@phdthesis{Grimm2000,
  author    = {Grimm, Dorothee},
  title     = {Entwicklung von neuen Nachweismethoden f{\"u}r Legionellen und Am{\"o}ben und ihre Anwendung in {\"o}kologischen Studien},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-1351},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2000},
  abstract  = {Legionella pneumophila wurde 1976 als Erreger der Legionellose, einer schweren Form von Lungenentz{\"u}ndung, identifiziert. Die inzwischen 42 Arten umfassende Gattung ist weltweit in aquatischen Biotopen verbreitet. Die Bakterien leben vergesellschaftet mit anderen Mikroorganismen in Biofilmen oder intrazellul{\"a}r in Protozoen. Sie haben ein duales Wirtssystem, das heißt, sie sind in der Lage, sich sowohl in Einzellern als auch in humanen Phagozyten zu vermehren. F{\"u}r die Erweiterung ihrer Habitate spielen verschiedene Umweltfaktoren eine Rolle. Eine exakte und schnelle Detektion und Identifikation der humanpathogenen Keime ist sowohl f{\"u}r die Lokalisierung der Infektionsquelle als auch f{\"u}r eine rechtzeitige Therapie der Patienten von großer Bedeutung. Die Technik der fluoreszierenden in situ Hybridisierung (FISH) basiert auf der Bindung einer spezifischen, mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten Oligonukleotidsonde an eine komplement{\"a}re Zielsequenz der ribosomalen RNA. In der vorliegenden Arbeit wurde f{\"u}r die in situ Hybridisierung eine neue 16S rRNA-gerichtete Sonde LEGPNE1 entwickelt, die spezifisch ist f{\"u}r L. pneumophila. In Versuchsreihen mit verschiedenen Bakterienkulturen wurden die Spezifit{\"a}t und Sensitivit{\"a}t der Gensonde ermittelt. LEGPNE1 erwies sich als artspezifisch und erkannte alle getesteten L. pneumophila-St{\"a}mme, ungeachtet ihrer Serogruppe. Nicht-pneumophila-Referenzst{\"a}mme hybridisierten nicht mit der Sonde, ein einziger Basenaus-tausch in der Sequenz war f{\"u}r diese Unterscheidung ausreichend. Die Anwendung der Sonde wurde auch in Am{\"o}ben-Infektionsassays und Umweltproben erfolgreich durchgef{\"u}hrt. Unterschiedliche, intrazellul{\"a}r vorliegende Bakterien wurden von der Sonde spezifisch erkannt. Eine in situ Dokumentation der Infektions- und Vermehrungsrate war damit m{\"o}glich. Durch die meist fakultativ intrazellul{\"a}re Lebensweise der Legionellen ist es wichtig, auch die Wirtszellen der Keime qualitativ zu detektieren und zu identifizieren. Die Entwicklung neuer Gensonden wurde daher auf die beiden bekannten Wirtsam{\"o}ben Hartmannella und Naegleria ausgedehnt. Basierend auf Sequenzvergleichen wurden die gattungsspezifischen 18S rRNA-gerichteten Sonden HART498 und NAEG1088 konstruiert und in Versuchsreihen mit Referenzst{\"a}mmen bei steigender Stringenz etabliert. Mit ihrer Hilfe konnten die Ergebnisse der zeit- und arbeitsaufwendigen Determination unbekannter Am{\"o}ben anhand morphologischer Merkmale best{\"a}tigt werden. In situ Hybridisierungen mit einer Kombination von 16S und 18S rRNA-gerichteten Sonden wurden in Am{\"o}ben-Infektionsassays mit Hartmannella vermiformis und L. pneumophila erfolgreich durchgef{\"u}hrt. Eine Interferenz der Sonden fand nicht statt. Die in situ Untersuchung der Struktur und Funktion komplexer mikrobieller Lebensgemeinschaften erfordert eine kultivierungsunabh{\"a}ngige und hochaufl{\"o}sende Methode, wie sie die fluoreszierende in situ Hybridisierung darstellt. Mit dem Ziel, m{\"o}gliche Pr{\"a}ferenzen der Legionellen f{\"u}r bestimmte Parameter, wie pH, Temperatur, elektrische Leitf{\"a}higkeit, Str{\"o}mungsverh{\"a}ltnisse, zu erkennen und zu definieren, wurden mit Hilfe der neu entwickelten 16S rRNA-gerichteten Sonde 21 verschiedene Kaltwasserhabitate auf die Verbreitung von Legionella untersucht. Die Bakterien zeigten jedoch ein breites Toleranzspektrum gegen{\"u}ber den gemessenen Parametern. Sie waren