@phdthesis{Amelingmeier2022,
  author    = {Amelingmeier, Florian},
  title     = {Identifizierung und Untersuchung TOP-mRNA - bindender Faktoren},
  doi       = {10.25972/OPUS-28923},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-289231},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2022},
  abstract  = {Im Zellkern eukaryotischer Zellen werden Gene in mRNAs transkribiert, welche umfangreich prozessiert und aus dem Zellkern exportiert werden. Im Zytoplasma erfolgt die Translation der mRNAs in Proteine, ein Prozess, welcher viel Energie ben{\"o}tigt und daher mittels vielf{\"a}ltiger Mechanismen streng reguliert wird. Ein Beispiel hierf{\"u}r stellt die Klasse der TOP-mRNAs dar, eine RNA-Spezies, welche haupts{\"a}chlich Transkripte von Genen umfasst, die selbst in die Translation involviert sind. Die prominentesten Vertreter dieser Klasse sind die Proteine der kleinen und großen ribosomalen Untereinheiten. TOP-mRNAs zeichnen sich durch ein gemeinsames Sequenz-Motiv am Anfang Ihrer 5'-UTR aus, welches aus einem Pyrimidinstrang besteht und unmittelbar nach dem Cap mit einem Cytosin beginnt. Dieses allen TOP-RNAs gemeinsame Motiv erm{\"o}glicht die zeitgleiche Translationskontrolle dieser RNA-Klasse. So kann die Translation der TOP-mRNAs unter Stressbedingungen wie z.B. N{\"a}hrstoffmangel koordiniert inhibiert werden, wodurch Energie eingespart wird. Bereits lange wird nach einem Regulator gesucht, der an dieses TOP-Motiv bindet und die koordinierte Regulation erm{\"o}glicht. Man kann sich hier einen Inhibitor oder auch einen Aktivator vorstellen. Verschiedene Proteine wurden bereits in Erw{\"a}gung gezogen. In dieser Arbeit wurde das Protein TIAR mittels Massenspektrometrie als TOP-interagierender Faktor identifiziert und dessen Bindungseigenschaften mit dem TOP-Motiv durch Shift Assays untersucht. Hierbei konnten Minimalkonstrukte verschiedener Organismen sowie RNA-TOP - Sequenzen identifiziert werden, welche sich f{\"u}r Strukturanalysen eignen w{\"u}rden. Als weiterer TOP-interagierender Faktor wurde {\"u}ber verschiedene sequenzielle Reinigungsschritte das Protein 14-3-3ε identifiziert. Weiterhin wurden die TOP-Motiv-bindenden Proteine LARP1 und LARP7 auf Ihre Bindungseigenschaften mit Ihren Zielsequenzen untersucht. W{\"a}hrend gezeigt werden konnte, dass LARP1 einen inhibierenden Einfluss auf TOP-RNAs hat, wurde in weiteren Shift-Assays die Bindungseigenschaften von LARP7 mit 7SK untersucht, wobei ebenfalls ein minimales LARP7-Konstrukt sowie 7SK-Konstrukte f{\"u}r Strukturanalysen identifiziert werden konnten. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass verschiedene Substanzen wie tRNA und Arginin einen starken Einfluss auf die LARP7-7SK - Interaktion aus{\"u}ben, welcher in weiteren Studien ber{\"u}cksichtigt werden sollte.},
  subject      = {Proteinbiosynthese},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Kuespert2014,
  author    = {K{\"u}spert, Maritta},
  title     = {Untersuchung zur Rolle des La-verwandten Proteins LARP4B im mRNA-Metabolismus},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-107490},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2014},
