MCM5 und MCM7, ORC5 und MCM7, sowie CDT1 und MCM6 in vivo nachgewiesen werden. Die vorliegende Arbeit hatte weiterhin die Untersuchung der intrazellul{\"a}ren Lokalisation der sechs murinen MCM-Proteine in Fibroblasten-Zellen der Maus zum Ziel.Lokalisationsstudien der EGFP-gekoppelten MCM-Proteine zeigten, dass die Proteine EGFP-MCM4, MCM4-EGFP, MCM4-NLS-EGFP, EGFP-MCM5, MCM5-EGFP, MCM5-NLS-EGFP, und EGFP-MCM7 u.a. am Centrosom lokalisiert sind. Durch Immunfluoreszenz-F{\"a}rbung mit Antik{\"o}rpern gegen eine konservierte Dom{\"a}ne aller sechs MCM-Untereinheiten sowie mit spezifischen MCM3- und MCM6-Antik{\"o}rpern konnte eine centrosomale Lokalisation auch f{\"u}r die endogenen Proteine nachgewiesen werden. Zus{\"a}tzlich zu den Lokalisationsanalysen konnte {\"u}ber Immunpr{\"a}zipitationsstudien gezeigt werden, dass MCM3 und MCM6 mit dem centrosomalen Protein g-Tubulin pr{\"a}zipitierbar sind. Die Tatsache, dass alle Untereinheiten des MCM-Komplexes mit dem Centrosom assoziiert sind, deutet darauf hin, dass die MCM-Proteine am Centrosom als Multiproteinkomplex gebunden sind. Da MCM3 und MCM6 auch in allen Mitose-Stadien an das Centrosom gebunden sind, kann von einer funktionellen Aufgabe dieser Proteine w{\"a}hrend der Zellteilung ausgegangen werden. Im letzten Teil dieser Arbeit sollte die Funktion der MCM-Proteine am Centrosom durch „knock-down" des Proteins MCM3 mittels RNA-Interferenz-Studien untersucht werden. Ziel war, ein induzierbares MCM3-siRNA-exprimierendes System zu etablieren. Das gezielte An- und Abschalten der MCM3siRNA-Transkription sollte durch das TetOn-System erm{\"o}glicht werden. Bei diesem System wird durch Zugabe von Doxycyclin die Transkription aktiviert, bei Abwesenheit von Doxycyclin wird sie abgeschaltet. Auf dieser Basis wurde der Einfluss von Doxycyclin auf das Wachstumsverhalten der MCM3siRNA-exprimierenden Zelllinie untersucht. Im Vergleich zu NIH/3T3-Zellen und NIH/3T3-TetOn-Zellen konnte eine deutlich reduzierte Proliferation bei Behandlung der Zellen mit Doxycyclin beobachtet werden. Diese Ergebnisse deuten auf eine durch Produktion von MCM3siRNA verursachte St{\"o}rung des Zellwachstums hin. Zus{\"a}tzlich beeinflusst die durch Doxycyclin induzierte Synthese von MCM3siRNA die Zellzyklusverteilung. So befinden sich nach Doxycyclinbehandlung mehr Zellen in der G2/M-Phase als in unbehandelten, asynchronen NIH/3T3-Zellen. Die MCM3-Proteinmenge wurde nach 19 Tagen Doxycyclinbehandlung fast vollst{\"a}ndig durch die produzierte MCM3siRNA herunterreguliert. Um einen m{\"o}glichen Einfluss der MCM3siRNA auf andere MCM-Proteine zu untersuchen, wurde der Protein-Level von MCM6 analysiert. Dabei wurde eine vermehrte MCM6-Expression nachgewiesen. Diese Beobachtung deutet darauf hin, dass durch Bildung von MCM3siRNA der Expressions-Level von MCM6 beeinflusst wird. Auff{\"a}llig h{\"a}ufig lagen in MCM3-„knock-down"-Zellen mehrere Zellkerne vor. Neben Zellen mit zwei Zellkernen finden sich auch Zellen mit einer ungeraden Anzahl an Zellkernen. Demnach durchlaufen die Zellkerne in einer Zelle unterschiedliche Zellzyklusstadien. Die Ph{\"a}notypen, die nach Transkription der MCM3siRNA beobachtet wurden, sind komplex und zeigen Defekte in zahlreichen Mitose-Stadien. Das Auftreten multinukle{\"a}rer Zellen ist auf eine fehlende Cytokinese zur{\"u}ckzuf{\"u}hren. Die Mikrotubuli waren in den MCM3-„knock-down"-Zellen nur unzureichend organisiert, wobei sie kaum mit der Zellperipherie verankert waren. Diese Resultate weisen darauf hin, dass die MCM-Proteine neben ihrer essentiellen Rolle in der Ausbildung des pr{\"a}replikativen Komplexes eine zus{\"a}tzliche Funktion in der Mitose aus{\"u}ben.},
  subject      = {Replikation},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Strehle2003,
  author    = {Strehle, Marion A.},
  title     = {Mikroskopische und spektroskopische Charakterisierung biologisch relevanter Oberfl{\"a}chen},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-5775},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2003},
