@phdthesis{Link2007,
  author    = {Link, Stefanie},
  title     = {Molekulare Charakterisierung des Filament{\"o}sen H{\"a}magglutinins von Bordetella holmesii},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-23049},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2007},
  abstract  = {Zur Gattung Bordetella z{\"a}hlen derzeit neun verschiedene Arten Gram-negativer Bakterien. Der strikt humanpathogene Keim B. pertussis ist der Erreger des Keuchhustens und stellt das wohl wichtigste Mitglied der Gattung dar. B. holmesii geh{\"o}rt zu den sogenannten neuen Bordetella-Arten und wurde 1995 erstmals von Weyant et al. beschrieben. In den letzten Jahren gewann B. holmesii als humanpathogener Keim, der Keuchhusten-{\"a}hnliche Erkrankungen verursacht, zunehmend an Bedeutung. Mit Ausnahme des BvgAS-Systems (Gerlach et al., 2004) konnten in B. holmesii bislang keine f{\"u}r die „klassischen" Bordetella-Arten bekannten Virulenzfakoren nachgewiesen werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein zum Filament{\"o}sen H{\"a}magglutinin homologer Faktor in B. holmesii identifiziert. Der fhaB-Locus aus B. holmesii unterscheidet sich deutlich von dem der anderen Bordetella-Arten, da die fhaB-Sequenz in B. holmesii (fhaBBH) stromaufw{\"a}rts von einem putativen Membranprotein und stromabw{\"a}rts von einem IS1001-{\"a}hnlichen IS-Element flankiert wird. Sowohl auf DNA- als auch auf Proteinebene weist das fhaBBH-Gen die gr{\"o}ßte {\"A}hnlichkeit zu dem fhaB-Homolog aus B. avium auf, was die Vermutung best{\"a}rkt, dass B. holmesii phylogenetisch im Umfeld von B. avium anzusiedeln ist. Durch in silico-Analysen der FhaBBH-Aminos{\"a}uresequenz konnte eine N-terminale Signalpeptiddom{\"a}ne sowie eine TPS-Dom{\"a}ne identifiziert werden. Dies l{\"a}sst vermuten, dass FHABH an die bakterielle Oberfl{\"a}che transportiert und m{\"o}glicherweise sekretiert wird. Anhand von in silico-Analysen wurde zudem ein KGD-Motiv, nicht jedoch eine Heparinsulfat- und eine Kohlenhydratbindedom{\"a}ne im FhaBBH identifiziert. Das KGD-Motiv k{\"o}nnte das RGD-Motiv im FHA der „klassischen" Bordetella-Arten bei der Erkennung von Rezeptoren ersetzen. In Zellkultur-Experimenten konnte die Ad{\"a}sionsf{\"a}higkeit von B. holmesii G7702 an A549-Zellen nachgewiesen werden. Eine fhaB-Deletionsmutante des entsprechenden Stammes zeigte dagegen eine signifikant niedrigere Adh{\"a}sionsrate an die menschlichen Lungenepithelzellen. Somit konnte gezeigt werden, dass FHA in B. holmesii eine Rolle als Adh{\"a}sionsfaktor spielt. Die im Vergleich zum Wildtyp stark verringerte Adh{\"a}sionsrate der bvgA-Mutante von B. holmesii G7702 l{\"a}sst zudem auf die Beteiligung weiterer Adh{\"a}sionsfaktoren an der Wirtszelladh{\"a}sion in B. holmesii und deren Regulation durch das BvgAS-Systems schließen. Die Regulationsstudien haben gezeigt, dass die fhaB-Transkription in B. holmesii {\"u}ber zwei konstitutiv aktive Promotoren und einen bvg-abh{\"a}ngigen Promotor erfolgt. In vitro ist phosphoryliertes BvgABH in der Lage, spezifisch an die fhaB-upstream-Region aus B. holmesii zu binden. Innerhalb der fhaBBH-upstream-Region wurden drei putative BvgA-Bindestellen BS2-4 identifiziert, die {\"A}hnlichkeiten zu inverted repeat-Anordnungen der BvgA-Konsensussequenz 5'- T/A T T C C/T T A -3' aufweisen. Basierend auf den Ergebnissen der in vitro-Binde- und in vivo-Expressionsstudien zur Charakterisierung der einzelnen putativen BvgABH-Bindestellen wird ein Modell f{\"u}r die BvgABH-Bindung innerhalb des fhaB-Promotors in B. holmesii vorgeschlagen. Demnach