@phdthesis{Zimmermann2020,
  author    = {Zimmermann, Benjamin Georg Heinz},
  title     = {Zytokinstimulation von mononukle{\"a}ren Zellen des peripheren Blutes (PBMC) von Patienten mit Diabetes Mellitus Typ 1},
  doi       = {10.25972/OPUS-19962},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-199622},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2020},
  abstract  = {Diabetes mellitus Typ 1 ist eine chronische Autoimmunerkrankung, die {\"u}ber eine Zerst{\"o}rung pankreatischer Beta-Zellen der Langerhans-Inseln zu einem absoluten Insulinmangel f{\"u}hrt. Urs{\"a}chlich f{\"u}r die Zerst{\"o}rung des Pankreasgewebes sind autoreaktive T-Zellen, die eine Entz{\"u}ndungsreaktion (Insulitis) im Pankreas bewirken. Zentrales Thema der Promotionsarbeit ist die Erforschung grundlegender quantitativer und qualitativer Eigenschaften von T-Zellen von Diabetikern im Vergleich zu gesunden, alters-gleichen Kontrollpersonen. Der Fokus der Arbeit liegt dabei auf der Analyse von naiven T-Zellen und ihrer Polarisierbarkeit in proinflammatorische Th17 (Interleukin-17-produzierende) Zellen und regulatorische T-Zellen (Tregs), die die Inflammation unterdr{\"u}cken k{\"o}nnen. Voruntersuchungen der Arbeitsgruppe zeigten tendenziell eine proportionale Vermehrung von proinflammatorischen T-Zellen (Th17 Zellen) im peripheren Blut von Typ1 Diabetikern. Aus dem Vollblut wurden mittels Ficoll-Dichtezentrifugation periphere mononukle{\"a}re Zellen des Blutes (PBMC) gewonnen. {\"U}ber magnetisch aktivierte Zell-Separation (MACS) wurden naive T-Zellen (CD4+CD45RA+CD27+) aus den PBMCs isoliert. Diese naiven Zellen wurden angeregt sich zu adulten, immunkompetenten Zellen zu differenzieren. Die Antigenstimulation der T-Zellen wurde imitiert durch Aktivierung mit Antik{\"o}rpern gegen die Molek{\"u}le CD3 und CD28 oder einem C. albicans-Antigen. Die Stimulation wurde unter Co-Kultivierung mit autologen antigenpr{\"a}sentierenden Zellen durchgef{\"u}hrt. Die Richtung der Differenzierung wurde durch Zugabe verschiedener Zytokin-Cocktails beeinflusst. Nach Abschluss der Kultivierung wurde sowohl der Ph{\"a}notyp der Zellen als auch deren F{\"a}higkeit bestimmte Zytokine zu produzieren mittels Durchflusszytometrie (FACS) bestimmt. Weiterhin wurden Suppressionsassays durchgef{\"u}hrt, bei denen die Suppressionsf{\"a}higkeit von aus naiven T-Zellen induzierten Tregs auf autologe PBMCs von Typ 1 Diabetes Patienten {\"u}berpr{\"u}ft wurde. In dem zun{\"a}chst durchgef{\"u}hrten Vergleich von Kindern mit einer Erstmanifestation mit gesunden Kontrollen konnte eine st{\"a}rkere IFN-Produktion gezeigt werden mit signifikanten Unterschieden innerhalb der Ki67+ Zellen. Interessanterweise zeigte sich diese st{\"a}rkere IFN Sekretion der T-Zellen der Diabetiker unter Bedingungen, die die Expression von TH17-Zellen f{\"o}rdern sollten. Zus{\"a}tzlich konnten T-Zellen nachgewiesen werden, die f{\"u}r IFN und IL17 doppelt positiv waren. In weiteren Versuchen wurden auch Vergleiche zwischen l{\"a}ngere Zeit an Diabetes erkrankten Kindern und erwachsenen Diabetikern mit gesunden Kontrollen durchgef{\"u}hrt. Bei den erwachsenen Diabetikern konnten dabei mehr IFN+/IL17+ T Zellen innerhalb der Ki67+ T-Zellen nachgewiesen werden als bei den Kontrollen. Die Zellkulturexperimente wurden im Weiteren mit C. albicans-Antigen als einem spezifischen Stimulus des Immunsystems durchgef{\"u}hrt. Die Untersuchung zeigte zun{\"a}chst einmal, dass das C. albicans-Antigen bez{\"u}glich Proliferation und T-Zell-Differenzierung ein deutlich schw{\"a}cherer Stimulus im Vergleich zur Stimulation mit aCD3/aCD28 war. Beobachtet werden konnte allerdings, dass es durch Stimulation mit dem C. albicans-Antigen insgesamt zu einer st{\"a}rkeren Aktivierung des TH17-Zell-Systems kam mit Ausnahme der l{\"a}ngere Zeit an einem Diabetes erkrankten Kinder, die eine geringere IL17-Produktion im Vergleich zu den Kontrollen aufwiesen. Insgesamt zeigten sich teils deutliche Unterschiede zwischen den Gruppen der Diabetiker, so dass von einer Beeinflussung der Ergebnisse durch