in nahezu allen beprobten Gew{\"a}ssern zu finden und ließen sich unabh{\"a}ngig von der Jahreszeit nachweisen. Die neue Sonde LEGPNE1 zeigte sich in in situ Hybridisierungen der Umweltproben als hochspezifisch. Mit ihr konnten auch nicht kultivierbare Legionellen detektiert werden. In drei Legionella-positiven Gew{\"a}ssern wurde außerdem das Vorkommen von Am{\"o}ben untersucht. Es konnten insgesamt acht Am{\"o}bengattungen isoliert, kultiviert und bestimmt werden. Dominierend waren St{\"a}mme des nicht humanpathogenen Naegleria gruberi-Komplexes, Echinamoeba spp. und Echinamoeba-like Am{\"o}ben. In einzelnen Proben wurden Acanthamoeba spp. Gruppe II, Hartmannella spp., Platyamoeba placida, Saccamoeba spp., Thecamoeba quadrilineata und Vexillifera spp. gefunden. Durch in situ Hybridisierung mit den neuen 18S rRNA-gerichteten Sonden HART498 und NAEG1088 konnten die Ergebnisse der morphologischen Bestimmung der Am{\"o}ben best{\"a}tigt werden. Auch die Am{\"o}ben zeigten keine Pr{\"a}ferenzen bez{\"u}glich der in den Standorten gemessenen Wasserparameter. Die in situ Hybridisierung mit rRNA-gerichteten Gensonden erlaubt eine Analyse der Struktur und Dynamik von Bioz{\"o}nosen, erm{\"o}glicht aber keine Aussage {\"u}ber die speziellen Aktivit{\"a}ten der nachgewiesenen Bakterien. Eine L{\"o}sung hierf{\"u}r k{\"o}nnte der spezifische in situ Nachweis von mRNA-Molek{\"u}len darstellen. Ein Problem hierbei stellt ihre, im Vergleich zu anderen Molek{\"u}len wie rRNA, sehr kurze Halbwertszeit und das Vorhandensein von nur wenigen Kopien pro Zelle dar. Daher ist im Anschluss an die in situ Hybridisierung in den meisten F{\"a}llen eine Signalamplifikation n{\"o}tig, um ein detektierbares Signal zu erhalten. In dieser Arbeit sollte die f{\"u}r das iap-Gen in Listeria monocytogenes entwickelte Methode zum Nachweis der mip-mRNA in L. pneumophila etabliert werden. Erste Anwendungen in Dot blot- und in situ Hybridisierungen mit mehrfach DIG-markierten Polyribonukleotidsonden bzw. mit simultan eingesetzten, einfach DIG-markierten Oligonukleotiden zeigten noch nicht die gew{\"u}nschte Spezifit{\"a}t. Diese Ergebnisse stellen jedoch eine wichtige Grundlage f{\"u}r zuk{\"u}nftige Experimente dar.},
  subject      = {Legionella pneumophila},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Goehtz2006,
  author    = {Goehtz, Florian},
  title     = {DNA-analytische Identifizierung unter Verwendung von frischem und gelagertem Skelettmaterial},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-18205},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2006},
  abstract  = {Der DNA-analytischen Untersuchung von frischem und gelagertem Skelettmaterial kommt bei der Identifikation unbekannter Toter zunehmende Bedeutung zu, insbesondere in F{\"a}llen, in denen nur Skelett{\"u}berreste einer DNA-Analyse zur Verf{\"u}gung stehen. Zur Aufkl{\"a}rung der praktischen Durchf{\"u}hrbarkeit von Knochen-DNA-Typisierungen im rechtmedizinischen Laboralltag wurden 21 Knochenproben unterschiedlicher Liegezeit analysiert. 14 Knochenproben stammten aus Sektionsgut (Liegezeit von einer Stunde bis 41 Wochen), 7 Proben aus Skelett- bzw. Knochenfunden (gesch{\"a}tzte Liegezeit zwischen 10 und {\"u}ber 200 Jahren). Die DNA-Extraktion wurde mittels reversibler DNA-Bindung an einer Silica-Membran durchgef{\"u}hrt. Die Typisierung erfolgte im Rahmen eines Multiplex-PCR-Ansatzes unter Amplifizierung von neun STR-Loci und dem Amelogenin-Locus. Zus{\"a}tzlich wurden drei besonders kurze, sog. vs-STRs bestimmt und exemplarisch f{\"u}r zwei Proben Bereiche des mt-Genoms sequenziert. Bei der Multiplex-Analyse ließ sich f{\"u}r 13 der 14 aus Sektionsgut gewonnenen Proben (93 \%) ein komplettes, reproduzierbares Allelprofil gewinnen, an einer der Proben konnte nur eine molekulare Geschlechtszuordnung