@phdthesis{Geis2005,
  author    = {Geis, Tanja},
  title     = {Molekularbiologische und immunologische Untersuchungen zu klinisch relevanten immunodominanten Antigenen von Methicillin-resistenten Staphylococcus aureus-Bakterien (MRSA) f{\"u}r eine Antik{\"o}rpertherapie},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-18108},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2005},
  abstract  = {Zusammenfassung: Staphylococcus aureus ist einer der h{\"a}ufigsten Erreger von nosokomialen Infektionen. Die grampositiven in Haufen angeordneten kokkoiden Bakterien verursachen neben harmlosen lokal-oberfl{\"a}chlichen Hautinfektionen auch gef{\"u}rchtete lebensbedrohliche Systeminfektionen. Ein großes Problem in der Therapie von S. aureus-Infektionen stellen die zunehmenden Multiresistenzen dieses Erregers dar. Die Entwicklung neuer Antibiotika reicht hierbei auf Dauer oft nicht aus, da immer wieder neue Resistenzen der Bakterien zu erwarten sind. Es besteht daher dringender Bedarf an der Entwicklung alternativer Therapieformen im Kampf gegen multiresistente Problemkeime wie S. aureus. Eine M{\"o}glichkeit besteht in der Immuntherapie, zum Beispiel durch Gewinnung von monoklonalen Antik{\"o}rpern gegen geeignete Targetstrukturen von S. aureus. In den beiden immundominanten Antigenen IsaA und IsaB scheinen solche geeigneten Angriffsstrukturen gefunden zu sein. In dieser Arbeit wurde eine IsaB-Mutante hergestellt und nachfolgend ph{\"a}notypisch charakterisiert. Diese Arbeiten bilden die Grundlage f{\"u}r die Aufkl{\"a}rung der Funktion von IsaB. Weiterhin sollte ein humaner monoklonaler Antik{\"o}rper gegen IsaA generiert werden. Zur Testung der Antigenspezifit{\"a}t war es notwendig einen anti-IsaA-spezifischen ELISA zu entwickeln. Durch die Fusion der Hybridomzelllinie HAB mit B-Lymphozyten aus lymphatischem Gewebe septik{\"a}mischer Patienten sollten Fusionszellen gewonnen werden, die spezifische anti-IsaA-Antik{\"o}rper produzieren. Durch den Einsatz einer humanen Hybridomzelllinie sollten Kreuzspezies-Reaktionen, wie sie bei murinen therapeutischen Antik{\"o}rpern beobachtet wurden, ausgeschaltet werden. Es wurden mehrere Fusionen mit lymphatischem Material (Lymphknoten, Blut-B-Lymphozyten) durchgef{\"u}hrt. Eine spezifische Antik{\"o}rperproduktion blieb hierbei jedoch aus. Ein anti-IsaA-spezifischer ELISA konnte auf der Grundlage polyklonaler anti-IsaA-Antik{\"o}rper aus immunisierten Kaninchen erfolgreich etabliert werden. Der ELISA zeigte die h{\"o}chste Spezifit{\"a}t bei einer Antigenbeschichtung von 2 µg/ml IsaA und einer optimalen Prim{\"a}rantik{\"o}rperkonzentration von 1 : 25600. In einem weiteren Teil der Arbeit sollte die Spezifit{\"a}t des polyklonalen Antik{\"o}rpers und das Vorkommen von IsaA bei verschiedenen Staphylococcus aureus-St{\"a}mmen und anderen Bakterienspezies getestet werden. Dazu wurde mittels Western-Blot die Expression von IsaA untersucht. Ergebnis dieser Untersuchung war, dass IsaA unabh{\"a}ngig von der Herkunft, vom Infektionstyp oder Resistenzeigenschaften von allen S. aureus-Isolaten exprimiert wird. Von den anderen untersuchten Bakteriespezies zeigte der IsaA-spezifische polyklonale Antik{\"o}rper auch eine Reaktion gegen S. haemolyticus, S. hominis, S. lugdunensis, S. warnerii und S. cohnii. Ob diese Staphylokokkenarten ein IsaA-homologes Protein mit konservierten Dom{\"a}nen exprimieren, das mit dem Antiserum kreuzreagiert, m{\"u}ssen zuk{\"u}nftige Untersuchungen zeigen. Die Herstellung der IsaB-Mutante erfolgte durch Konstruktion eines Inaktivierungsplasmides (pTG1), in dem eine Erythromycinkassette zwischen ein „upstream"- und „downstream"-Fragment kloniert wurde. Als Grundlage diente der temperatursensitive „shuttle"-Vektor pBT2, der bei erh{\"o}hter Temperatur in S. aureus nicht weiter replizieren kann und dadurch homologe Fragmente auf dem Vektor mit genomischen Abschnitten rekombinieren. Die erfolgreicher Herstellung der isaB-Mutante wurde im Southern-Blot {\"u}berpr{\"u}ft. Die Mutante wurde verschiedenen vergleichenden Experimenten mit dem Wildtyp unterzogen, um Informationen {\"u}ber die m{\"o}gliche Funktion des Targetproteins IsaB im Hinblick auf Wachstum und Virulenz f{\"u}r S. aureus zu gewinnen. Die Wachstumsexperimente ergaben einen deutlichen Unterschied im Wachstumsverhalten der Mutante im Vergleich zum Wildtyp. Da die Mutante deutlich schneller wuchs als der Wildtyp scheint IsaB wichtig f{\"u}r das Wachstum von S. aureus zu sein. In vitro-Experimente zur Testung von m{\"o}glichen in vivo-Umwelteinfl{\"u}ssen bzw. Stressfaktoren auf das Wachsum der St{\"a}mme erfolgten mittels Zusetzung von