  abstract  = {In dieser Arbeit werden biologisch relevante Oberfl{\"a}chen untersucht, die in der Medizin bzw. in der Biologie eine wichtige Rolle spielen. Die Proteinadsorption auf Implantat-Oberfl{\"a}chen wurde charakterisiert, um wichtige Informationen {\"u}ber den Adsorptionsprozess zu erhalten. Das Fernziel hierbei ist, durch ein umfassendes Wissen {\"u}ber diesen f{\"u}r die Implantation wichtigen Schritt Biomaterialien mit m{\"o}glichst hoher Gewebevertr{\"a}glichkeit zu entwickeln. Die Verteilung von Propolis auf der Wachs-Oberfl{\"a}che von Bienenwaben wurde untersucht, um mehr {\"u}ber dessen Nutzen, der noch nicht vollst{\"a}ndig aufgekl{\"a}rt ist, zu erfahren und um auf m{\"o}gliche Auswirkungen einer ver{\"a}nderten Wabenstruktur auf die Kommunikation der Honigbienen R{\"u}ckschl{\"u}sse ziehen zu k{\"o}nnen. Das Ziel des ersten Teils dieser Arbeit war, das Adsorptionsverhalten der Proteine Fibrinogen, Albumin und Fibronektin auf Titandioxid, einem in der Medizin h{\"a}ufig als Implantat eingesetzten Material, zu studieren. Die Adsorption von Proteinen auf der Oberfl{\"a}che von Implantaten ist ein wichtiger Schritt f{\"u}r die Gewebevertr{\"a}glichkeit bzw. Biokompatibilit{\"a}t dieser Materialien. Es wurden sowohl die r{\"a}umliche Verteilung der Proteine auf den Implantat-Oberfl{\"a}chen als auch die durch die Adsorption hervorgerufenen strukturellen Ver{\"a}nderungen der Proteine untersucht. Als Methoden wurden hierf{\"u}r die Laser-Raster-Mikroskopie (LSM), die Kraftfeldmikroskopie (AFM) sowie die Raman-Spektroskopie eingesetzt. Durch ein umfassendes Wissen {\"u}ber den Adsorptionsprozess der Proteine auf Implantat-Materialien k{\"o}nnen die Oberfl{\"a}chen der Implantate dahingehend ver{\"a}ndert werden, dass es zu einer besseren Proteinadsorption und dadurch zu einer noch geringeren Rate an Abstoßungsreaktionen kommt. Die in dieser Arbeit vorgestellten Ergebnisse k{\"o}nnen einen Teil zum Verst{\"a}ndnis des Adsorptionsprozesses beitragen. Das Ziel des zweiten Teils dieser Arbeit war es, die chemische Zusammensetzung von Propolis (dem Kittharz der Bienen) und Wabenwachs von Apis mellifera carnica Pollm. sowie die r{\"a}umliche Verteilung von Propolis auf den Waben-Oberfl{\"a}chen zu untersuchen. Hierzu wurden die Raman-Spektroskopie und Raman-Mapping eingesetzt. Es wurden zun{\"a}chst Raman-Spektren von Propolis-Proben sowie Raman-Spektren von charakteristischen Standardsubstanzen des Propolis aufgenommen. Das Propolis-Spektrum sowie das Wachs-Spektrum wurden durch eine Auswahl an Standardsubstanzen simuliert. Um herauszufinden, welche Harze von den Bienen gesammelt und als Propolis im Stock verwendet werden, wurden von einigen Harzen, die als Propolis-Quellen in Betracht kommen, Raman-Spektren aufgenommen. Es wurde auch analysiert, ob die Kettenl{\"a}ngen der Alkane, aus denen die Wachse bestehen, einen Einfluss auf die Raman-Spektren hat. Mittels Raman-Mapping wurde schließlich die r{\"a}umliche Verteilung von Propolis auf der Waben-Oberfl{\"a}che untersucht. Die hier charakterisierten biologisch relevanten Oberfl{\"a}chen spielen eine wichtige Rolle in der Medizin und in der Biologie. Die Analyse mit mikroskopischen und spektroskopischen Methoden verschafft einen Einblick in die Prozesse, die sich an diesen Oberfl{\"a}chen abspielen. Die Proteinadsorption auf Implantat-Oberfl{\"a}chen sind f{\"u}r die Implantationsmedizin von Bedeutung. Es werden st{\"a}ndig neue Materialien entwickelt, die eine m{\"o}glichst gute Biokompatibilit{\"a}t aufweisen sollen. Erkenntnisse {\"u}ber die Prozesse, die hierf{\"u}r eine Rolle spielen, helfen bei der Entwicklung neuer Materialien. Die Verteilung von Propolis auf den Wachs-Oberfl{\"a}chen hat einen Einfluss auf die Materialbeschaffenheit der Waben. Dies k{\"o}nnte die Vibrationsweiterleitung beim Schw{\"a}nzeltanz der Honigbienen, der f{\"u}r deren Kommunikation von Bedeutung ist, beeinflussen. Die Verteilung des Propolis auf den Waben konnte f{\"u}r kleine Ausschnitte gezeigt werden. Inwiefern eine Propolisschicht auf den Stegen der Waben die Vibrationsweiterleitung tats{\"a}chlich beeinflusst, muss durch weiterf{\"u}hrende Experimente herausgefunden werden.},