durchgef{\"u}hrt werden. Ebenso konnten alle drei vs-STR-Loci f{\"u}r 13 der 14 Proben reproduzierbar bestimmt werden; eine Probe war in einem der drei vs-STR-Loci typisierbar. Die sieben Proben aus Skelett- bzw. Knochenfunden waren bei der Multiplex-Analyse nicht reproduzierbar typisierbar, die Bestimmung der vs-STR-Loci f{\"u}hrte im Fall der {\"a}ltesten Probe zur Typisierung eines der drei Loci (TPOXvs). Bei zwei Proben, welche im Rahmen der nukle{\"a}ren DNA-Analyse kein reproduzierbares Ergebnis gebracht hatten, erfolgte die mt-DNA-Sequenzierung eines jeweils 234, bzw. 194 Nukleotide langen Segmentes der HV1-Region des mitochondrialen Genoms. Umwelteinfl{\"u}sse und Lagerungsbedingungen haben mehr Einfluss auf den Erhaltungszustand der DNA in Knochenmaterial, als der Faktor Zeit. Die Analyse und Typisierung von Knochen-DNA hat sich als wichtiges Verfahren zur Identifizierung im rechtsmedizinischen Alltag etabliert, die unver{\"a}ndert unbefriedigenden Typisierungsergebnisse bei der Analyse {\"a}lteren Knochenmaterials unterstreichen jedoch die Notwendigkeit der Weiterentwicklung zuverl{\"a}ssiger und effektiver Extraktions- und Aufreinigungsverfahren.},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Bergelt2007,
  author    = {Bergelt, Steffen},
  title     = {Morphologische und DNA-analytische Untersuchungen am Spurenmaterial Haar},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-23155},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2007},
  abstract  = {In der vorliegenden Arbeit wurde der Versuch unternommen, eine Korrelation zwischen der Morphologie des Spurenmaterials Haar und der molekularbiologischen Untersuchung herzustellen. In der Rechtsmedizin waren Haare lange Zeit wegen der technisch schwierigen und zeitintensiven Untersuchungsmethoden eher von untergeordneter Bedeutung. Erst in den letzten Jahren wurden ausreichende wissenschaftliche Grundlagen geschaffen, um im Rahmen der forensischen Spurenkunde spezielle Fragestellungen anhand von molekularbiologischen Haaranalyseergebnissen mit gr{\"o}ßter Sicherheit zu beantworten. Humane Kopfhaut wurde aus der occipitalen Region entnommen. Nach ausgew{\"a}hlten Fixationen wurden die Gewebeschnitte mit der H{\"a}matoxylin-Eosin- sowie der Methylgr{\"u}n-Pyronin-F{\"a}rbung behandelt. Morphologische Hinweise auf die Existenz von Cytoplasmastrukturen, die mit Nukleins{\"a}uren assoziiert sein k{\"o}nnten, fanden sich nach abgeschlossener Keratinisierung ausschließlich im Bereich der Kutikula. Im Bereich des Markstranges oder anderen Abschnitten des Haares konnten nach den abgeschlossenen Keratinisierungsprozessen keine Strukturen gefunden werden, die auf das Vorhandensein von Nukleins{\"a}uren schließen lassen. Des Weiteren wurden mit geeigneten Verfahren die Extraktion von DNA aus telogenen Haarwurzeln und Haarsch{\"a}ften durchgef{\"u}hrt. Mit der Chelex-100-Extraktionsmethode und der Kombination der anschließenden Reinigung der Extrakte mit Diatomeenerde, war der DNA-Nachweis in mehr als die H{\"a}lfte der untersuchten Haarwurzeln m{\"o}glich. Die Phenol-Chloroform-Extraktionsmethode erlaubte einen erfolgreichen DNA-Nachweis in durchschnittlich 14,3 \% der F{\"a}lle. Zur Typisierung der genomen DNA wurde die Polymerasen-Ketten-Reaktion (PCR) angewandt. Untersucht wurde dabei zwei in der forensischen Praxis g{\"a}ngige STR-Systeme, zum einen das auf Chromosom 5 lokalisierte System HumACTBP2 (SE33) zum anderen das auf Chromosom 12 gelegene System HumVWA. Zus{\"a}tzlich wurde das Geschlechtsbestimmungssystem HumAMEL X/Y in die Untersuchung mit einbezogen. Die Ergebnisse lassen zuk{\"u}nftig auf ein gezieltes Vorgehen und die Anwendung spezieller Methoden f{\"u}r die Individualtypisierung am Spurenmaterial Haar hoffen. Da Keratinisierungsprozesse im wachsendem Haar wohl eine Schl{\"u}sselrolle {\"u}ber das Schicksal der Zellkerne und der darin enthaltenen Degenerationsgrad der DNA spielen, sollten sich zuk{\"u}nftige Untersuchungen in der Rechtsmedizin verst{\"a}rkt dieser Thematik widmen.},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Gebhard2009,
