@phdthesis{Futh2015,
  author    = {Futh, Susanne},
  title     = {Entwicklung einer Methode mittels Gaschromatographie und gekoppeltem Triple-Quadrupol-Massenspektrometer zur Quantifizierung von Estrogen-Metaboliten in humanem Brustgewebe},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-118808},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2015},
  abstract  = {Im Rahmen der Arbeit wurde eine Methode f{\"u}r die Quantifizierung von freiem 17β-Estradiol, Estron sowie der hydroxylierten und methylierten Metabolite im Brustgewebe entwickelt. Aufgrund der geringen Probengehalte erforderte dies eine gezielte Isolierung der Analyte aus der Probenmatrix sowie eine effektive Aufreinigung und Aufkonzentrierung, so dass eine Extraktion mit anschließender Festphasenextraktion durchgef{\"u}hrt wurde. Zudem wurde eine empfindliche Mess-Methode etabliert, welche auf Grundlage einer multi-reaction-monitoring-Methode, mittels Gaschromatographie und gekoppelten Triple-Quadrupol-Massenspektrometer, entwickelt wurde. Die Anwendbarkeit der Aufarbeitungs- und Mess-Methode wurde {\"u}berpr{\"u}ft, indem diese auf 30 Realproben {\"u}bertragen wurde. Dabei sind die ermittelten Gehalte mit den publizierten Daten der Gewebekonzentrationen von 17β-Estradiol, Estron und deren Metaboliten verglichen und Korrelationen mit ausgew{\"a}hlten Brustkrebs-beg{\"u}nstigenden Risikofaktoren betrachtet worden. Um ein quantitatives Metabolitenprofil von 17β-Estradiol, Estron und deren Metaboliten im Gewebe zu erstellen, wurden mit Hilfe einer multi-reaction-monitoring-Methode f{\"u}r alle Metabolite ein spezifischer Quanti- und Qualifier-{\"U}bergang etabliert. Durch die Optimierung der Ionisierungs- und Kollisionsenergien sowie der Initial-, Transferline- und Ionenquell-Temperatur beziehungsweise der dwell-time wurden Methoden- und Ger{\"a}te-bedingte Empfindlichkeitsverluste so weit wie m{\"o}glich reduziert, so dass maximale Signalintensit{\"a}ten aller Quantifier-{\"U}berg{\"a}nge gew{\"a}hrleistet waren. Zur gezielten Isolation sowie Aufreinigung und Anreicherung der Analyten,... ...so dass trotz der geringen Anzahl analysierter Gewebe-spenden der Einfluss des Body-Mass-Index und die Einnahme oraler Kontrazeptiva auf die Gehalte von 17β-Estradiol in der pr{\"a}menopausalen Frau deutlich wurden. Die entwickelte Mess-Methode erm{\"o}glicht den routinem{\"a}ßigen Einsatz f{\"u}r die Quantifizierung von freiem 17β-Estradiol, Estron und deren Methyl-Catecholen in humanem Brustgewebe. Beim Vergleich der berechneten Nachweisgrenzen von Catechol-Estrogenen mit Literaturangaben wurde herausgestellt, dass empfindlichere fl{\"u}ssigchromatographische Methoden als Methode der Wahl bei deren Analytik heranzuziehen sind. Die {\"U}bertragung der in Standardl{\"o}sungen durchgef{\"u}hrten Versuche zur enzymatischen Hydrolyse von Glucuronid-und Sulfat-Konjugaten auf Gewebematrix stellt f{\"u}r weiterf{\"u}hrende Arbeiten den entscheidenden Ansatzpunkt dar, um ein quantitatives Metabolitenprofil von freiem und gebundenem 17β-Estradiol, Estron und den Metaboliten in Brustgewebe erstellen zu k{\"o}nnen.},
  subject      = {Estradiol},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Jung2002,
  author    = {Jung, Sven},
  title     = {Forensische DNA-Analytik},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-3031},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2002},