  subject      = {Implantat},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Schaafhausen2011,
  author    = {Schaafhausen, Anne},
  title     = {Proteininteraktionen der Vitamin K Epoxid Reduktase Proteine VKORC1 und VKORC1L1},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-55442},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2011},
  abstract  = {Seit der Entdeckung des ersten Gens f{\"u}r den Vitamin K Epoxid-Reduktase-Komplex (VKORC1), dem Schl{\"u}ssel-Enzym f{\"u}r die Regenerierung von Vitamin K, sind keine zus{\"a}tzlichen Komponenten des Komplexes beschrieben worden. Die einzige bekannte Funktion von VKORC1 ist bislang die Reduktion von Vitamin K-2,3-Epoxid, welches bei der post-translationalen Carboxylierung von Proteinen als oxidierter Kofaktor anf{\"a}llt, und im sogenannten Vitamin K-Zyklus regeneriert wird. VKORC1 ist zugleich das Zielprotein antikoagulativer Medikamente der Coumarin-Gruppe, wie Warfarin oder Marcumar. Mutationen im VKORC1-Gen f{\"u}hren zu einem signifikanten Effekt auf die ben{\"o}tigte Coumarin-Dosis und die Stabilit{\"a}t der H{\"a}mostase in der Thrombosebehandlung mit Antikoagulanzien. Gleichzeitig mit VKORC1 wurde ein stark sequenz-homologes Protein identifiziert, das „VKORC1-like1" (VKORC1L1) genannt wurde und dessen physiologische Funktion zu Beginn dieser Arbeit v{\"o}llig unbekannt war. Die vorliegende Arbeit besch{\"a}ftigte sich mit zwei Aspekten des Vitamin K-Stoffwechsels: A. Den enzym-kinetischen Eigenschaften und der subzellul{\"a}ren Lokalisation des VKORC1L1-Proteins sowie B. der Identifizierung und Charakterisierung von Proteinen, die Interaktionspartner der beiden VKOR-Proteine sein k{\"o}nnen. Die Ergebnisse k{\"o}nnen wie folgt zusammengefasst werden: A.1. Die enzym-kinetischen Untersuchungen zeigen starke {\"A}hnlichkeiten zwischen VKORC1 und VKORC1L1: Beide Enzyme haben eine Vitamin K-Epoxidase- und -Reduktase-Aktivit{\"a}t, wobei die Affinit{\"a}ten zu Vitamin K2-Epoxid deutlich h{\"o}her sind als die zu Vitamin K1-Epoxid. Beide Enzyme sind durch Warfarin hemmbar und der Austausch der vermutlich am Elektronentransfer beteiligten Cysteine an homologen Positionen f{\"u}hrt in beiden Proteinen zu einem fast vollst{\"a}ndigen Verlust der Aktivit{\"a}t. A.2. Mittels Ko-Lokalisation konnte VKORC1L1 - wie VKORC1 - in der ER-Membran lokalisiert werden. Folglich schließen wir, dass VKORC1L1 eine {\"a}hnliche Struktur, die gleiche zellul{\"a}re Lokalisation und zumindest in vitro auch eine VKOR-Aktivit{\"a}t hat und daher eventuell eine weitere Komponente des VKOR-Komplexes darstellen k{\"o}nnte. Allerdings sprechen gewichtige Argumente dagegen, dass beide Proteine funktionell austauschbar sind: Sowohl bei Patienten mit Mutationen in VKORC1 (VKCDF2-Erkrankung), als auch bei VKORC1-Knock-out M{\"a}usen kann das intaktes VKORC1L1-Protein die inaktivierende Mutation im C1-Gen nicht kompensieren. B.1. Mit einem f{\"u}r Membranproteine adaptierten, modifizierten Yeast-Two-Hybrid Screen (Split-Ubiquitin-System) konnten mit VKORC1 und VKORC1L1 als K{\"o}der 114 Proteine aus einer Leber-cDNA-Bank als potentielle Interaktionspartner identifiziert werden. Davon wurden 6 Proteine aufgrund ihrer Trefferh{\"a}ufigkeit und funktioneller {\"U}berlegungen mit Hilfe von Ko-Immunpr{\"a}zipitationsexperimenten und Ko-Immunlokalisation n{\"a}her untersucht. Interessanterweise zeigen die beiden Trefferlisten starke {\"U}berschneidungen. B.2. Es konnte eine in vitro- Interaktion von VKORC1 mit sich selbst und mit VKORC1L1 nachgewiesen werden, die bisher nicht bekannt war. Dies k{\"o}nnte auf der hohen Sequenz- und Struktur-Homologie der beiden Proteine beruhen, f{\"u}hrt aber