Krankheitsdauer, Krankheitsaktivit{\"a}t, Alter der Probanden und Therapiedauer ausgegangen werden muss. Die Untersuchung des Proliferationsverhaltens ergab sowohl bei den proinflammatorischen T-Zellen als auch bei den Tregs keine Unterschiede zwischen den Diabetikern und den Kontrollpatienten, ebenso wie die quantitative Untersuchung der Ausbildung von CD25+FOXP3+ Tregs aus den naiven T-Zellen unter unspezifischer Stimulation. Unter spezifischer Stimulation hingegen zeigten sich mehr Tregs bei den Kindern mit einer Erstmanifestation und den erwachsenen Diabetikern. Ebenfalls unter Stimulation mit dem C. albicans-Antigen zeigten sich unter proinflammatorischen Bedingungen bei den Kindern mit einer Erstmanifestation und unter antiinflammatorischen Bedingungen bei den erwachsenen Diabetikern ein signifikant h{\"o}herer Anteil CD127- Tregs (CD25+FOXP3+) im Vergleich zu den Kontrollprobanden. Interessanterweise zeigte sich bei den erwachsenen Diabetikern sowohl bei spezifischer als auch bei unspezifischer Stimulation eine st{\"a}rkere Produktion von IL17 durch die Tregs. Die Untersuchung der Expression des Homing-Rezeptors CD62L auf den Tregs ergab keine signifikanten Unterschiede, aber eine h{\"o}here Expression bei allen Diabetikern im Vergleich zu den jeweiligen Kontrollgruppen und die Untersuchung des IFN-Rezeptors erbrachte keine signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen, allerdings zeigten sich die Mediane und Mittelwerte bei den Kindern mit einer Erstmanifestation im Vergleich zu den Kontrollen bei unspezifischer Stimulation erh{\"o}ht. Zur Erg{\"a}nzung der Zellkulturexperimente wurden im Weiteren Suppressionsversuche mit aus naiven T-Zellen induzierten Tregs durchgef{\"u}hrt. Die Suppressionsversuche konnten eine geringere Hemmung der Proliferation durch die induzierten Tregs der Diabetiker zeigen und damit auf eine m{\"o}gliche Dysfunktion der Tregs deuten. Um M{\"o}glichkeiten der Beeinflussung des Immunsystems zu untersuchen wurden die Zellkulturen erneut unter Blockade von IFNy und Zugabe von TGFb durchgef{\"u}hrt. Die Blockade von IFNy f{\"u}hrte zu einer geringer ausgepr{\"a}gten Differenzierung und Proliferation der T-Zellen. Weiterhin konnten in der intrazellul{\"a}ren F{\"a}rbung weniger IFN positive T-Zellen gefunden werden und es zeigte sich eine st{\"a}rkere Expression des IFN-Rezeptors. Bei den Kindern mit einer Erstmanifestation zeigte sich zus{\"a}tzlich auch eine geringere Auspr{\"a}gung der IL17+ T-Zellen. Hier ergaben sich keine Unterschiede in der Quantit{\"a}t der Tregs. Die erwachsenen Diabetiker zeigten hier weniger Tregs, daf{\"u}r aber eine st{\"a}rkere Proliferation innerhalb der Tregs. Bei den Kindern mit einem l{\"a}ngere Zeit bestehenden Diabetes hingegen zeigten sich keine quantitativen Unterschiede. Die Beeinflussung durch Zugabe von TGFb bei den erwachsenen Diabetikern und den Kindern mit einer Erstmanifestation f{\"u}hrte zu einer geringeren T-Zell Differenzierung mit mehr naiven T-Zellen und weniger Memory-T-Zellen sowie zu einer geringeren IFNy Expression. Bei den Erwachsenen zeigte sich ebenso eine geringere Proliferation, geringe Anzahlen f{\"u}r Tregs sowie eine geringe Auspr{\"a}gung der Expression von CD62L und der Produktion von IL17 durch Tregs. Insgesamt konnte gezeigt werden, dass es Unterschiede zwischen den proinflammatorischen T-Zellen sowie den induzierten Tregs der Diabetiker im Vergleich zu den gesunden Kontrollen gibt. Insbesondere die Bedeutung von IFNy bei den Erstmanifestation konnte gezeigt werden. Aber auch die Sekretion von IL17 oder die Expression von CD62L auf den Tregs stellen interessante Ansatzpunkte zur weiteren Erforschung des Diabetes dar. Weiterhin zeigten die Suppressionsversuche eine gest{\"o}rte Regulation durch die induzierten Tregs bei den Diabetikern. Sowohl die Blockade von IFNy als auch die Zugabe von TGFb zeigten inflammationshemmende Wirkung bei den Lymphozyten der Diabetiker in vitro und stellen interessante Ansatzpunkt f{\"u}r eine m{\"o}gliche Therapie dar.},
  subject      = {Regulatorischer T-Lymphozyt},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Abt2006,
