@phdthesis{Lu2024,
  author    = {Lu, Jinping},
  title     = {The vacuolar TPC1 channel and its luminal calcium sensing site in the luminal pore entrance},
  doi       = {10.25972/OPUS-25135},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-251353},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2024},
  abstract  = {The slowly activating vacuolar SV/TPC1 channel is ubiquitously expressed in plants and provides a large cation conductance in the vacuolar membrane. Thereby, monovalent (K+, Na+) and in principle also divalent cations, such as Ca2+, can pass through the channel. The SV/TPC1 channel is activated upon membrane depolarization and cytosolic Ca2+ but inhibited by luminal calcium. With respect to the latter, two luminal Ca2+ binding sites (site 1 Asp240/Asp454/Glu528, site 2 Glu239/Asp240/Glu457) were identified to coordinate luminal Ca2+. In this work, the characteristics of the SV/TPC1 channels in terms of regulation and function were further elucidated, focusing on the TPC1s of Arabidopsis thaliana and Vicia faba. For electrophysiological analysis of the role of distinct pore residues for channel gating and luminal Ca2+ sensing, TPC1 channel variants were generated by site-directed mutagenesis and transiently expressed as eGFP/eYFP-fusion constructs in Arabidopsis thaliana mesophyll protoplasts of the TPC1 loss-of-function mutant attpc1-2. 1. As visualized by confocal fluorescence laser-scanning microscopy, all AtTPC1 (WT, E605A/Q, D606N, D607N, E605A/D606N, E605Q/D606N/D607N, E457N/E605A/D606N) and VfTPC1 channel variants (WT, N458E/A607E/ N608D) were correctly targeted to the vacuole membrane. 2. Patch-clamp studies revealed that removal of one of the negative charges at position Glu605 or Asp606 was already sufficient to promote voltage-dependent channel activation with higher voltage sensitivity. The combined neutralization of these residues (E605A/D606N), however, was required to additionally reduce the luminal Ca2+ sensitivity of the AtTPC1 channel, leading to hyperactive AtTPC1 channels. Thus, the residues Glu605/Asp606 are functionally coupled with the voltage sensor of AtTPC1 channel, thereby modulating channel gating, and form a novel luminal Ca2+ sensing site 3 in AtTPC1 at the luminal entrance of the ion transport pathway. 3. Interestingly, this novel luminal Ca2+ sensing site 3 (Glu605/Asp606) and Glu457 from the luminal Ca2+ sensing site 2 of the luminal Ca2+-sensitive AtTPC1 channel were neutralized by either asparagine or alanine in the TPC1 channel from Vicia faba and many other Fabaceae. Moreover, the VfTPC1 was validated to be a hyperactive TPC1 channel with higher tolerance to luminal Ca2+ loads which was in contrast to the AtTPC1 channel features. As a result, VfTPC1 but not AtTPC1 conferred the hyperexcitability of vacuoles. When AtTPC1 was mutated for the three VfTPC1-homologous polymorphic site residues, the AtTPC1 triple mutant (E457N/E605A/D606N) gained VfTPC1-like characteristics. However, when VfTPC1 was mutated for the three AtTPC1-homologous polymorphic site residues, the VfTPC1 triple mutant (N458E/A607E/N608D) still sustained VfTPC1-WT-like features. These findings indicate that the hyperactivity of VfTPC1 is achieved in part by the loss of negatively charged amino acids at positions that - as part of the luminal Ca2+ sensing sites 2 and 3 - are homologous to AtTPC1-Glu457/Glu605/Asp606 and are likely stabilized by other unknown residues or domains. 