auch zu neuen Hypothesen bez{\"u}glich des Vitamin K-Stoffwechsels. B.3. Die Interaktion von VKORC1 und dem „stress-associated endoplasmic reticulum protein 1" (SERP1) bringt Vitamin K in Zusammenhang mit oxidativem Stress. Dazu passen auch die neuesten Ergebnisse aus der Arbeitsgruppe von Johannes Oldenburg (vormals W{\"u}rzburg, jetzt Bonn) zur Funktion von VKORC1L1, die eine protektive Rolle von Vitamin K beim Schutz der Zelle vor reaktiven Sauerstoffverbindungen nahe legen. Ob und wie Vitamin K und VKORC1L1 einen neuen Schutzmechanismus gegen Sauerstoffradikale bilden bedarf weiterer Untersuchungen. B.4. Ferner wurde eine Interaktion zwischen VKORC1 und dem „Emopamil-binding-protein" (EBP) nachgewiesen. Mutationen in EBP f{\"u}hren zu der seltenen genetischen Krankheit Chondrodysplasia punctata. Die {\"A}hnlichkeit der Symptomatik zwischen Chondrodysplasia punctata und der sogenannten Warfarin-Embryopathie, die durch {\"u}berh{\"o}hte Dosierung von Coumarinen w{\"a}hrend der Schwangerschaft verursacht wird, legt einen Zusammenhang zwischen Vitamin K- und dem Kalziumstoffwechsel nahe. B5. In den Ko-Immunpr{\"a}zipitationsexperimenten nicht best{\"a}tigt haben sich die initial positiven Proteine Protein-Disulfid-Isomerase (PDIA6), CD63, und Fibrinogen-Gamma (FGG). Die Ergebnisse geben Hinweise auf neue Funktionen der VKOR-Proteine beim Schutz vor oxidativem Stress und in der Verbindung zum Kalzium-Stoffwechsel. Beide Aspekte bed{\"u}rfen weiterf{\"u}hrender Untersuchungen. Im Hinblick auf diese neuen Funktionen w{\"a}re auch eine kritische Betrachtung der {\"u}brigen 85 prim{\"a}ren Treffer des Split-Ubiquitin-Screens sinnvoll.},
  subject      = {Vitamin-K-Gruppe},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Putics2006,
  author    = {Putics, Akos},
  title     = {Enzymatische Aktivit{\"a}ten des coronaviralen nichtstrukturellen Proteins 3},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-19449},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2006},
  abstract  = {Coronaviren k{\"o}nnen sowohl den Menschen als auch zahlreiche Tierspezies infizieren und verursachen vor allem respiratorische und enterale Erkrankungen. Die Replikation des etwa 27-32 kb großen, einzelstr{\"a}ngigen RNA-Genoms positiver Polarit{\"a}t und die Synthese zahlreicher subgenomischer RNAs erfolgt durch einen Multi-Enzym-Komplex, der bis zu 16 virale nichtstrukturelle Proteine (nsp) und einige zellul{\"a}re Proteine umfaßt. Die einzelnen nichtstrukturellen Proteine werden durch proteolytische Prozessierung der vom Replikasegen kodierten Vorl{\"a}ufer-Polyproteine (pp1a/pp1ab) unter Beteiligung viraler Proteasen freigesetzt. Das gr{\"o}ßte replikative Protein, nsp3, befindet sich im aminoterminalen Bereich der Polyproteine pp1a/pp1ab. Trotz des geringen Konservierungsgrades dieser Region wurden bestimmte funktionelle Dom{\"a}nen, die in allen coronaviralen nsp3 konserviert sind, identifiziert. Dazu geh{\"o}ren: eine saure Dom{\"a}ne, zwei Papain-{\"a}hnliche Proteasen (PL1pro und PL2pro) sowie zwei weitere konservierte Dom{\"a}nen (X- bzw. Y-Dom{\"a}ne). Fr{\"u}here Studien konzentrierten sich vor allem auf die PLpro-Dom{\"a}nen, w{\"a}hrend die Funktionen der anderen nsp3-Dom{\"a}nen bisher nicht untersucht wurden. Um weitere Einblicke in die nsp3-vermittelten Aktivit{\"a}ten und ihre Funktionen im coronaviralen Lebenszyklus zu gewinnen, wurden im Rahmen dieser Arbeit die enzymatischen Aktivit{\"a}ten von zwei nsp3-Dom{\"a}nen, PLpro und X, n{\"a}her charakterisiert. Coronavirale Papain-{\"a}hnliche Proteasen spalten den aminoproximalen Bereich der Polyproteine pp1a/pp1ab und sind somit an der Freisetzung von nsp1, nsp2 und nsp3 beteiligt. In der vorliegenden Arbeit wurde die durch die PLpro vermittelte proteolytische Prozessierung des N-terminalen Endes von nsp3 bei TGEV und SARS-CoV analysiert. {\"U}bereinstimmend mit fr{\"u}heren Vorhersagen ergaben In-vitro-Translationsexperimente und Proteinsequenzierungen, dass