  abstract  = {Eukaryotische messenger-RNAs (mRNAs) m{\"u}ssen diverse Prozessierungsreaktionen durchlaufen, bevor sie der Translationsmaschinerie als Template f{\"u}r die Proteinbiosynthese dienen k{\"o}nnen. Diese Reaktionen beginnen bereits kotranskriptionell und schließen das Capping, das Spleißen und die Polyadenylierung ein. Erst nach dem die Prozessierung abschlossen ist, kann die reife mRNA ins Zytoplasma transportiert und translatiert werden. mRNAs interagieren in jeder Phase ihres Metabolismus mit verschiedenen trans-agierenden Faktoren und bilden mRNA-Ribonukleoproteinkomplexe (mRNPs) aus. Dieser „mRNP-Code" bestimmt das Schicksal jeder mRNA und reguliert dadurch die Genexpression auf posttranskriptioneller Ebene. F{\"u}r das La-verwandte Protein LARP4B (La-related protein 4B) wurde k{\"u}rzlich eine direkte Interaktion mit den Translationsfaktoren PABPC1 (poly(A) binding protein, cytoplasmic 1) und RACK1 (receptor for activated C kinase) gefunden. Diese Befunde sowie die Assoziation mit aktiv translatierenden Ribosomen l{\"a}sst vermuten, dass LARP4B zum mRNP-Code beitr{\"a}gt. Die Dom{\"a}nenstruktur des Proteins legt dar{\"u}ber hinaus nahe, dass LARP4B direkt mRNAs bindet. Um einen Einblick in die Funktion von LARP4B und seiner in vivo RNA-Bindungspartner zu erhalten, wurde die mRNA-Assoziation transkriptomweit mit Hilfe von PAR-CLIP (Photoactivatable-Ribonucleoside-Enhanced Crosslinking and Immunoprecipitation)-Experimenten bestimmt. Diese Daten zeigten, dass LARP4B ein spezifisches Set an zellul{\"a}ren mRNAs {\"u}ber Sequenzbereiche in deren 3'-untranslatierten Regionen bindet. Die bioinformatische Auswertung der PAR-CLIP-Daten identifizierte ein LARP4B-Bindemotiv, welches durch in vitro Bindungsstudien validiert werden konnte. Dar{\"u}ber hinaus belegten pSILAC (pulsed stable isotope labeling with amino acids in cell culture)-Experimente und eine transkriptomweite Analyse der mRNA-Level, dass LARP4B die Expression der Ziel-mRNAs beeinflusst, indem es die Stabilit{\"a}t der gebundenen Transkripte erh{\"o}ht. LARP4B konnte somit als positiver Faktor der eukaryotischen Genexpression identifiziert werden.},
  subject      = {Messenger-RNS},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Saar2007,
  author    = {Saar, Matthias},
  title     = {Der Nachweis der muscarinischen Rezeptorsubtypen M2, M3 und M5 im schwangeren und nicht schwangeren humanen Myometrium mittels RT-PCR},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-24436},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2007},
  abstract  = {Da die Kontrolle der Kontraktion am Myometrium in der klinischen Praxis eine bedeutende Rolle spielt, sind Kenntnisse {\"u}ber die Physiologie zur Blockierung der Wehent{\"a}tigkeit und Vermeidung von Fr{\"u}hgeburtlichkeit unverzichtbar. Der Einfuß des sympathischen Nervensystems mit Alpha und Beta-Rezeptoren ist gut untersucht, weshalb wir in der vorliegenden Arbeit eine Untersuchung zur Verteilung der muscarinischen Rezeptoren M1-M5 im schwangeren und nicht schwangeren Myometrium durchf{\"u}hrten. Diese G-Protein gesteuerten parasympathischen Rezeptoren sind beispielsweise an Kontraktionsvorg{\"a}ngen in Blasen-, Magen-Darm- und Bronchialmuskulatur beteiligt und k{\"o}nnten so auch im Myometrium eine Rolle spielen. Mittels RT-PCR wurden 21 Myometriumbiopsien analysiert, wovon 11 Myometriumproben von Patientinnen in der 40. Schwangerschaftswoche, sowie jeweils 3 Proben von Patientinnen in der 32. Schwangerschaftswoche und von Patientinnen in der 25. Schwangerschaftswoche stammten, desweiteren eine Probe einer