  author    = {Abt, Marion},
  title     = {Interaktion von Masernviren mit Dendritischen Zellen : Untersuchungen zur Rezeptorbenutzung, Regulation der Chemotaxis und T-Zellkommunikation},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-19706},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2006},
  abstract  = {Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss von MV auf die Expression und Nutzung verschiedener Rezeptoren auf Dendritischen Zellen (DC) untersucht. Dazu wurden DC in vitro aus Monozyten gewonnen und mit IL- 4 und GM-CSF ausdifferenziert. In der Arbeit wurden das Wildtypvirus WTF und der Vakzinestamm ED eingesetzt. Im ersten Teil der Arbeit wurde die Expression der Chemokinrezeptoren 5 (CCR5) und 7 (CCR7) auf MV-infizierten DC-Kulturen sowie das Migrationsverhalten der DC untersucht. Die Expression von CCR5 ist abh{\"a}ngig vom Reifungszustand der DC. W{\"a}hrend unreife DC CCR5 exprimieren, verringert sich die Expression im Zuge der Ausreifung, w{\"a}hrend die Expression von CCR7 induziert wird. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die MV-Infektion einer DC-Kultur die Expression von CCR5 nicht beeinflusst, obwohl die Expression anderer charakteristischer Reifungsmarker erh{\"o}ht wird. Weiterhin konnte die Expression von CCR7 durch eine Infektion der DC-Kulturen mit MV nicht induziert werden. Die Ergebnisse der durchgef{\"u}hrten durchflusszytometrischen Analysen zur Rezeptorexpression wurden in Chemotaxis-Assays eingehender untersucht. DC aus MV-infizierten Kulturen zeigten trotz anhaltender CCR5-Expression nur eine geringe Migration in Richtung des CCR5-Liganden CCL-3. Aufgrund der fehlenden CCR7- Expression konnte erwartungsgem{\"a}ß keine Migration der eingesetzten DC gegen{\"u}ber dem CCR7-Liganden CCL-19 beobachtet werden. Weiterhin konnten Unterschiede im induzierten Chemokinmuster in MV-infizierten DCKulturen im Vergleich zu LPS-ausgereiften oder mit einer Mockpr{\"a}paration behandelten DC nachgewiesen werden. Kurz nach der Infektion konnte in MVinfizierten DC-Kulturen eine reduzierte Menge CXCL-8 und CCL-20 sowohl auf mRNA Ebene als auch auf Proteinebene detektiert werden. In weiteren Experimenten konnte eine verminderte Migration von T-Zellen auf Zusammenfassung 152 Zellkultur{\"u}berst{\"a}nde aus infizierten DC-Kulturen im Vergleich zu {\"U}berst{\"a}nden aus LPS-behandelten DC-Kulturen festgestellt werden. Im zweiten Teil der vorgelegten Arbeit konnte MV als Ligand f{\"u}r das DCspezifische Oberfl{\"a}chenmolek{\"u}l DC-SIGN (dendritic cell-specific intercellular adhesion molecule (ICAM)-3 grabbing non-integrin) identifiziert werden. Dabei konnte gezeigt werden, dass beide verwendeten Virusst{\"a}mme an DC-SIGN binden k{\"o}nnen, DC-SIGN jedoch keinen Eintrittsrezeptor f{\"u}r MV darstellt. Weitere Analysen zeigten, dass DC-SIGN die Infektion, besonders bei geringen Viruskonzentrationen, verst{\"a}rkt. In erster Linie zeigt die MV-Infektion unreifer DC die Bedeutung von DC-SIGN als Bindungsrezeptor f{\"u}r MV. Die hohe Expression von DC-SIGN auf unreifen DC erm{\"o}glicht eine effiziente effektive Infektion dieser Zellen. Auf reifen DC ist der Einfluss von DC-SIGN auf die Effektivit{\"a}t der Infektion der DC deutlich verringert. Im dritten Teil dieser Arbeit wurden die Kontaktzeiten zwischen DC und TZellen in dreidimensionalen Kollagenmatrices untersucht. Dabei wurde eine in etwa doppelt so lange Kontaktzeit zwischen MV-infizierten DC und durch Oxidative Mitogenese ver{\"a}nderten T-Zellen gegen{\"u}ber LPS-behandelten DC bzw. MV-infizierten und nicht-modifizierten T-Zellen festgestellt. In den parallel durchgef{\"u}hrten Proliferationstests wurde eine reduzierte Proliferation der TZellen beobachtet, die mit MV-infizierten DC kokultiviert wurden. Im Gegensatz zu den k{\"u}rzeren Kontakten zwischen LPS-behandelten DC und modifizierten TZellen waren die Kontakte zwischen MV-infizierten DC und modifizierten TZellen nicht-stimulatorisch.},
  subject      = {Dendritische Zelle},
  language  = {de}
}