4.The luminal polymorphic pore residues (Glu605/Asp606 in AtTPC1) apparently do not contribute to the unitary conductance of TPC1. Under symmetrical K+ conditions, a single channel conductance of about 80 pS was determined for AtTPC1 wild type and the AtTPC1 double mutant E605A/D606A. This is in line with the three-fold higher unitary conductance of VfTPC1 (232 pS), which harbors neutral luminal pore residues at the homologous sites to AtTPC1. In conclusion, by studying TPC1 channel from Arabidopsis thaliana and Vicia faba, the present thesis provides evidence that the natural TPC1 channel variants exhibit differences in voltage gating, luminal Ca2+ sensitivity and luminal Ca2+ binding sites.},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Isasa2024,
  author    = {Isasa, Emilie},
  title     = {Relationship between wood properties, drought-induced embolism and environmental preferences across temperate diffuse-porous broadleaved trees},
  doi       = {10.25972/OPUS-30356},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-303562},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2024},
  abstract  = {In the scope of climate warming and the increase in frequency and intensity of severe heat waves in Central Europe, identification of temperate tree species that are suited to cope with these environmental changes is gaining increasing importance. A number of tree physiological characteristics are associated with drought-stress resistance and survival following severe heat, but recent studies have shown the importance of plant hydraulic and anatomical traits for predicting drought-induced tree mortality, such as vessel diameter, and their potential to predict species distribution in a changing climate. A compilation of large global datasets is required to determine traits related to drought-induced embolism and test whether embolism resistance can be determined solely by anatomical traits. However, most measurements of plant hydraulic traits are labour-intense and prone to measurement artefacts. A fast, accurate and widely applicable technique is necessary for estimating xylem embolism resistance (e.g., water potential at 50\% loss of conductivity, P50), in order to improve forecasts of future forest changes. These traits and their combination must have evolved following the selective pressure of the environmental conditions in which each species occurs. Describing these environmental-trait relationships can be useful to assess potential responses to environmental change and mitigation strategies for tree species, as future warmer temperatures may be compounded by drier conditions.},
  subject      = {Pflanzen{\"o}kologie},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Kopic2024,
  author    = {Kopic, Eva},
  title     = {On the physiological role of post-translational regulation of the \(Arabidopsis\) guard cell outward rectifying potassium channel GORK},
  doi       = {10.25972/OPUS-34880},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-348806},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2024},
  abstract  = {Das streng regulierte Gleichgewicht zwischen CO2-Aufnahme und Transpiration ist f{\"u}r Pflanzen essentiell und h{\"a}ngt von kontrollierten Turgor{\"a}nderungen ab, die durch die Aktivit{\"a}t verschiedener Anionen- und Kationenkan{\"a}le verursacht werden. Diese Kan{\"a}le sind Teil von Signalkaskaden, die z. B. durch Phytohormone wie ABA (Abscisins{\"a}ure) und JA (Jasmonat) ausgel{\"o}st werden, die beide bei Trockenstress in den Schließzellen wirken. Dar{\"u}ber hinaus ist bekannt, dass JA an der Reaktion der Pflanze auf Pathogenbefall oder Verwundung beteiligt ist. GORK (guard cell outward rectifying K+ channel) ist der einzige bekannte, ausw{\"a}rts gleichrichtende K+-Kanal in Schließzellen und somit f{\"u}r den K+-Efflux