  abstract  = {Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene M{\"o}glichkeiten, die die mitochondriale DNA-Analytik f{\"u}r die Spurenkunde und die Populationsgenetik er{\"o}ffnet, ausgelotet. Polymorphismen der beiden nichtcodierenden hypervariablen Regionen HV1 und HV2 wurden durch Sequenzierung erschlossen und ergaben zusammen f{\"u}r eine deutsche Populationsstichprobe (Unterfranken, n = 180) einen Diskriminationsindex (DI) von 0,99. Der DI betrug bei alleiniger Betrachtung der HV1 f{\"u}r eine deutsche (n = 198), t{\"u}rkische (n = 37), {\"a}thiopische (n = 65) und chinesische (n = 60) Populationsstichprobe jeweils 0,97, 0,97, 0,96 und 0,98. L{\"o}sungen f{\"u}r spezifische Sequenzierungsprobleme der mitochondrialen DNA wurden gefunden, so dass ein reibungsloser Einsatz in der Laborroutine gew{\"a}hrleistet ist. Die Mutationsh{\"a}ufigkeit in der HV1 und HV2 wurde mit einem Wert von ca. einem Basenaustausch bei 50 Generationswechseln festgestellt. Die N{\"u}tzlichkeit der mitochondrialen DNA f{\"u}r rechtsmedizinische Belange hat sich bereits mehrfach best{\"a}tigt. Insbesondere bei der Untersuchung von Haarsch{\"a}ften und telogenen Haaren zeigte sich, dass mit Hilfe mitochondrialer DNA noch erfolgreiche Amplifikationen durchgef{\"u}hrt werden k{\"o}nnen, wenn die klassischen STR-Systeme bereits versagen. Die f{\"u}r spurenkundliche Analysen sinnvolle Sequenz-Analyse der HVs wurde f{\"u}r populationsgenetische Untersuchungen als ungeeignet erkannt. Untersuchungen auf Grund einer Einteilung in Haplogruppen erbrachten hingegen verwertbare Ergebnisse. Beim Vergleich der verschiedenen Populationen unter Zuhilfenahme weiterer, andernorts untersuchter Bev{\"o}lkerungsgruppen zeigte sich, dass es durchaus m{\"o}glich ist, an Hand der mitochondrialen DNA Populationen verschiedener Kontinente voneinander abzugrenzen. Innerhalb Europas (Kaukasier) ist eine derartige Abgrenzung hingegen nicht m{\"o}glich, geschweige denn, dass Wanderungsbewegungen o.{\"a}. nachweisbar w{\"a}ren. Dies gilt sowohl f{\"u}r Untersuchungen auf Grund der Sequenzen der hypervariablen Regionen, als auch basierend auf Untersuchungen der Haplogruppen. Andere variable Regionen der mitochondrialen DNA erwiesen sich als zu wenig aussagekr{\"a}ftig, als dass sie in der rechtsmedizinischen Praxis von besonderer Relevanz w{\"a}ren. Die Analyse des hochkonservierten Cytochrom b Genes kann dagegen als geeignetes Mittel zur Speziesidentifikation betrachtet werden. Unsicherheiten bei der RFLP-Darstellung machen jedoch unter Umst{\"a}nden eine Sequenzierung des Genes n{\"o}tig. Ein im ersten Intron des X-Y homologen Amelogenin-Gens liegendes, geschlechtspezifisch polymorphes STR-System wurde eingef{\"u}hrt, welches auch f{\"u}r die automatisierte Auftrennung im Sequenz-Analysator geeignet ist. Die vier autosomalen STR-Systeme D3S1358, D8S1179, D18S51 und D21S11 wurden f{\"u}r die forensische Praxis als Einzelsysteme etabliert. Zu diesen Systemen wurden jeweils unterfr{\"a}nkische Populationsstichproben typisiert, um f{\"u}r diese Region relevantes Datenmaterial zu erhalten. Zur Erweiterung der bereits vorhandenen Y-chromosomalen STR-Spektrums wurde das aussagekr{\"a}ftige Mikrosatellitensystem DYS385 eingef{\"u}hrt. Auch mit diesem System wurde eine unterfr{\"a}nkische Populationsstichprobe typisiert. Die Mutationsh{\"a}ufigkeit verschiedener STR-Systeme wurde untersucht und die gefundenen Ergebnisse lagen im Vergleich mit anderen Arbeiten im erwarteten Rahmen. F{\"u}r die DNA-Extraktion aus in Formalin fixiertem und in Paraffin eingebettetem Gewebe wurde eine geeignete Methode gefunden, auch aus Geweben, die sehr lange in Formalin fixiert wurden, noch typisierbare DNA zu extrahieren. Die untersuchten Extraktionsprotokolle f{\"u}r unbehandelte Gewebeproben zeigten untereinander keine gravierenden Unterschiede. Der begrenzende Faktor f{\"u}r eine erfolgreiche DNA-Extraktion ist hier vielmehr der Zersetzungsgrad des behandelten Gewebes und die damit einhergehende Degradation der DNA. Insofern ist es sinnvoll in F{\"a}llen, in denen unbehandeltes Gewebematerial l{\"a}ngere Zeit unwirtlichen Bedingungen ausgesetzt war, gleich auf eine DNA-Extraktionsmethode aus Knochenmaterial, wie die in dieser Arbeit beschriebene, zur{\"u}ckzugreifen.},
