@phdthesis{Freitag2011, author = {Freitag, Claudia}, title = {Quantifizierung von Aminos{\"a}uren in Infusionsl{\"o}sungen mittels Hochleistungsfl{\"u}ssigkeitschromatographie-(Tandem) - Massenspektrometrie(HPLC-[MS/]MS) Methodenentwicklung und Validierung}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-65198}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2011}, abstract = {Das Ziel vorliegender Arbeit war die Entwicklung einer HPLC-MS(/MS)-Methode, die im Rahmen der pharmazeutischen Qualit{\"a}tskontrolle zur direkten Quantifizierung von Aminos{\"a}uren (AS) in Infusionsl{\"o}sungen angewendet werden kann. Die Zielset-zung schloss eine Validierung innerhalb der f{\"u}r die Zweckbestimmung vorgesehenen Grenzen ein. Im Rahmen der Methodenentwicklung wurde das ESI-MS/MS-Fragmentierungs-muster von 21 Aminos{\"a}uren, von 20 stabil-isotopenmarkierten Aminos{\"a}uren, die als interne Standards verwendet wurden, sowie von einigen weiteren Substanzen bestimmt. Nach Kenntnis von Precursor- und Produktionen erstellte man eine SRM-Methode zur spezifischen MS/MS-Analyse. Dabei wurden durch das jeweilige Frag-mentierungsmuster bedingte Interferenzen bei den zu untersuchenden Aminos{\"a}uren bestimmt, die bei der zu erarbeitenden HPLC-MS-Methode beachtet werden mussten. Die Methodenentwicklung zur HPLC-MS-Analytik von underivatisierten AS umfasste mit der RP-HPLC unter Verwendung eines Ionenpaarreagenzes (IP) und der hydrophilen Interaktionschromatographie (HILIC) zwei verschiedene chromatographi-sche Ans{\"a}tze. Bei der Anwendung der RP-HPLC ergaben sich Probleme. Die Verwendung eines IP, im vorliegenden Fall TDFHA (Tridecafluorheptans{\"a}ure), f{\"u}hrte zu langen Equilibrierungs-, Re-Equilibrierungs- und Sp{\"u}lzeiten und damit bei zwar relativ kurzer HPLC-Laufzeit zu einem aber insgesamt hohen Zeitaufwand. Gleich-zeitig war die LC-MS-Anlage auf diese Anwendung fixiert, da das Ionenpaarreagenz das Ger{\"a}t stark verschmutzte und dadurch andere Analysen erheblich st{\"o}rte. Zudem waren die Retentionszeiten der Analyten trotz langer Equilibrierungszeiten schlecht reproduzierbar, so dass eine solche Methode im Rahmen der pharmazeutischen Qualit{\"a}tskontrolle schwer validierbar w{\"a}re. Weiterf{\"u}hrende Untersuchungen erfolgten daher nicht. In nachfolgenden Studien mit der HILIC wurden verschiedene Einflussparameter (Anteil organischer Phase im Fließmittel, pH-Wert des Fließmittels, Temperatur der S{\"a}ule, Pufferkonzentration im Fließmittel, Gradientenelution) auf die Trennung der AS an einer ZIC®-HILIC-S{\"a}ule untersucht. Durch Optimierung der Parameter wurde so eine HILIC-HPLC-Methode entwickelt, bei der 21 AS und 20 ihrer isotopen-markierten Referenz-AS innerhalb von 20 min eluierten. Diejenigen AS, bei denen im Rahmen der Fragmentierungsstudien Interferenzen aufgrund gleicher bzw. {\"a}hnlicher Massen der Precursor- bzw. Produktionen aufgetreten waren, wurden chroma-tographisch getrennt. Gleichzeitig hat sich die SIM-Analyse als anwendbar erwiesen. Die Anwendung des spezifischeren SRM-Modus und damit der Tandem-Massenspektrometrie war nicht erforderlich. Im Rahmen der nachfolgenden Studien zur Validierung ergab sich, dass die entwickelte Methode {\"u}ber einen weiten Bereich eine lineare Abh{\"a}ngigkeit zwischen Konzentrations- und Messwerten zeigte. F{\"u}r drei der 21 AS (NAcCys, NAcTyr, Pro) wurde die quadratische Regression mit dem Anpassungstest nach Mandel als geeig-neteres Regressionsmodell ermittelt. Bei Untersuchungen zur Wiederfindung wurde ein Einfluss der Matrix-L{\"o}sung der Infusionsl{\"o}sung festgestellt, der zu Abweichungen hinsichtlich des Quotienten AreaAS / AreaIS f{\"u}hrte, so dass eine Quantifizierung innerhalb der geforderten