die TGEV-PL1pro die Peptidbindung zwischen Gly879 und Gly880 spaltet, wodurch das aminoterminale Ende von nsp3 bzw. das carboxyterminale Ende von nsp2 freigesetzt werden. Diese Schnittstelle entpricht bei SARS-CoV der Sequenz Gly818|Ala819, die jedoch bei diesem Virus von der PL2pro prozessiert wird. Mutationsanalysen ergaben weiterhin, dass die Reste Cys1093 (TGEV-PL1pro) und Cys1651 (SARS-CoV-PL2pro) f{\"u}r die proteolytische Aktivit{\"a}t essentiell sind. Diese Daten st{\"u}tzen Vorhersagen zu m{\"o}glichen katalytischen (nukleophilen) Funktionen dieser beiden Reste. Dar{\"u}ber hinaus wurde das stromaufw{\"a}rts gelegene nsp2 in TGEV-infizierten Zellen identifiziert. Diese Daten, zusammen mit vorherigen Studien, legen den Schluss nahe, dass die Coronavirus-PLpro-vermittelte proteolytische Prozessierung -trotz der geringen Konservierung des Polyproteinsubstrates und bestehender Unterschiede hinsichtlich der Anzahl konservierter PLpro-Dom{\"a}nen- weitgehend konserviert ist. Im zweiten Teil der Arbeit sollte die enzymatische Aktivit{\"a}t einer weiteren konservierten Dom{\"a}ne im coronaviralen nsp3, der sogenannten X-Dom{\"a}ne, untersucht werden. F{\"u}r diese Dom{\"a}ne war eine ADP-Ribose-1"-Monophosphatase-Aktivit{\"a}t (Appr-1"-pase) vorhergesagt worden. Um die Eigenschaften dieser Proteine n{\"a}her zu bestimmen und m{\"o}glicherweise existierende Gemeinsamkeiten zwischen coronaviralen Enzymen, die den viralen Lebenszyklus steuern und/oder kontrollieren, zu identifizieren, wurden die X-Dom{\"a}nen von drei verschiedenen Coronaviren, HCoV-229E, TGEV und SARS-CoV, die unterschiedlichen serologischen Coronavirus-Gruppen angeh{\"o}ren, in vitro untersucht und miteinander verglichen. Es konnte gezeigt werden, dass bakteriell (E.coli-) exprimierte X-Dom{\"a}nen aller drei untersuchten Viren ADP-Ribose-1"-Phosphat, ein Nebenprodukt des zellul{\"a}ren tRNA-Splicings, zu ADP-Ribose dephosphorylieren k{\"o}nnen. Diese Daten beweisen zweifelsfrei die Appr-1"-pase-Aktivit{\"a}t coronaviraler X-Dom{\"a}nen und lassen vermuten, dass diese Aktivit{\"a}t bei allen Coronaviren konserviert ist. Weitere Untersuchungen zur Substratspezifit{\"a}t und zu m{\"o}glichen katalytischen Resten des Enzyms wurden mit Hilfe bakteriell exprimierter, mutierter Formen der HCoV-229E-X-Dom{\"a}ne durchgef{\"u}hrt. Die gewonnenen Daten legen die Vermutung nahe, dass die Phosphohydrolaseaktivit{\"a}t hochspezifisch f{\"u}r das Substrat Appr-1"-p ist und die HCoV-229E-pp1a/pp1ab-Reste Asn1302, Asn1305, His1310, Gly1312 und Gly1313 an der Ausbildung des aktiven Zentrum des Enzyms beteiligt sind. Abschließend wurde die Funktion der Appr-1"-pase-Aktivit{\"a}t mit Hilfe einer HCoV-229E-Mutante, in der die Appr-1"-pase-Aktivit{\"a}t durch ortsspezifische Mutagenese ausgeschaltet wurde, in Zellkultur analysiert. {\"U}berraschenderweise hatte die Mutation keine nachweisbare Auswirkung auf die virale RNA-Synthese oder den Virustiter, und sie erwies sich auch nach sechs Passagen in Zellkultur als stabil. Die Tatsache, dass die Appr-1"-pase-Aktivit{\"a}t f{\"u}r die Replikation und Transkription von HCoV-229E entbehrlich ist, zeigt, dass Coronavirus-Replikasegene auch nichtessentielle Funktionen kodieren, die m{\"o}glicherweise akzessorische und/oder regulatorische Funktionen besitzen und nur unter bestimmten Bedingungen (z.B. im infizierten Wirt) einen Selektionsvorteil bieten bzw. essentiell sind. Weitere Studien sind erforderlich, um die biologische Funktion der X-Dom{\"a}ne im Detail zu bestimmen.},
  subject      = {Coronaviren},
  language  = {de}
}
@phdthesis{JungbauergebUlzhoefer2018,
  author    = {Jungbauer [geb. Ulzh{\"o}fer], Sandra Gabi},
  title     = {Die Rolle pr{\"a}synaptischer Proteine Aktiver Zonen bei konditionierten Lernprozessen},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-169090},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2018},