  subject      = {DNS},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Spielmann2018,
  author    = {Spielmann, Benjamin},
  title     = {Identifizierung von Einflussfaktoren auf DNA-Sch{\"a}den in weiblichem Brustgewebe},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-156159},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2018},
  abstract  = {Spontanmutationen spielen eine wichtige Rolle bei der Entstehung von Brustkrebs. Daher war das Ziel dieser Arbeit, Einflussfaktoren auf Mutationen in weiblichem Brustgewebe zu identifizieren. Daf{\"u}r wurden zun{\"a}chst von 50 gesunden Frauen, die sich aus kosmetischen Gr{\"u}nden einer Mammareduktion unterzogen hatten, Brustgewebsproben akquiriert. Ein Teil der Spenderinnen nahm im Vorfeld der Operation an einer Isoflavon-Intervention teil. Das Gewebe wurde optisch in Fett- und Dr{\"u}sengewebe separiert. Als potentielle Variablen, die die Mutationsfrequenz beeinflussen k{\"o}nnten, wurden am Lehrstuhl der lobule type, Estrogen- und Estrogenmetabolitspiegel und Tran-skriptspiegel von Genen, die f{\"u}r am Estrogen-Metabolismus beteiligte Enzyme, Transkriptonsfaktoren und Rezeptoren kodieren, im Gewebe der Probandinnen be-stimmt. Des Weiteren wurden am Lehrstuhl Oxycholesterolspiegel im Fettgewebe und am Max-Rubner-Institut in Karlsruhe Isoflavonspiegel im Dr{\"u}sengewebe der Probandinnen bestimmt. Zun{\"a}chst wurde der Umfang an genotoxischem Stress auf mitochondrialer Ebene ermittelt. Daf{\"u}r wurde der Random Mutation Capture Assay als genotypselektive Me-thode, die sensitiv genug zur Bestimmung der mitochondrialen Spontanmutations-frequenz ist, ausgew{\"a}hlt. Die erforderlichen Primer wurden f{\"u}r das Cytochrom-B-Gen designt. Nach Optimierung der Reaktion zur Kopienzahlbestimmung wurde ein linearer und varianzenhomogener Kalibrierbereich festgelegt. Die Standard-Wiederfindungsrate lag, je nach Bereich der Kalibrierung, bei 99 bis 102\% mit einer Schwankung von 2 bis 10\%. Bei Realproben lag das 10.-90. Perzentil der Stan-dardaddition-Wiederfindungsrate zwischen 62 und 117\%. Das 90. Perzentil der Standardabweichung der Wiederfindungsrate lag bei 33\% und das der Stan-dardabweichung der Kopienzahl der Proben bei 12\%. Um eine m{\"o}glichst hohe Sensitivit{\"a}t der Mutantenzahlbestimmungs-PCR zu erreichen, wurde die Reaktion ebenfalls optimiert. Bei Mutationsstandard-Wiederfindungsexperimenten wurden in 91 bis 95 Reaktionen im Mittel 11,0±1,7 PCR-Produkte detektiert, wobei kein statis-tisch signifikanter Unterschied zu den 13,6 erwarteten PCR-Produkten bestand. Die Spontanmutationsfrequenz in mitochondrialer DNA eines vor der DNA-Isolation aufgeteilten Brustdr{\"u}sengewebsaliqouts lag bei 1, 2 und 6*10-5 bp 1. Zwischen den Spontanmutationsfrequenzen im Fett- und im Dr{\"u}sengewebe bestand sowohl indi-viduell bei allen getesten Proben, als auch interindividuell, statistisch kein signifi-kanter Unterschied. Ebenso unterschieden sich die mittels Sanger-Sequenzierung der Amplifikationsprodukte der Mutantenzahlbestimmungs-PCR ermittelten Mutati-onsspektren im Fett- und Dr{\"u}sengewebe statistisch nicht signifikant. Da mehr Fett-gewebsproben als Dr{\"u}sengewebsproben zur Verf{\"u}gung standen, wurde die Spont-anmutationsfrequenz anschließend in allen geeigneten Fettgewebsproben be-stimmt. Aufgrund der großen Anzahl an potentiellen Einflussfaktoren