Grenzen bei Kalibrierung {\"u}ber reine Standardl{\"o}sungen nicht m{\"o}glich war. Die Validierung wurde daher nachfolgend in der Matrixl{\"o}sung durchgef{\"u}hrt. Dabei wurde gezeigt, dass mit der entwickelten HILIC-HPLC-MS-Methode Aminos{\"a}uren in Infusionsl{\"o}sungen mit hoher Pr{\"a}zision und Richtigkeit bestimmt werden k{\"o}nnen. Neun der 21 untersuchten AS konnten im Bereich von 30\% - 350\%, zehn weitere im Bereich von 50\% - 350\% innerhalb der zur Gehaltsbestimmung von pharmazeutischen Formulierungen vorgeschriebenen Grenzen (Wiederfindung Einzelbestimmung: 98\% -102.0\%, Mittelwert einer Dreifachbestimmung: 98.5\% - 101.5\%) quantifiziert werden. F{\"u}r His und Phe gelang allerdings keine Quantifizierung innerhalb der Akzeptanzkriterien, wobei der Grund hierf{\"u}r in weiteren Studien gekl{\"a}rt werden m{\"u}sste. Mit der entwickelten Methode ist damit eine gleichzeitige Quantifizierung verschiedener AS-Infusionsl{\"o}sungsformulierungen m{\"o}glich, die sich bei gleicher Matrix in der Konzentration an AS unterscheiden. Beispielsweise seien hier die Formulierungen „Aminoplasmal® E 5\% / 10\% /15\%" genannt, die mit der validierten Methode erfassbar sind. Die Probenvorbereitung beschr{\"a}nkt sich dabei auf den Zusatz der IS-Formulierung zur Infusionsl{\"o}sung und einen Verd{\"u}nnungsschritt. Die Quanti-fizierung erfolgt {\"u}ber eine 5-Punkt-Kalibriergerade, die aus einer AS- und IS-Standardmischung, nach Zusatz der einfach herzustellenden Elektrolyt-Matrix, erstellt wird. Die Analysenzeit der HPLC-MS-Methode betr{\"a}gt einschließlich Equilibrie-rungszeit 35 min und ist damit deutlich k{\"u}rzer als die 120 min, die bei der nach wie vor zur AS-Analytik allgemein gebr{\"a}uchlichen Ionenaustauschchromatographie mit Ninhydrin-Nachs{\"a}ulenderivatisierung anzusetzen sind.}, subject = {Aminos{\"a}uren}, language = {de} } @phdthesis{Borst2011, author = {Borst, Claudia}, title = {Kapillarelektrophoretische Reinheitsanalytik verschiedener Arzneistoffe des Europ{\"a}ischen Arzneibuchs}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-56243}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2011}, abstract = {Die Kapillarelektophorese (CE), deren Trennprinzip auf der Wanderung geladener Teilchen im elektrischen Feld basiert, ist eine Methode, die in verschiedenen Techniken angewandt werden kann. Sowohl die w{\"a}ssrige Kapillarzonenelektrophorese (CZE) als auch die wasserfreie CE (NACE), aber auch die elektrokinetische Chromatographie mittels Mikroemulsion (MEEKC) wurden in dieser Arbeit f{\"u}r die Reinheitsanalytik der im Europ{\"a}ischen Arzneibuch beschriebenen Wirkstoffe Ethambutol, Quetiapin, Ephedrin sowie Levodopa und deren jeweils strukturverwandter Substanzen benutzt. Der Wirkstoff Ethambutol wird in der (S,S)-Form verwendet, die im Ph. Eur. 7 als Dihydrochlorid aufgef{\"u}hrt ist. Um eine Trennmethode f{\"u}r (S,S)-Ethambutol, sein Enantiomer und die achirale meso-Verbindung entwickeln zu k{\"o}nnen, wurden die beiden stereoisomeren Verunreinigungen aus 2-Amino-1-butanol und Diethyloxalat synthetisiert. Zur Trennung dieser drei Ethambutol-Isomere wurde CZE als Methode gew{\"a}hlt. In saurem Phosphatpuffer musste eine hohe Probenkonzentration von 1 mg/ml verwendet werden, um die Substanzen mit UV detektieren zu k{\"o}nnen (λ: 200 nm). In alkalischem Tetraboratpuffer war das Chromophor dank der freien Elektronenpaare der Stickstoff-Molek{\"u}le besser ausgepr{\"a}gt und die Intensit{\"a}t der Peaks deutlich intensiver. Als chirale Selektoren wurden die nativen α-, β- und γ-Cyclodextine (CDs) und verschiedene derivatisierte β-CDs eingesetzt. Die Methode wurde vielfach in Bezug auf Molarit{\"a}t und pH-Wert der Puffer, Konzentration der