beim Schließen der Stomata verantwortlich. Im Rahmen dieser Arbeit konnte nachgewiesen werden, dass GORK ein wesentlicher Bestandteil des JA-induzierten Stomatschlusses ist. Dies gilt f{\"u}r beide Ausl{\"o}ser, sowohl die Blattverwundung als auch die direkte Anwendung von JA. Patch-Clamp-Experimente an Protoplasten von Schließzellen untermauerten dieses Ergebnis, indem sie GORK-K+-Ausw{\"a}rtsstr{\"o}me als direktes Ziel von JA-Signalen entlarvten. Da bekannt ist, dass zytosolische Ca2+-Signale sowohl bei ABA- als auch bei JA-Signalen eine Rolle spielen, wurde die Interaktion von GORK mit Ca2+-abh{\"a}ngigen Kinasen untersucht. Eine antagonistische Regulation von GORK durch CIPK5-CBL1/9-Komplexe und ABI2 konnte durch DEVC (double electrode voltage clamp) sowie Protein-Protein-Interaktions-Experimente identifiziert und durch in-vitro Kinase-Assays untermauert werden. Patch-Clamp-Aufzeichnungen an Protoplasten von Schließzellen der cipk5-2 Funktions-Verlust-Mutante zeigten die Bedeutung von CIPK5 f{\"u}r den JA-induzierten Stomaschluss via Aktivierung von GORK. Die Interaktion verschiedener CDPKs (Ca2+-abh{\"a}ngige Proteinkinasen) mit GORK wurde ebenfalls untersucht. Neben der Ca2+-Signal{\"u}bertragung ist auch die Produktion von ROS (reaktive Sauerstoffspezies) f{\"u}r die ABA- und MeJA-Signal{\"u}bertragung von Bedeutung. In DEVC-Experimenten konnte ein reversibler Effekt von ROS auf die GORK-Kanalaktivit{\"a}t nachgewiesen werden, was ein Teil der Erkl{\"a}rung f{\"u}r diese ROS-Effekte bei ABA- und MeJA-Signalen sein k{\"o}nnte.},
  subject      = {Spalt{\"o}ffnung},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Hettwer2024,
  author    = {Hettwer, Anette},
  title     = {Entwicklung und Charakterisierung einer l{\"o}slichen und funktionalen BMP-2-Variante},
  doi       = {10.25972/OPUS-32680},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-326800},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2024},
  abstract  = {Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) sind potente Differenzierungs- und Wachstumsfaktoren, die strukturell der Transforming Growth Factor-β (TGF-β) - Superfamilie zugeordnet werden. Sie spielen eine Schl{\"u}sselrolle in einer Vielzahl an zellul{\"a}ren Prozessen ab den fr{\"u}hen Stadien der Embryogenese. Dadurch sind BMPs nicht nur f{\"u}r die korrekte Festlegung der embryonalen K{\"o}rperachse verantwortlich, sondern regulieren als multifunktionale Mediatoren neben der Morphogenese auch Proliferation, Differenzierung und Apoptose unterschiedlicher Zelltypen. Bone Morphogenetic Proteins sind somit f{\"u}r die Aufrechthaltung der Hom{\"o}ostase im adulten K{\"o}rper mitverantwortlich. Ihre Funktionalit{\"a}t vermitteln die BMPs {\"u}ber eine Signalkaskade, indem sie als dimeres Protein spezifische transmembrane Serin/Threonin-Kinaserezeptoren von Typ I und Typ II in einem heteromeren Komplex assemblieren. Die intrazellul{\"a}re Signalweiterleitung verl{\"a}uft {\"u}ber verschiedene Signalkaskaden (Smad-Proteine oder MAPKs), wodurch final im Zellkern {\"A}nderungen auf der Ebene der Gentranskription ausgel{\"o}st werden. Laut der namensgebenden Eigenschaft fungieren einige Wachstumsfaktoren als aktive Induktoren der Knochenbiosynthese. Ihre Anwesenheit ist essentiell f{\"u}r die vielen zellul{\"a}ren Prozesse, die w{\"a}hrend einer Frakturheilung auftreten, wobei eine Knochenneubildung ebenso stark abh{\"a}ngig ist vom Zusammenspiel verschiedener Stimulatoren und Inhibitoren, die die BMPs in ihrer Aktivit{\"a}t regulieren. Bedingt durch ihr großes Potential fanden die erstmals durch Marshal Urist 1965 aus Knochenmaterial