auf die mitochondria-le Spontanmutationsfrequenz, wurden diese im Brustfettgewebe mittels multipler linearer Regressionsanalyse ermittelt. Die mitochondriale Spontanmutationsfre-quenz in humanem Brustfettgewebe wurde dabei signifikant positiv durch das Alter beeinflusst. Dies wurde in der Literatur bereits f{\"u}r humane Gehirne und Gehirne von Ratten beschrieben, jedoch nicht f{\"u}r Brustgewebe. Variablen, die in Zusam-menhang mit der mitochondrialen Proliferation stehen, beeinflussten die mito-chondriale Spontanmutationsfrequenz dagegen nicht. Zudem wurde die mito-chondriale Spontanmutationsfrequenz von Oxycholesterolspiegeln, als Marker f{\"u}r durch reaktive Sauerstoff-Spezies induziertem oxidativen Stress, und Transkript-spiegeln und Genotypen von Genen, die f{\"u}r Enzyme, die im Zusammenhang mit oxidativem Stress stehen, kodieren, beeinflusst. Ein Einfluss von oxidativem Stress auf die Spontanmutationsfrequenz in humanem Brustgewebe wurde in der Literatur noch nicht beschrieben. Im Gegensatz dazu beeinflussten Variablen, die mit der Bildung von reaktiven Estrogenchinonen in Verbindung stehen, die mitochondriale Spontanmutationsfrequenz nicht signifikant. Auch Rauchen beeinflusste die mito-chondriale Spontanmutationsfrequenz nicht. In der Literatur wurde beschrieben, dass sich auch das mitochondriale Mutationsspektrum in Lungen von Raucher- und Nichtraucherzwillingen nicht unterschied. Ebenso beeinflussten der Fettgehalt des Gewebes und der BMI, welche in Verbindung mit proinflammatorischen Media-tioren gebracht werden, die Spontanmutationsfrequenz nicht signifikant. Ber{\"u}ck-sichtigt werden muss allerdings, dass mit einem Variationskoeffizienten von 0,60 nur 60\% der Varianz der Spontanmutationsfrequenz erkl{\"a}rten werden konnte und somit weitere Einflussfaktoren eine Rolle spielen k{\"o}nnten. In Bezug auf nukle{\"a}re DNA erwies sich der Random Mutation Capture Assay in ei-ner vorangegangenen Arbeit als zu zeitaufwendig und unwirtschaftlich. Mutationen k{\"o}nnen aufgrund von DNA-Adduktbildung entstehen. Bei der Entstehung von reak-tiven Verbindungen, die in der weiblichen Brustdr{\"u}se in der Lage sind, DNA-Addukte zu bilden, wird derzeit von einer Rolle des Estrogenmetabolismus ausge-gangen. Am Lehrstuhl wurden bereits DNA-Adduktfl{\"u}sse in weiblichem Brustdr{\"u}-sengewebe mittels bioinformatischer constraint-based Netzwerkmodellierung er-rechnet. Da die f{\"u}r das Netzwerk-Modell als Surrogat f{\"u}r die Enzymaktivit{\"a}t verwen-deten Transkriptspiegel eine Vereinfachung der Enzymaktivit{\"a}t darstellen, wurden zun{\"a}chst Polymorphismen, die Einfluss auf die Bildung und Entgiftung reaktiver Estrogen-Metabolite nehmen k{\"o}nnen, identifiziert. Mittels allelischer Diskriminie-rung wurden f{\"u}r die Genotypisierung der Proben geeignete Positivkontrollen aus-gew{\"a}hlt und mittels Restriktionsfragmentl{\"a}ngen-Polymorphismus-PCR verifiziert. Die Allelfrequenzen der genotypisierten Brustgewebsproben lagen innerhalb des Hardy-Weinberg-Gleichgewichts und auch innerhalb bereits publizierter Frequen-zen gesunder deutscher bzw. hellh{\"a}utiger Frauen. Ebenso entsprach der Einfluss der Polymorphismen auf den jeweils assoziierten mRNA-Spiegel den Ergebnissen anderer Studien. F{\"u}r den Polymorphismus innerhalb des Gens der Hydroxysteroid-Dehydrogenase 17β2 waren bisher keine Ergebnisse publiziert. In Brustgewebe nahm dieser Polymorphismus keinen signifikanten Einfluss auf den assoziierten mRNA-Spiegel. Zur Identifizierung von Einflussfaktoren auf Estrogen-Gewebespiegel im Brustdr{\"u}-sen- und im Brustfettgewebe wurden am Lehrstuhl bereits multiple lineare Regres-sionsmodelle mit Estrogen-Gewebespiegeln