verschiedenen chiralen Selektoren, Spannung und Temperatur modifiziert. Jedoch konnte keine Trennung der Stereoisomere erreicht werden. Eine CD-modifizierte MEEKC-Methode wurde herangezogen, um die Racemate der Aminos{\"a}uren Dopa, Methyldopa, Tyrosin und Phenylalanin voneinander zu trennen. Dazu wurde eine Mikroemulsion (ME) aus Ethylacetat, SDS, 1-Butanol, Phosphatpuffer, sulf. β-CD und, wenn n{\"o}tig, aus dem organischen Modifier 2-Propanol eingesetzt. F{\"u}r jede DL-Aminos{\"a}ure wurde die Zusammensetzung der ME als auch die Ger{\"a}teeinstellungen (Spannung, Temperatur) optimiert. Die Trennung von DL-Dopa konnte ohne Zugabe eines organischen Modifiers durchgef{\"u}hrt werden. Auf Grundlage dieser individuellen Methoden wurden zwei CD-modifizierte MEEKC-Methoden entwickelt, mit denen alle vier untersuchten Racemate getrennt werden konnten. Die abschließende Validierung in Bezug auf Wiederholpr{\"a}zision (Aufl{\"o}sung, Migrationszeiten, Verh{\"a}ltnis der korrigierten Peakfl{\"a}chen und Anzahl der theoretischen B{\"o}den) und Detektionsgrenzen zeigte, dass die Methoden pr{\"a}zise Ergebnisse liefern. Die Technik der MEEKC wurde auch zur Trennung von Ephedrin-Derivaten genutzt. Wedig et al. konnten die Racemate von Ephedrin, Pseudoephedrin, N-Methylephedrin und Norephedrin mit einer HDAS-β-CD-modifizierten CZE-Methode in einem Lauf basislinientrennen, indem ein 50 mM Phosphatpuffer, pH 3,0 als HGE eingesetzt wurde. Aus diesem HGE und den organischen Bestandteilen, die zur Trennung der Aminos{\"a}uren f{\"u}hrten, wurde eine ME hergestellt. Entgegen der Methode von Wedig et al. konnte mittels HDAS-β-CD keine zufriedenstellende Trennleistung erreicht werden. Durch Austausch des chiralen Selektors gegen sulf. β-CD und Modifizierung des Phosphatpuffers in Ionenst{\"a}rke und pH-Wert konnte f{\"u}r alle vier Epedrin-Derivate eine Basislinientrennung erzielt werden. Diese MEEKC-Methode wurde auf weitere Ephedrin-Derivate angewandt, wodurch das racemische 2-(Dibutylamino)-1-phenyl-1-propanol partiell, die Racemate von Adrenalin, 2-Amino-1-phenylethanol und Diethylnorephedrin vollst{\"a}ndig voneinander getrennt werden konnten. W{\"a}hrend mit der HDAS-β-CD-modifizierten CZE-Methode alle vier Ephedrin-Derivaten in einem Lauf getrennt werden konnten, hat die MEEKC-Methode den Vorteil mit dem kosteng{\"u}nstigeren sulf. β-CD auszukommen. Schlussendlich wurde eine Reinheitsanalytik von Quetiapin und seinen verwandten Substanzen Quetiapindesethanol, Quetiapin-N-Oxid und Quetiapinlactam entwickelt. Da Quetiapinlactam fast ausschließlich in organischen L{\"o}sungsmitteln l{\"o}slich ist, sollte eine wasserfreie CE-Methode (NACE) eingesetzt werden. Zwar konnte eine Methode entwickelt werden, deren HGE aus Methanol, Acetonitril, Ammoniumacetat und Essigs{\"a}ure bestand, und mit der Quetiapin und seine drei verwandten Substanzen sehr gut getrennt werden konnten. Allerdings konnte sie aufgrund von Stromabbr{\"u}chen nicht validiert werden. Alternativ wurde eine w{\"a}ssrige, gut reproduzierbare CZE-Methode gefunden, deren Elektrolytl{\"o}sung aus einem 80 mM Phosphatpuffer, pH 4.0 bestand. Aufgrund der Wasserunl{\"o}slichkeit von Quetiapinlactam konnten so nur Quetiapin und die Verunreinigungen Quetiapindesethanol und Quetiapin-N-Oxid erfasst werden. Abschließend wurde die CZE-Methode validiert, wodurch die hohe Pr{\"a}zision der ermittelten Werte gezeigt werden konnte.