in der 10. Schwangerschaftswoche durch Hysterektomie abgebrochenen Schwangerschaft. Die drei letzten Proben stammten von nicht schwangeren Patientinnen nach vaginaler Hysterektomie. Dabei konnte gezeigt werden, dass sowohl zu verschiedenen Zeitpunkten in der Schwangerschaft, als auch am nicht schwangeren Myometrium jeweils m-RNA f{\"u}r M2, M3 und M5 muscarinische Rezeptoren existiert. Die durch die hier angewendeten Verfahren zur Gewebepr{\"a}paration, Gewinnung von RNA und Anwendung der RT-PCR vorliegenden Ergebnisse sollten auf Proteinebene best{\"a}tigt werden, die Durchf{\"u}hrung funktioneller Studien w{\"a}re w{\"u}nschenswert.},
  subject      = {Reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Walter2008,
  author    = {Walter, Christina},
  title     = {Quantifizierung des postmortalen RNA-Status im Gehirn mittels Real-time-PCR: Ein Beitrag zur Bestimmung der Leichenliegezeit},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-28570},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2008},
  abstract  = {Quantifizierung des postmortalen RNA-Status im Gehirn mittels Real-time-PCR: Ein Beitrag zur Bestimmung der Leichenliegezeit Der postmortale Nukleins{\"a}ureabbau verl{\"a}uft unterschiedlich: w{\"a}hrend DNA im Allgemeinen als stabil angesehen wird und erst mit Einsetzen von F{\"a}ulniserscheinungen st{\"a}rkerer Degradation unterliegt, wird RNA mit dem Sistieren der Kreislauft{\"a}tigkeit relativ rasch abgebaut. Eine Reihe von Studien hat aber gezeigt, dass RNA in bestimmten Geweben eine h{\"o}here Stabilit{\"a}t besitzt als urspr{\"u}nglich angenommen. Dies k{\"o}nnte Bedeutung f{\"u}r die molekulare Medizinforschung besitzen, die auf Genexpressionsstudien in postmortalem Gewebe angewiesen ist. Außerdem k{\"o}nnte eine Quantifizierung der RNA-Degradation z.B. durch Real-time-PCR zur Eingrenzung der Leichenliegezeit genutzt werden. In dieser Studie wurde ein quantitativer Vergleich verschiedener sog. Haushaltsgene (u.a. GAPDH, ß-Actin, FASN) in Gehirngewebe mit einer Leichenliegezeit zwischen 0 und 96 Stunden und unter alternativen Ans{\"a}tzen zur reversen Transkription (oligo-(dT)-Primer mit und ohne sog. Anker, Random Hexamer Primer) durchgef{\"u}hrt. Zun{\"a}chst erfolgten systematische Untersuchungen zur Effektivit{\"a}t der RNA-Isolierung, reversen Transkription und der PCR im Hinblick auf eine m{\"o}glichst pr{\"a}zise Quantifizierung. Es zeigte sich, dass die Resultate der Real-time-PCR ein Maß f{\"u}r die urspr{\"u}nglich in der Probe vorhandene mRNA-Menge darstellen. Weiterhin stellte sich heraus, dass eine deutliche und evtl. auch zur Liegezeitbestimmung nutzbare RNA-Degradation erst nach 24h einsetzt. Ein wesentlicher Unterschied zwischen Random- und oligo-(dT)-priming der reversen Transkription war dabei nicht festzustellen. Diese Ergebnisse belegen zum einen, dass RNA im fr{\"u}hen postmortalen Intervall relativ stabil ist und als Substrat f{\"u}r quantitative Untersuchungen dienen kann, zum anderen, dass ein zeitabh{\"a}ngiger Abbau besteht, der eine Eingrenzung der Leichenliegezeit z.B. mittels Grenzwerten in ein fr{\"u}hes und mittleres Postmortalintervall zul{\"a}sst.},
  subject      = {Quantifizierung},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Brambrink2002,
  author    = {Brambrink, Tobias},