  abstract  = {Synaptische Plastizit{\"a}t wird als Grundlage f{\"u}r Lern- und Ged{\"a}chtnisprozesse in unserem Gehirn angesehen. Aktive Zonen (AZ) und ihre spezifischen Proteine modulieren diesen Prozess und bahnen essentielle Vorg{\"a}nge der synaptischen Transmission. In dieser Arbeit wurden drei zentrale Proteine Aktiver Zonen - Bruchpilot, RIM (Rab3 interacting molecule) und Fife - untersucht und ihre Rolle bei konditionierten Lernprozessen in Drosophila melanogaster Larven gepr{\"u}ft. Hierzu wurde das etablierte Paradigma des larvalen appetitiven olfaktorischen Lernens genutzt, bei dem eine Gruppe von Larven lernt, einen Duft mit einem gustatorischen Verst{\"a}rker zu koppeln. Durch die vielf{\"a}ltigen genetischen Manipulationsm{\"o}glichkeiten des Modellorganismus war es m{\"o}glich, die Funktion der Proteine bei assoziativen Lernvorg{\"a}ngen selektiv zu betrachten. Bruchpilot wird f{\"u}r den funktionellen Aufbau Aktiver Zonen in Drosophila ben{\"o}tigt und ist wichtig f{\"u}r die Akkumulation von Calcium-Kan{\"a}len in der N{\"a}he von AZ. Durch gentechnische Ver{\"a}nderungen dieses Proteins ließ sich jedoch keine Beeintr{\"a}chtigung im olfaktorischen Lernverhalten von Drosophila Larven beobachten. RIM fungiert durch seine Interaktionsdom{\"a}nen als Bindeglied zwischen verschiedensten Effektoren und hat Einfluss auf synaptische Plastizit{\"a}t. Es wurde gezeigt, dass eine Punktmutation in der C2A-Dom{\"a}ne von RIM beim Menschen gleichzeitig zur Retinadegeneration und zu einem gesteigert verbalen IQ (Intelligenzquotient) f{\"u}hrt. Eine durch die hohe Homologie vergleichbare Mutation im Drosophila-Genom resultierte nicht in einem ver{\"a}nderten Ph{\"a}notyp im olfaktorischen Lernen. Fife ist ein Protein, das f{\"u}r eine funktionsf{\"a}hige Architektur von AZ und damit u.a. f{\"u}r den reibungslosen Vesikelverkehr zust{\"a}ndig ist. Es zeigte sich, dass dieses Protein auch synaptische Plastizit{\"a}t und Lernvorg{\"a}nge beeinflusst. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit sind ein Beitrag, um die Zusammenh{\"a}nge der synaptischen Plastizit{\"a}t und die Funktion Aktiver Zonen Proteine besser begreifen zu k{\"o}nnen. Hervorzuheben dabei ist, dass die Bruchpilot- und RIM-Mutanten-Larven keinen ver{\"a}nderten Ph{\"a}notyp, bzw. bei Fife nur teilweise einen eingeschr{\"a}nkten Ph{\"a}notyp im olfaktorischen larvalen Lernen im Vergleich zu den Wildtyp-Kontrollen zeigten. Gleichwohl man fr{\"u}her schon signifikante strukturelle Ver{\"a}nderungen an Aktiven Zonen dieser Mutanten an der neuromuskul{\"a}ren Endplatte und auch Effekte auf das Verhalten in adulten Drosophila gefunden hat. Es wird entscheidend sein, den Zusammenhang zwischen Struktur und Funktion Aktiver Zonen Proteine weiter zu konkretisieren.},
  subject      = {Plastizit{\"a}t},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Hoevel2001,
  author    = {H{\"o}vel, Thorsten},
  title     = {Charakterisierung der Funktion des Tight Junction Proteins hu-CLDN1 und seine Bedeutung bei der Tumorgenese},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-1409},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2001},
  abstract  = {Vor 2 Jahren wurden erstmals die wahrscheinlich wichtigsten Tight Junction Proteine, Claudin-1 und -2 in der Maus beschrieben. An Hand von Sequenzhomologien konnten bis heute dieser 4 Transmembrandom{\"a}nen Proteinfamilie 18 Mitglieder mit unterschiedlichen Gewebeverteilungen zugeordnet werden. Parallel zum murinen Claudin-1 wurde von (Swisshelm et al. 1999) das humane Claudin-1 mit einer 91 prozentigen Sequenzhomologie zum murinen Protein isoliert und molekulargenetisch beschrieben. In der {\"u}berwiegenden Mehrzahl von Brusttumorzellinien ist die Expression von hu-CLDN1 verloren gegangen. In der vorliegenden Arbeit sollte deshalb die biologische Funktion des humanen Claudin-1 (hu-CLDN1) und dessen Relevanz w{\"a}hrend der Tumorgenese untersucht werden. F{\"u}r diese Aufgabenstellung mußten monoklonale Antik{\"o}rper mittels DNA Vakzinierung