  author    = {Gebhard, Sebastian},
  title     = {DNA-analytische Untersuchungen an frischen und gelagerten Z{\"a}hnen},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-46462},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2009},
  abstract  = {In dieser Arbeit wurde {\"u}berpr{\"u}ft, inwieweit sich verschiedene Lagerungsbedingungen von Z{\"a}hnen auf die Verwertbarkeit von DNA im Zahninneren zur Gewinnung eines genetischen Fingerabdrucks auswirken. Die Untersuchungen an frisch extrahierten Z{\"a}hnen ließen erkennen, dass die in dieser Arbeit verwendeten Methoden und DNA-Kits f{\"u}r die weitere Analyse der den unterschiedlichen Bedingungen ausgesetzten Z{\"a}hne geeignet sind. Asensible Z{\"a}hne weisen bereits bei der Zahnextraktion Zeichen von Degradation auf. Dagegen ist der kari{\"o}se Zerst{\"o}rungsgrad an sich noch kein Ausschlusskriterium. Bei wurzelkanalbehandelten Z{\"a}hnen konnten nur Systeme mit sehr kurzen Amplifikationsprodukten typisiert werden. Sie waren f{\"u}r eine genetische Identifizierung kaum geeignet. Bei der Analyse im Erdreich vergrabener Z{\"a}hne nahm die Anzahl der typisierbaren Systeme nach einem Vierteljahr Liegezeit kontinuierlich ab, bis schließlich nach einem Jahr nur noch vereinzelt kleine Systeme detektiert werden konnten. Ein anderes Bild zeigte sich bei den in Wasser gelagerten Z{\"a}hnen. Bis zu einem halben Jahr nach Versuchsbeginn konnte eine Typisierung aller Systeme durchgef{\"u}hrt werden. Erst nach einem Jahr war die Degradation so weit vorangeschritten, dass große Systeme keine Typisierung mehr erlaubten. Bei Z{\"a}hnen, die der Sonnenstrahlung einen Monat ausgesetzt waren, war es dagegen problemlos m{\"o}glich, einen vollst{\"a}ndigen genetischen Fingerabdruck zu erfassen. Nach drei Monaten konnten allerdings nur noch vereinzelt sehr kleine Systeme gewonnen werden. Nach einem halben Jahr ergab lediglich der TPOX-vs eine erfolgreiche Typisierung. UV-Strahlung kann Zahnschmelz und -dentin durchdringen und DNA in recht kurzer Zeit degradieren. Die Z{\"a}hne aus dem Sektionsgut des Instituts f{\"u}r Rechtsmedizin W{\"u}rzburg lieferten unterschiedliche Ergebnisse, sodass hierzu keine generelle Aussage gemacht werden kann. Bei der Behandlung der Z{\"a}hne mit Hitze von 200 °C konnte die DNA nur begrenzte Zeit vor Degradation gesch{\"u}tzt werden. Bereits nach einer halben Stunde waren große Teile der Multiplex-Kits nicht mehr f{\"u}r eine Typisierung verwertbar. Das STR-System SE33 konnte allerdings noch ermittelt werden. Die Entnahmen zu sp{\"a}teren Zeitpunkten (60 min, 90 min und 120 min) lieferten fast nur noch einzelne STRSysteme. Eine knapp 30-j{\"a}hrige trockene Lagerung von Z{\"a}hnen in einem Schrank mit Schutz vor Sonneneinstrahlung schadete der DNA-Analysierbarkeit kaum. Ein vollst{\"a}ndiger Ausfall aller Systeme musste bei den Zahnproben von der Ausgrabung in Katzwang verzeichnet werden. Die Z{\"a}hne dieser 380 bis 550 Jahre alten Sch{\"a}del lieferten kein auswertbares DNA-Material mehr. Ebenso konnte mit diesen Untersuchungsmethoden aus den 2300 bis 2800 Jahre alten Z{\"a}hnen aus der Dietersbergh{\"o}hle kein analysierbares DNA-Material gewonnen werden. Es zeigte sich, dass Lagerbedingungen einen entscheidenden Einfluss auf die DNA-Qualit{\"a}t aus{\"u}ben. Als DNA-sch{\"a}digende Einfl{\"u}sse k{\"o}nnen neben Mikroorganismen und Feuchtigkeit insbesondere UV-Strahlung und Hitze gelten. Der Faktor Zeit spielt bei g{\"u}nstigen Lagerbedingungen eine untergeordnete Rolle.},
  subject      = {DNA-typing},
  language  = {de}
}