und daraus errechneten Verh{\"a}ltnissen als abh{\"a}ngige Variablen gerechnet. Bei erneut gerechneten Modellen unter zus{\"a}tz-licher Ber{\"u}cksichtung von Polymorphismen, in Genen, die f{\"u}r am Estrogenmetabo-lismus beteiligte Enzyme kodieren, wurden bei vier von neun Modellen Genotypen in die Modelle selektiert. Anschließend wurde in Kooperation mit dem Lehrstuhl f{\"u}r Bioinformatik der Universit{\"a}t W{\"u}rzburg ein zus{\"a}tzliches Netzwerkmodell erstellt, das die Transkriptspiegel um die relative Aktivit{\"a}t des entsprechenden Genotyps korri-gierte. Die Validierungsergebnisse deuteten darauf hin, dass beide Addukt-Modelle (mit und ohne Polymorphismus-Ber{\"u}cksichtigung) {\"a}quivalent die reale Situation der jeweils evaluierten Estrogenmetabolitspiegel im Gewebe widerspiegelten. Daraufhin wurden mittels multipler linearer Regression Einflussfaktoren auf die mit und ohne Genotypen errechneten DNA-Adduktfl{\"u}sse ermittelt. Die Adduktfl{\"u}sse wurden dabei vom BMI signifikant positiv beeinflusst. In der Literatur wurde be-schrieben, dass {\"U}bergewicht, wahrscheinlich aufgrund erh{\"o}hter Plasma-Estrogenspiegel, mit dem Brustkrebsrisiko assoziiert ist. Dies k{\"o}nnte sich ebenso auf die DNA-Adduktbildung im Brustgewebe auswirken. Des Weiteren wurden die Adduktfl{\"u}sse, welche unter Ber{\"u}cksichtigung von polymorphismusabh{\"a}ngiger en-zymatischer Umsetzung errechnet worden waren, positiv von einer Isoflavon-Intervention und Isoflavon-Gewebespiegeln beeinflusst. Ein Einfluss von Isoflavo-nen auf estrogenassoziierte DNA-Adduktbildung wurde in der Literatur bisher noch nicht beschrieben. Des Weiteren beeinflusste lobule type 1 nach altersbedingter Regression im Vergleich zu lobule type 2/3 die DNA-Adduktfl{\"u}sse signifikant nega-tiv. Der postmenopausale Status beeinflusste im Vergleich zum pr{\"a}menopausalen Status nur die Estron-DNA-Adduktfl{\"u}sse ohne Ber{\"u}cksichtigung der polymorphis-musabh{\"a}ngigen enzymatischen Umsetzung signifikant negativ. Lobule type 1 nach altersbedingter Regression ist meist bei postmenopausalen Frauen vorzufinden. Daher sind lobule type 1 nach altersbedingter Regression und der postmenopausa-le Status zumindest ann{\"a}hernd vergleichbar. Das Ende der Estrogen-Produktion in den Ovarien in der Menopause verringert Estrogen-Plasmaspiegel, was sich ebenso auf das Brustgewebe auswirken und zu einer verringerten Estrogen-DNA-Adduktbildung im Brustgewebe f{\"u}hren k{\"o}nnte. Das Alter dagegen beeinflusste kei-ne der abh{\"a}ngigen Variablen signifikant. Obwohl bei Rauchern in vielen humanen Geweben bereits eine erh{\"o}hte Cytochrom P450-abh{\"a}ngige Monoxygenase 1A1- und 1B1-Expression nachgewiesen wurde, die potentiell zu mehr reaktiven Estro-genchinonen und damit auch DNA-Adduktbildung f{\"u}hren k{\"o}nnte, beeinflusste Rauchen bei keiner der Modellvarianten die jeweils abh{\"a}ngige Variable signifikant. Des Weiteren beeinflussten weder Ethinylestradiol, noch 17β-estradiol-freisetzende Medikamente bei einer der Modellvarianten die jeweils abh{\"a}ngige Variable signifi-kant. Die Ergebnisse der multiplen linearen Regressionsanalyse der beiden Adduktfluss-Varianten (mit und ohne Ber{\"u}cksichtigung von polymorphismusabh{\"a}ngiger en-zymatischer Umsetzung) waren nicht identisch, widersprachen sich allerdings auch nicht. Ber{\"u}cksichtigt werden muss dabei, dass die Modelle mit einem Variationsko-effizienten zwischen 0,09 und 0,33 nur 9-33\% der Varianz der jeweiligen abh{\"a}ngi-gen Variable erkl{\"a}rten und vermutlich weitere Parameter zur vollst{\"a}ndigen Erkl{\"a}-rung ben{\"o}tigt werden. Oxidativer Stress kann ebenfalls zu DNA-Addukten f{\"u}hren, wird