Glucose und NaCl. Hier zeigte sich ein deutlicher Wachstumsvorteil des Wildtyps gegen{\"u}ber der isaB-Mutante, so dass unter extremen Umweltbedingungen IsaB S. aureus ein besseres Wachsen erm{\"o}glicht. In weiteren Experimenten wurden das H{\"a}molyse- und Proteolyseverhalten der Mutante im Vergleich zum Wildtyp untersucht. IsaB scheint Einfluss auf die Expression von H{\"a}molysinen und Proteasen zu haben, die wichtige Virulenzfaktoren von S. aureus sind. Die Untersuchungen zur Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration (MHK) von Wildtyp und Mutante ergaben ebenfalls Unterschiede f{\"u}r verschiedene Antibiotika, so dass IsaB Einfluss auf die Antibiotikaempfindlichkeit zu nehmen scheint. Die in dieser Arbeit erzielten Ergebnisse verdeutlichen die prinzipielle Eignung von IsaB als Targetprotein f{\"u}r eine Antik{\"o}rpertherapie bei lebensbedrohlichen S. aureus-Infektionen.},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Olbrich2003,
  author    = {Olbrich, Anke},
  title     = {Die Rolle von bakteriellen DNA-Sequenzen (CpG) bei der Immuntherapie von retroviralen Infektionen},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-5743},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2003},
  abstract  = {Mit dieser Arbeit wird zum ersten Mal der therapeutische Einsatz von immunstimulativer DNA mit CpG-Motiv (CpG-ODN) bei einer akuten Virusinfektion beschrieben. Als experimentelles Modell wurde das Friend Virus (FV), ein muriner Retroviruskomplex, verwendet. Das FV kann in M{\"a}usen eine t{\"o}dlich verlaufende Erythroleuk{\"a}mie induzieren. Durch die Immuntherapie mit CpG-ODN in der akuten Phase einer FV-Infektion konnten 74\% der M{\"a}use vor der Entstehung der Virus-induzierten Leuk{\"a}mie gesch{\"u}tzt werden. Dieser Schutz ging einher mit der Reduktion der Viruslast im Blut und in der Milz der Tiere und wurde durch CpG-ODN induzierte FV-spezifische CD8+-Zellen vermittelt. FV-neutralisierende Antik{\"o}rper und nat{\"u}rliche Killerzellen waren dagegen am CpG-ODN induzierten Schutz nicht beteiligt. Der Einsatz von CpG-ODN als Paraimmunisierung (unspezifische Immunisierung vor einer Infektion) verursachte hingegen einen schwereren FV-induzierten Leuk{\"a}miever-lauf als in infizierten M{\"a}usen ohne vorherige Behandlung. Die prophylaktische CpG-ODN Gabe f{\"u}hrte sogar dazu, dass FV-resistente M{\"a}use empf{\"a}nglich f{\"u}r eine FV-vermittelte Leuk{\"a}mie wurden. Der negative Effekt der prophylaktischen ODN-Behandlung wurde durch die CpG-ODN induzierte Proliferation der wichtigsten Ziel-zellen des FV (Ter119+- Erythrozytenvorl{\"a}uferzellen und B-Zellen) verursacht. Durch die Stimulierung dieser Zellen konnte das Virus schneller replizieren, so dass das Immunsystem der M{\"a}use nicht mehr in der Lage war das Virus zu kontrollieren. Untersuchungen zum therapeutischen Einsatz von CpG-ODN in der sp{\"a}ten, leuk{\"a}mi-schen Phase der Infektion zeigten, dass sich CpG-ODN auch f{\"u}r die Bek{\"a}mpfung von FV-induzierten Tumorzellen einsetzen lassen. Das die CpG-ODN Behandlung von viralen Infektionen zu sehr unterschiedlichen Ergebnissen f{\"u}hren kann, konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden. Die CpG-ODN Behandlung stellte einerseits eine effektive Immuntherapie gegen die FV-induzierte Erkrankung dar, andererseits konnte sie die Viruserkrankung auch verst{\"a}r-ken. Essentiell f{\"u}r den Erfolg der ODN-Behandlung war der richtige Behandlungs-zeitpunkt nach Infektion. Da viele Virusinfektionen durch eine CD8+ CTL-Aktivit{\"a}t kontrolliert werden und CpG-ODN Virus-spezifische CTL Antworten verst{\"a}rken, ist der Einsatz von CpG-ODN f{\"u}r Behandlungen von Virusinfektionen im allgemeinen sehr interessant. Im zweiten Teil dieser Arbeit sollte eine transkutane Vakzinierung (Impfung {\"u}ber die Haut) gegen Retrovirus-induzierte Erkrankungen etabliert werden. CpG-ODN dienten dabei als starkes Adjuvants zur Induktion einer zellul{\"a}ren Immunantwort. F{\"u}r die Imp-fung wurden FV-spezifische T-Zell-Epitope (CTL- und T-Helferzell-Peptide) als Anti-gene eingesetzt. Die transkutane Immunisierung sch{\"u}tzte M{\"a}use vor einer FV-induzierten Leuk{\"a}mie. Der durch die Vakzine vermittelte Schutz reichte jedoch nicht aus, um eine persistierende Infektion mit FV zu verhindern. Die Ergebnisse der im-munologischen Untersuchungen zeigten, dass der Impfschutz von FV-spezifischen CD8+-Zellen vermittelt wurde. Die Studie belegt, daß eine nicht invasive Impfung durchaus in der Lage ist, einen Schutz gegen eine Retrovirus-induzierte Erkrankung zu vermitteln.},
  subject      = {CpG-Inseln},
  language  = {de}
}