}, subject = {Kapillarelektrophorese}, language = {de} } @phdthesis{Falgner2010, author = {Falgner, Steffen}, title = {Synthese neuartiger siliciumhaltiger Aminos{\"a}uren sowie potentieller siliciumorganischer dipeptidischer S{\"u}ßstoffe}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-49701}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2010}, abstract = {Der erste Teil der vorliegenden Arbeit beschreibt neuartige Synthesen siliciumhaltiger Aminos{\"a}uren, ausgehend von Malons{\"a}urediethylester. Weitere Teilschritte dieser Synthesen sind eine biokatalytische enantioselektive Esterspaltung von Malons{\"a}urediethylester-Derivaten mittels Schweineleberesterase und ein Curtius-Abbau. Es wurde in allen Schritten darauf geachtet, kosteng{\"u}nstige und leicht handhabbare Chemikalien zu verwenden, um eine etwaige Produktion der Aminos{\"a}uren in einem gr{\"o}ßeren Maßstab zu erm{\"o}glichen. Der zweite Teil der vorliegenden Arbeit widmet sich Versuchen, aus den im vorangehenden Abschnitt beschriebenen Aminos{\"a}uren potentielle dipeptidische, siliciumorganische S{\"u}ßstoffe herzustellen. Diese werden am besten als Aspartam-Analoga beschrieben. Die Charakterisierung der Verbindungen erfolgte durch NMR-Spektroskopie (1H, 13C, 15N, 29Si), Elementaranalysen und gegebenenfalls durch Kristallstrukturnalysen.}, subject = {Silicium}, language = {de} } @phdthesis{Handmann2002, author = {Handmann, Vera Iris}, title = {Studien zur C/Si-Bioisosterie}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-4719}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2002}, abstract = {Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden Beitr{\"a}ge zur C/Si-Bioisosterie und zur asymmetrischen Synthese neuer siliciumhaltiger alpha-Aminos{\"a}uren geleistet. Im Vordergrund der Untersuchungen stand die Entwicklung neuer pr{\"a}parativer Methoden zur Darstellung siliciumhaltiger Wirkstoffe und die Untersuchung ihrer pharmakologischen Wirksamkeit sowie die Synthese racemischer und enantiomerenreiner siliciumhaltiger alpha-Aminos{\"a}uren des beta-(Trimethylsilyl)alanin-Typs.}, subject = {Kohlenstoff}, language = {de} } @phdthesis{Novatchev2002, author = {Novatchev, Nikolai}, title = {Untersuchung des Verunreinigungsprofils von Aminos{\"a}uren aus fermentativer Herstellung mittels Kapillarelektrophorese}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-4106}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2002}, abstract = {Gegenstand der vorliegenden Arbeit war die Untersuchungen von Verunreinigungsprofilen von Aminos{\"a}uren aus biotechnologischer Herstellung. Dazu sollten die Aminos{\"a}uren Arg, His, Ile, Lys, Phe, Pro, Ser und Trp von verschiedenen Herstellern und aus unterschiedlichen Batches genauer unter die Lupe genommen werden. Mit der im Europ{\"a}ischen Arzneibuch beschriebenen d{\"u}nnschichtchromatographischen Methode (DC-Methode) f{\"u}r „mit Ninhydrin nachweisbare Substanzen" k{\"o}nnen ausschließlich Fremdaminos{\"a}uren nachgewiesen werden und dies nur, wenn der jeweilige Gehalt relativ hoch ist. Andere Stoffgruppen, die aus der biotechnologischen Herstellung stammen, werden aufgrund der Trennbedingungen sowie der Detektionsart der DC-Methode nicht erfasst. Deshalb mussten neue Methoden entwickelt werden. Laut Vorschriften der International Conference of Harmonisation (ICH) m{\"u}ssen unbekannte Verunreinigungen in Wirkstoffen f{\"u}r orale Therapeutika auf 0,1 \% w/w begrenzt werden k{\"o}nnen. In die Untersuchungen wurden neben den Fremdaminos{\"a}uren auch Peptide, Aminozucker und Nucleins{\"a}uren als potentielle Verunreinigungen, die aus der Herstellung bzw. aus dem Reinigungsprozess kommen, einbezogen. Diese zus{\"a}tzlichen Stoffgruppen k{\"o}nnen aus den „Nebenaktivit{\"a}ten" der Mikroorganismen entstehen. Aminos{\"a}uren, Peptide und Aminozucker wurden versucht, kapillarelektrophoretisch zu quantifizieren. F{\"u}r die Bestimmung von Nucleins{\"a}uren wurde zus{\"a}tzlich die UV-Spektroskopie eingesetzt.}, subject = {Aminos{\"a}uren}, language = {de} }