allerdings nicht durch das verwendete metabolische Netzwerk abgebildet. Daher wurden mittels multipler linearer Regression Einflussfaktoren auf Brustgewebs-Transkriptspiegel von der NADPH-Chinon Oxidoreduktase 1, der γ-Glutamyl-Cystein Ligase und des Transkriptionsfaktors nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2, Transkripten, deren Expression bei oxidativem Stress induziert wird, ermittelt. Die jeweils signifikant mit den abh{\"a}ngigen Variablen assoziierten erkl{\"a}renden Variablen unterschieden sich dabei zum einen bezogen auf jeweils abh{\"a}ngigen Variable, zum anderen bezogen auf das Gewebe. Die Marker-Transkriptspiegel wurden vom BMI, Alkoholkonsum, Rauchen und vom menopausalen Status signifikant beeinflusst. F{\"u}r diese Variab-len wurde in der Literatur bereits ein Einfluss auf Marker f{\"u}r oxidativen Stress in humanem Blut oder Plasma und anderen Geweben, jedoch nicht in Brustgewebe beschrieben. Zellzyklus-Marker und Marker der Gewebedifferenzierung beeinfluss-ten die abh{\"a}ngigen Variablen ebenso signifikant. Des Weiteren beeinflussten Transkriptspiegel und Genotypen von Genen, die f{\"u}r Enzyme kodieren, die zur Ka-techolbildung und -entgiftung f{\"u}hren konnen, die abh{\"a}ngigen Variablen signifi-kant. Estrogenspiegel selbst beeinflussten dagegen keine der abh{\"a}ngigen Variab-len signifikant. Des Weiteren beeinflussten Oxycholesterolspiegel, als Marker f{\"u}r durch reaktive Sauerstoffspezies induzierten, oxidativen Stress, entgegen der Er-wartung keine der abh{\"a}ngigen Variablen signifikant. Obwohl in der Literatur bereits ein Einfluss des Alters auf Marker f{\"u}r oxidativen Stress im humanen Frontal-Cortex, Endothelzellen der Oberarmarterie und in der humanen Leber beschrieben wurde, beeinflusste es keinen der Transkriptspiegel im Brustgewebe signifikant. Zusammengefasst wurde zum ersten Mal die mitochondriale Spontanmutationsfre-quenz in gesundem humanem Brustgewebe bestimmt und in Kombination mit bio-informatischer Netzwerkmodellierung und multipler linearer Regressionsanalyse ein umfassendes Bild der verschiedenen Einflussfaktoren auf mitochondrialen und estrogeninduzierten genotoxischen Stress in der gesunden weiblichen Brust dar-gestellt.},
  subject      = {DNS-Sch{\"a}digung},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Polzin2001,
  author    = {Polzin, Silke},
  title     = {Lebensaltersch{\"a}tzung aus biologischem Material anhand der 4.977 bp-Deletion in menschlicher mitochondrialer DNA},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-2999},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2001},
  abstract  = {Neben der Frage nach dem Lebensalter als Kriterium zur Identifizierung unbekannter Leichen und menschlicher {\"U}berreste, wird der Bedarf einer Alterssch{\"a}tzung an lebenden Personen derzeit immer gr{\"o}ßer. Hinzu kommt die Hoffnung, aus Spuren R{\"u}ckschl{\"u}sse auf das Alter des Spurenlegers ziehen zu k{\"o}nnen. Ziel dieser Arbeit war es, aus verschiedenen biologischen Materialien das Alter anhand der 4.977 bp-Deletion in menschlicher mitochondrialer DNA absch{\"a}tzen zu k{\"o}nnen, wobei der Schwerpunkt auf Material von lebenden Personen lag. Hierzu wurde mit Hilfe geeigneter DNA-Extraktionsmethoden aus verschiedenen Gewebearten, ven{\"o}sem Vollblut, Mundschleimhautabstrichen und Haarwurzeln ausreichend DNA guter Qualit{\"a}t gewonnen. Die Schwierigkeit dieser Untersuchung lag in der Erm{\"o}glichung einer Quantifizierungsmethode zur Erfassung der 4.977 bp-Deletion. Dieses Problem wurde, nach der Wahl optimaler Primer und Amplifizierung spezifischer DNA-Fragmente, f{\"u}r die deletierte und die normale mtDNA unter optimierten