  title     = {Entwicklung und Evaluierung eines Verfahrens zur Genexpressionsanalyse bei individuellen pr{\"a}implantatorischen S{\"a}ugerembryonen {\"u}ber die cDNA-Array-Technologie},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-1787},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2002},
  abstract  = {Untersuchungen der Transkriptionsebene individueller pr{\"a}implantatorischer Embryonalstadien k{\"o}nnen wertvolle Informationen {\"u}ber den physiologischen Status der betrachteten Embryonen, die z.B. zur Verbesserung der Systeme zur In vitro-Produktion von Embryonen genutzt werden k{\"o}nnen, liefern. Bisher fehlte es jedoch an einer geeigneten Technologie, um eine große Anzahl von Transkripten in einzelnen Embryonen zu erfassen. Zielsetzung der vorliegenden Arbeit war es, ein Verfahren zur globalen Amplifikation embryonaler mRNA-Pr{\"a}parationen zu entwickeln, das die Analyse der Transkriptionsebene einzelner pr{\"a}implantatorischer Embryonalstadien {\"u}ber die cDNA-Array-Technologie erm{\"o}glicht. Dazu wurde die Strategie gew{\"a}hlt, zwei bereits etablierte Amplifikationsverfahren, Polymerasekettenreaktion und In vitro-Transkription, zu kombinieren, um so synergistische Effekte beider Verfahren zu nutzen. Die Evaluierung des entwickelten Verfahrens zeigte eine hohe Reproduzierbarkeit der erhaltenen Genexpressionsdaten und belegte, dass die relativen Mengenverh{\"a}ltnisse einzelner mRNA-Spezies zueinander w{\"a}hrend der globalen mRNA-Amplifikation nur unwesentlich ver{\"a}ndert wurden. Die entwickelte Methodik ist somit geeignet, komplexe Genexpressionsprofile einzelner Blastozysten zu erstellen und Unterschiede in der Expressionsst{\"a}rke einzelner Transkripte zu detektieren. Es konnte weiterhin gezeigt werden, dass es m{\"o}glich ist, {\"u}ber heterologe Hybridisierung Genexpressionsprofile boviner Blastozysten mit cDNA-Arrays, die murine Probensequenzen enthalten, reproduzierbar darzustellen. Neben der Detektion individueller Unterschiede in den Genexpressionsprofilen diverser muriner Embryonalstadien und boviner Blastozysten lag ein Schwerpunkt dieser Arbeit in der Untersuchung der Auswirkungen verschiedener in vitro-Produktionssysteme auf die embryonale Genexpression. Die erhaltenen cDNA-Array Expressionsdaten muriner Oozyten, Zweizeller und Blastozysten befanden sich dabei in {\"U}bereinstimmung mit Daten fr{\"u}herer Publikationen anderer Arbeitsgruppen. Genexpressionsprofile in vitro fertilisierter boviner Blastozysten ließen eine Beurteilung der Auswirkungen unterschiedlicher Proteinsupplemente des Kulturmediums auf die embryonale Genexpression zu. Im Rahmen dieser Arbeit wurden zum ersten Mal Genexpressionsprofile einzelner pr{\"a}implantatorischer S{\"a}ugerembryonen {\"u}ber cDNA-Array-Analyse erstellt. Die entwickelte Technologie erm{\"o}glicht es -bei Verwendung entsprechender cDNA-Array-Systeme-, eine theoretisch unbegrenzte Zahl von Transkripten in individuellen S{\"a}ugerembryonen semiquantitativ zu erfassen. Dies ist ein wichtiger Schritt hin zu einem besseren Verst{\"a}ndnis komplexer Regulationsabl{\"a}ufe w{\"a}hrend der fr{\"u}hen Embryonalentwicklung und einer besseren Beurteilung der Lebensf{\"a}higkeit und Entwicklungskompetenz in vitro produzierter Embryonen, was f{\"u}r die Verbesserung von In vitro-Produktionssystemen f{\"u}r Embryonen sowohl bei Tieren als auch beim Menschen unerl{\"a}sslich ist.},
  subject      = {Embryo},
  language  = {de}
}