und hu-CLDN1 Retroviren zur effektiven Transduktion von Tumorzellen entwickelt werden. Die Antik{\"o}rper wurden in ELISA, kompetitiven hu-CLDN1 Peptid ELISA und Western Blot auf ihre hu-CLDN1 Spezifit{\"a}t und Epitoperkennungsstelle {\"u}berpr{\"u}ft. F{\"u}r biologische Untersuchungen wurden f{\"u}r die neuen Antik{\"o}rper optimale immunzytochemische und immunhistochemische Methoden etabliert. Mit Hilfe der monoklonalen Antik{\"o}rper wurde die zellul{\"a}re Proteinexpression und die Lokalisation, als auch die Expression von hu-CLDN1 in Gewebeschnitten von Tumoren- und Normalgewebe untersucht. Vor 2 Jahren wurden erstmals die wahrscheinlich wichtigsten Tight Junction Proteine, Claudin-1 und -2 in der Maus beschrieben. An Hand von Sequenzhomologien konnten bis heute dieser 4 Transmembrandom{\"a}nen Proteinfamilie 18 Mitglieder mit unterschiedlichen Gewebeverteilungen zugeordnet werden. Parallel zum murinen Claudin-1 wurde von (Swisshelm et al. 1999) das humane Claudin-1 mit einer 91 prozentigen Sequenzhomologie zum murinen Protein isoliert und molekulargenetisch beschrieben. In der {\"u}berwiegenden Mehrzahl von Brusttumorzellinien ist die Expression von hu-CLDN1 verloren gegangen. In der vorliegenden Arbeit sollte deshalb die biologische Funktion des humanen Claudin-1 (hu-CLDN1) und dessen Relevanz w{\"a}hrend der Tumorgenese untersucht werden. F{\"u}r diese Aufgabenstellung mußten monoklonale Antik{\"o}rper mittels DNA Vakzinierung und hu-CLDN1 Retroviren zur effektiven Transduktion von Tumorzellen entwickelt werden. Die Antik{\"o}rper wurden in ELISA, kompetitiven hu-CLDN1 Peptid ELISA und Western Blot auf ihre hu-CLDN1 Spezifit{\"a}t und Epitoperkennungsstelle {\"u}berpr{\"u}ft. F{\"u}r biologische Untersuchungen wurden f{\"u}r die neuen Antik{\"o}rper optimale immunzytochemische und immunhistochemische Methoden etabliert. Mit Hilfe der monoklonalen Antik{\"o}rper wurde die zellul{\"a}re Proteinexpression und die Lokalisation, als auch die Expression von hu-CLDN1 in Gewebeschnitten von Tumoren- und Normalgewebe untersucht. F{\"u}r die Reexpression von hu-CLDN1 in Brusttumorzellen wurden retrovirale Genshuttlesysteme hergestellt. Die retroviralen Genshuttlesysteme basieren auf dem MoMuLV Grundger{\"u}st und als Besonderheit wurde der l-NGFR Rezeptor zur schnellen und sicheren Identifkation transduzierter Zellen einkloniert. Hergestellt wurde ein Mock Kontrollvektor (nur l-NGFR) und der hu-CLDN1 Vektor mit l-NGFR. Die hu-CLDN1 retroviralen {\"U}berst{\"a}nde wurden verwendet, um verschiedene Brusttumorzellinien zu transduzieren. Die Expression von hu-CLDN1 wurde mittels eigens entwickelter quantitativer gekoppelter Reverser Transkription Polymerase Ketten Reaktion (qRT PCR) in verschiedenen Brusttumorzellinien untersucht. Wie aus der vorliegenden Arbeit ersichtlich, konnten erstmalig monoklonale Antik{\"o}rper gegen hu-CLDN1 entwickelt werden. Diese sind spezifisch und haben eine hohe Sensitivit{\"a}t gegen{\"u}ber hu-CLDN1. Desweiteren gelang es erstmals Antik{\"o}rper gegen alle 4 extra- und intrazellul{\"a}ren Dom{\"a}nen zu gewinnen. Mit diesen Antik{\"o}rpern gelang es nachzuweisen, daß es sich bei hu-CLDN1 um ein ausschließlich membranst{\"a}ndiges Protein handelt. Die Expression des Proteins findet sich nur in konfluenten Zellkulturen von nat{\"u}rlicherweise hu-CLDN1 exprimierenden Brusttumorzellen (T47D, MCF7), wobei die Lokalisation ausschließlich auf die Zell-Zell Kontaktstelle beschr{\"a}nkt ist. Bei der hu-CLDN1 Transduktion in hu-CLDN1 negativen Brusttumorzellinen zeigte sich eine konstitutive mRNA Expression in subkonfluenten und konfluenten Zellkulturen. Allerdings ist fluoreszenzmikroskopisch hu-CLDN1 Protein nur in konfluenten Zellkulturen nachweisbar, wobei diese Tumorzellen das Protein korrekt nur an der Zell-Zell Kontaktstelle einbauen. Offensichtlich haben die hu-CLDN1 negativen Brusttumorzellen noch den intakten Signalweg zur korrekten Expression mit einer noch unbekannten