PCR-Bedingungen im Multi-plex-Ansatz, mit Hilfe der Kapillarelektrophorese gel{\"o}st. Mit ihr konnte der Anteil der 4.977 bp-deletierten und der normalen mtDNA durch die computeranalysierten Peakfl{\"a}chen der beiden Fragmente bestimmt und miteinander in Verh{\"a}ltnis gesetzt werden. Dieses Verh{\"a}ltnis wurde durch den Quotienten IDel/INorm ausgedr{\"u}ckt. Die gewonnenen Ergebnisse wurden anschließend ausgedehnten statistischen Erhebungen unterzogen. Die 4.977 bp-Deletion zeigte in allen untersuchten Materialien eine eindeutige Altersabh{\"a}ngigkeit. Dies wurde an der Zunahme des Quotienten IDel/INorm mit steigendem Alter ersichtlich. F{\"u}r die verschiedenen Gewebearten war die Abh{\"a}ngigkeit dieser Deletion vom Alter bereits aus der Literatur bekannt. Im Blut wurde diese jedoch erstmalig gezeigt, ebenso wie in den Mundschleimhautabstrichen, die bisher noch nie f{\"u}r Untersuchungen der 4.977 bp-Deletion herangezogen wurden. In den Haarwurzeln konnte die Deletion nicht nachgewiesen werden. Auff{\"a}llig war hierbei, dass die Altersabh{\"a}ngigkeit von Material zu Material unterschiedlich ausgepr{\"a}gt war. Der gr{\"o}ßte Anteil deletierter mtDNA fand sich im Gehirngewebe, gefolgt von Skelettmuskulatur, Herz, Lunge, Milz, Niere Leber und Haut. F{\"u}r diese unterschiedliche Akkumulierung der 4.977 bp-Deletion finden sich zwei m{\"o}gliche Erkl{\"a}rungsans{\"a}tze, die Theorie einer unterschiedlichen Mitoserate und die einer unterschiedlichen Stoffwechselaktivit{\"a}t, die beide die gewonnene Rangfolge best{\"a}tigen. Des Weiteren wurde eine Abh{\"a}ngigkeit der 4.977 bp-Deletion von der in die PCR eingesetzten DNA-Menge festgestellt. Dieser Effekt muss im Zusammenhang mit der unterschiedlichen Amplifizierungseffizienz der beiden relevanten DNA-Fragmente gesehen werden, wodurch jedoch die Einschr{\"a}nkungen der angewandten unkontrollierten Multiplex-PCR mit anschließender semi-quantitativer Detektion der Amplifikations- produkte deutlich werden. Unter Ber{\"u}cksichtigung der Einschr{\"a}nkungen gelang anhand von Perzentilentabellen eine Alterssch{\"a}tzung mit der Angabe einer Altersspanne von ungef{\"a}hr 30 Jahren. Um eine genauere Alterssch{\"a}tzung zu erreichen, w{\"a}re eine Optimierung der Methode, z. B. durch Anwendung einer real-time quantitativen PCR, und eine Einbeziehung einer noch gr{\"o}ßeren Probenzahl n{\"o}tig.},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Huth2012,
  author    = {Huth, Antje [geb. Koppelkamm]},
  title     = {Studien zum mRNA profiling an humanem postmortalem Gewebe},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-74308},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2012},
  abstract  = {Die vorliegende Arbeit besch{\"a}ftigt sich mit der Frage, inwieweit quantitative Genexpressionsstudien an postmortalen humanen Proben mit erh{\"o}htem Postmortalintervall und somit m{\"o}glicherweise verminderter RNA-Integrit{\"a}t realisierbar sind und in Zukunft als zus{\"a}tzliches diagnostisches Werkzeug zur Determinierung der Todesursache im forensischen Kontext herangezogen werden k{\"o}nnen. Daf{\"u}r wurden in mehreren Teilstudien Faktoren untersucht, die die Verl{\"a}sslichkeit quantitativer Genexpressionsdaten beeinflussen k{\"o}nnen. Es konnte zun{\"a}chst f{\"u}r postmortales Skelettmuskelgewebe festgestellt werden, dass Verstorbene mit erh{\"o}htem BMI statistisch signifikant niedrigere RIN-Werte aufweisen als normalgewichtige Personen. Zudem wurde eine Korrelation zwischen dem Gewebetyp und der Integrit{\"a}t der daraus extrahierten RNA gefunden. Unter Anwendung der in dieser Arbeit gew{\"a}hlten Extraktionsmethode scheint postmortales Skelettmuskelgewebe