isolierten BMP-Proteine ihren Einsatz in der regenerativen Medizin. Kommerziell erh{\"a}ltlich und bereits seit vielen Jahren in der klinischen Anwendung befindet sich derzeit das rhBMP-2 und rhBMP-7. Diese beiden Wachstumsfaktoren werden u.a. verwendet, um die Heilungsprozesse von langwierigen Schienbeinfrakturen zu verbessern, aber auch bei degenerativen Wirbels{\"a}ulenerkrankungen und in der Kieferchirurgie. Jedoch f{\"u}hrt die schlechte L{\"o}slichkeit des BMPs aufgrund der ausgepr{\"a}gten Aggregationstendenz zu gravierenden Problemen, nicht nur w{\"a}hrend der biotechnologischen Herstellung, sondern auch bei der klinischen Anwendung. Der Schwerpunkt des Optimierungsbedarfs der BMP-2 Herstellung im Rahmen dieser Doktorarbeit lag daher auf der Etablierung eines prokaryotischen Expressionssystems f{\"u}r die l{\"o}sliche Produktion von BMP-2. Daf{\"u}r wurde zun{\"a}chst der Fokus auf die ung{\"u}nstigen L{\"o}slichkeitseigenschaften des Wachstumsfaktors gelegt. Um die hohe Aggregationsneigung des BMP-2 w{\"a}hrend der Produktion in Escherichia coli zu minimieren, wurden anhand einer Algorithmus-basierten Analyse BMP-2-Varianten entworfen, in denen Aminos{\"a}uren mit stark hydrophoben Eigenschaften gegen solche mit hydrophilem Charakter ausgetauscht wurden. Hierdurch konnten die zur Aggregation neigenden Bereiche des BMP-2 weitestgehend eliminiert werden. Es wurden f{\"u}r die bez{\"u}glich ihrer L{\"o}slichkeit optimierten Proteinvarianten unterschiedliche Expressionsstrategien etabliert, wodurch dimere BMP-2-Muteine in angepassten chromatographischen Profilen mit einem Aufreinigungsschritt und ohne jegliche Renaturierungsmaßnahmen gewonnen wurden. Allerdings verbleiben hierbei Restmengen an bakteriellen Kontaminationen, die vorwiegend aus endogenen ribosomalen E. coli-Proteinen stammen und nicht vollst{\"a}ndig entfernt werden konnten. W{\"a}hrend der umfassenden in vitro Charakterisierung der BMP-2-Varianten konnte durch massenspektroskopische Analysen die Gesamtmasse beider Zielproteine best{\"a}tigt werden, wobei sequenzspezifische Fragmente eine eindeutige Identifikation der eingebrachten Mutationen erm{\"o}glichten. CD-spektroskopische Analysen erweitert um Auswertealgorithmen konnten die wesentlichen Wt-BMP-2-typischen Sekund{\"a}rstrukturelemente identifizieren. Die neu generierten BMP-2-Varianten zeigen in der dynamischen Lichtstreuungsanalyse stark verminderte Aggregationstendenz im Vergleich zum Wildtyp-BMP-2. Dessen Aggregationsverhalten wurde durch die kombinierte Analytik seiner mikrofluidischen Diffusion und der dynamischen Lichtstreuung zum ersten Mal {\"u}ber den Konzentrationsbereich von 0.5 µM bis 100 mM genau charakterisiert. Erste zellbiologische Versuche verliefen ohne Erfolg, wodurch die biologische Aktivit{\"a}t der BMP-Varianten nicht abschließend gekl{\"a}rt werden konnte. Die simple Methode zur Expression und Aufreinigung der hydrophilisierte BMP-2-Muteine aus dieser Dissertation kann leicht in einen gr{\"o}ßeren Produktionsmaßstab {\"u}berf{\"u}hrt werden. BMP 2 kann dadurch schneller und kosteng{\"u}nstiger hergestellt werden. Final bleibt es jedoch erforderlich, die biologische Aktivit{\"a}t der neuen l{\"o}slichen BMP-2-Varianten vollst{\"a}ndig zu charakterisieren, um deren ganzes Funktionsspektrum zu entdecken. Der Fokus weiterer Forschung sollte zudem auf die verbleibende Oligomerisierungstendenz und die bestehende Kontamination mit Fremdproteinen gelegt werden, da diese beiden Faktoren letztendlich die Ausbeute an dimeren BMP-2 Varianten aus diesem System derzeit minimieren.},
  subject      = {Knochen-Morphogenese-Proteine},
  language  = {de}
}