posttranskriptionellen Kontrolle. Bemerkenswert ist in diesem Zusammenhang, daß in Brusttumorzellen, die weder Occludin noch ZO-1 exprimieren (MDA-MB-435) die physiologisch korrekte Expression von hu-CLDN1 existiert. Offensichtlich ist die Lokalisation von hu-CLDN1 von beiden Proteinen unabh{\"a}ngig. Die Analyse von unterschiedlichen hu-CLDN1 positiven und negativen Brusttumorzellen zeigte, daß der Verlust der hu-CLDN1 Expression besser zur in vitro Invasivit{\"a}t von Brusttumorzellen korreliert als der Expressionsverlust von Occludin und ZO-1. Die klinische Relevanz des Verlustes von hu-CLDN1 w{\"a}hrend der Tumorgenese wurde bei den Expressionsanalysen auf normalen Brust- und Darmgewebe gegen{\"u}ber transformierten Brust- und Darmgewebe untersucht. Bei der Analyse von normalem Brustgewebe konnte festgestellt werden, daß hu-CLDN1 ein rein epthelial/endotheliales Protein mit eindeutiger Membranlokalisation darstellt. In den untersuchten transformierten Geweben zeigte keines der transformierten Gewebe mehr die membranst{\"a}ndige F{\"a}rbung, sondern nur noch zytoplasmatische F{\"a}rbung. Desweiteren war eine signifikant reduzierte oder nicht vorhandene hu-CLDN1 F{\"a}rbung in einer gr{\"o}ßeren Anzahl von Tumoren zu beobachten. Diese Ergebnisse zeigen, daß der Verlust der Expression zumindest bei der Brust- und Darmtumorentwicklung offensichtlich mit der in vivo Tumorprogression korreliert. Um die Bedeutung der hu-CLDN1 Relokalisation bzw. verringerten Expression w{\"a}hrend der Tumorgenese zellphysiologisch zu verstehen, wurden in vitro Zellkulturstudien mit hu-CLDN1 negativen Zellinien und ihren hu-CLDN1 transduzierten Tochterpopulationen durchgef{\"u}hrt. In den adh{\"a}renten Zellkulturen hat die hu-CLDN1 Expression keinen Einfluß auf Zellwachstum und Apoptose. Allerdings zeigte sich in drei dimensional wachsenden Tumorzellaggregaten, daß die Reexpression von hu-CLDN1 zu einer drastischen Erh{\"o}hung der Apoptose f{\"u}hrt. Die parazellul{\"a}ren Fluxstudien ergaben, daß bei der Reexpression von hu-CLDN1 in Brusttumorzellen der parazellul{\"a}re Flux zwischen den Zellen deutlich zur{\"u}ckgeht. Somit k{\"o}nnte die reduzierte Wachstumskapazit{\"a}t bzw. erh{\"o}hte Apoptose in 3 D Kulturen mit einer reduzierten Zug{\"a}nglichkeit von N{\"a}hrstoffen und Wachstumsfaktoren in hu-CLDN1 transduzierten Zellen verursacht sein. Dies w{\"u}rde auch erkl{\"a}ren, warum bei den untersuchten transformierten noch hu-CLDN1 positiven Brust- und Darmtumorgeweben sich ausschließlich eine zytoplasmatische Lokalisation in den Tumorzellen findet. W{\"a}hrend in Organen und Dr{\"u}sengeweben Epithelien einschichtig vorkommen und die Versorgung der Zellen mit Wachstumsfaktoren basolateral oder apikal durch Diffusion und Mikro-/Makropinozytose erfolgen kann, wachsen Tumorepithelzellen mehrschichtig. W{\"a}ren die Tight Junctions im Tumor noch intakt, so k{\"o}nnte es zu einer Mangelversorgung und somit zur Apoptose kommen. F{\"u}r das in vivo Wachstum eines Tumors ist es also notwendig, Membranproteine, die den parazellul{\"a}ren Flux inhibieren, zu verringern. Wie die zellphysiologischen in vitro Studien der vorliegenden Arbeit zeigen, ist es aber m{\"o}glich, einen tumorinhibierenden Effekt allein durch die Reexpression von hu-CLDN1 unabh{\"a}ngig von Occludin und ZO-1 zu erreichen. In diesem Sinne kann zumindest zellphysiologisch hu-CLDN1 als Tumorsuppressorprotein betrachtet werden.},
  subject      = {Proteine},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Huber2003,
  author    = {Huber, Saskia},
  title     = {Charakterisierung von SAP47 in Drosophila melanogaster und der dazugeh{\"o}rigen Proteinfamilie},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-7777},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2003},
  abstract  = {In der Arbeit wird ein synapsenassoziiertes Protein, das SAP47 und seine zugeh{\"o}rige Proteinfamilie charakterisiert.},
  subject      = {Taufliege},
  language  = {de}
}