f{\"u}r Genexpressionsstudien an Autopsiematerial besonders geeignet. Dagegen wurde im vorliegenden Probengut kein Zusammenhang zwischen verminderter RNA-Integrit{\"a}t und Parametern wie Geschlecht, PMI, Sterbealter, Dauer der Agonie und Todesursache gefunden. In einer weiteren Teilstudie wurde anhand von postmortalem Herzmuskel-, Skelettmuskel- und Gehirngewebe aus einer Auswahl von zehn funktionell verschiedenen endogenen Kontrollgenen HMBS, UBC, SDHA und TBP als die Gene mit der gr{\"o}ßten postmortalen Transkriptstabilit{\"a}t identifiztiert. Zudem konnte gezeigt werden, dass die Verwendung von vier stabilen endogenen Kontrollen am untersuchten Probenmaterial eine verl{\"a}ssliche Datennormalisierung erlaubt. Die validierten Kontrollgene k{\"o}nnen auch zuk{\"u}nftig f{\"u}r quantitative Genexpressionsstudien eingesetzt werden, solange die untersuchte Probenzusammensetzung der hier vorgestellten {\"a}hnelt. F{\"u}r die Todesursache sowie f{\"u}r den Body Mass Index des Probenspenders wurde in der vorliegenden Arbeit ein statistisch signifikanter Einfluss auf das Expressionslevel instabiler Gene festgestellt. Diese Parameter sind daher geeignet, die gefundenen Instabilit{\"a}ten m{\"o}glicher Kontrollgene zu erkl{\"a}ren. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit lassen des Weiteren darauf schließen, dass das Erstellen von Degradierungslinien aus kommerziell erh{\"a}ltlicher RNA f{\"u}r jedes verwendete qPCR-Assay ein wichtiges Instrument der Qualit{\"a}tspr{\"u}fung ist. Mit der Degradierungslinie kann die Detektionsgrenze des verwendeten qPCR-Assays validiert werden kann. Nur so ist die Festlegung des Bereichs m{\"o}glich, in dem ein ver{\"a}ndertes Expressionslevel tats{\"a}chlich mit dem Einfluss eines spezifischen Parameters in Verbindung gebracht werden kann und klar von einer nur scheinbaren Genexpressions{\"a}nderung unterscheidbar ist, die durch eine Degradierung der Probe vorget{\"a}uscht wird. Zudem scheint es praktikabel, in zuk{\"u}nftigen Studien nur Proben mit {\"a}hnlichen Integrit{\"a}ten miteinander zu vergleichen. Pathologische Prozesse im menschlichen K{\"o}rper, auch solche, die die Funktion von Organen sowie die Morphologie betreffen, sind hoch komplex und k{\"o}nnen interindividuell variieren, weshalb die Genexpression im forensischen Kontext erg{\"a}nzende Hinweise auf die Diagnose liefern k{\"o}nnte. Als erstes anwendungsbezogenes Beispiel wurde in der vorliegenden Arbeit der Einfluss von Hypoxie auf das Transkriptlevel von HIF-1α, VEGF und SLC2A1 untersucht. Bei Normalisierung der Daten gegen vier stabile Kontrollgene ergaben sich anhand der untersuchten Gewebeproben Hinweise auf eine todesursachenbezogene Hochregulierung der drei Zielgene. Die Studie unterstrich die besondere Bedeutung der gew{\"a}hlten Normalisierungsstrategie. Wurden die Daten nur gegen GAPDH als einzelnes, nicht validiertes Kontrollgen normalisiert, deuteten die Ergebnisse eine {\"u}berraschende Herunterregulierung der Zielgene an. Als m{\"o}gliche Ursache f{\"u}r diese scheinbare Diskrepanz kommt die im weiteren Verlauf dieser Studie nachgewiesene Instabilit{\"a}t infolge einer Co-Regulation von GAPDH unter hypoxischen Bedingungen in Betracht. Mit dem Fernziel postmortale Genexpressionsstudien als zus{\"a}tzliches Instrument in der forensischen Todesursachenbestimmung einzusetzen, schafft die vorliegende Arbeit durch die Einf{\"u}hrung von validierten Kontrollgenen sowie durch die Analyse weiterer Einfluss nehmender Faktoren eine Basis f{\"u}r die verl{\"a}ssliche Durchf{\"u}hrung k{\"u}nftiger Genexpressionsstudien an humanem Autopsiegewebe.},
  subject      = {Genexpression},
  language  = {de}
}