wird zun{\"a}chst die prim{\"a}re BvgABH-Bindestelle BS2 mit der h{\"o}chsten Affinit{\"a}t von BvgABH-P gebunden, wobei f{\"u}r BvgABH-P eine Dimerisierung angenommen wird. Anschließend bindet ein zweites BvgABH-P-Dimer an die als sekund{\"a}re Bindestelle bezeichnete BS3-Region, die sich stromabw{\"a}rts von BS2 befindet. Eine m{\"o}glicherweise darauf folgende unspezifische Anlagerung von zwei weiteren BvgABH-P-Dimeren an den 37 bp großen DNA-Abschnitt zwischen BS2 und BS3 ist, ebenso wie die Besetzung der niedrigaffinen Bindestelle BS4 durch ein weiteres BvgABH-P-Dimer, haupts{\"a}chlich auf kooperative Protein-Protein-Wechselwirkungen zur{\"u}ckzuf{\"u}hren. Das an BS4 gebundene BvgABH-P-Dimer befindet sich am weitesten stromabw{\"a}rts und k{\"o}nnte zusammen mit der RNA-Polymerase die Initiation der Transkription gew{\"a}hrleisten. Ergebnisse aus den in vitro-Bindestudien sowie die unterschiedliche Zusammensetzung und Anordnung der putativen BvgA-Bindestellen der fhaB-Promotoren aus B. holmesii und B. pertussis deuten auf eine unterschiedliche Regulation dieser beiden Promotoren hin. So scheint der fhaB-Promotor aus B. holmesii, im Vergleich zum fhaB-Promotor aus B. pertussis, erst bei h{\"o}heren Konzentrationen an phosphoryliertem BvgA gebunden und somit aktiviert zu werden. In B. holmesii wird vermutlich die konstitutive FHA-Synthese nach BvgAS-Stimulation durch die bvg-abh{\"a}ngige fhaBBH-Expression unterst{\"u}tzt, um eine erfolgreiche Infektion des Wirtes zu gew{\"a}hrleisten.},
  subject      = {Bordetella},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Reidl2009,
  author    = {Reidl, Sebastian},
  title     = {Funktionale Charakterisierung an der Biofilmbildung beteiligter Faktoren pathogener und kommensaler Escherichia coli},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-35684},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2009},
  abstract  = {Multizellul{\"a}re Gemeinschaften in Form bakterieller Biofilme stellen aus medizinischer Sicht ein großes klinisches Problem dar. H{\"a}ufig lassen sich chronische oder rezidivierende Erkrankungen aber auch nosokomiale Infektionen auf die multizellul{\"a}re Lebensweise von humanpathogenen Erregern zur{\"u}ckf{\"u}hren. Sowohl fakultativ als auch obligat pathogene Escherichia coli-St{\"a}mme besitzen eine Vielzahl unterschiedlicher Faktoren, die die Biofilmbildung beeinflussen. Daran beteiligt sind unter anderem Flagellen, extrazellul{\"a}re polymere Substanzen, Adh{\"a}sine oder Oberfl{\"a}chen-assoziierte Proteine wie Autotransporter. Gegenstand der vorliegenden Arbeit ist die funktionale Charakterisierung des Proteins Antigen 43 (Ag43). Aufgrund seiner Autoaggregation-vermittelnden Eigenschaft tr{\"a}gt Ag43 ebenfalls zur Mikrokoloniebildung und Biofilmreifung bei. Antigen 43 ist ein Autotransporterprotein, welches innerhalb der Bakterienspezies Escherichia coli weit verbreitet ist. Interessanterweise besitzen viele E. coli-Isolate gleich mehrere identische oder {\"a}hnliche Kopien von agn43, die in der Regel von variablen Genombereichen (genomische Inseln, Plasmide) kodiert werden. Am Beispiel der Antigen 43-Varianten des uropathogenen Escherichia coli (UPEC)-Stammes 536 (O6:K15:H31), des kommensalen E. coli Isolats Nissle 1917 (O6:K5:H1) sowie des E. coli K-12-Laborstammes MG1655 (OR:H48:K-) ist die Bedeutung des Autotransporterproteins im Rahmen dieser Arbeit n{\"a}her untersucht worden. Hierf{\"u}r wurden die verschiedenen agn43-Allele in ein geeignetes Vektorsystem kloniert und im Adh{\"a}sin-freien Escherichia coli K-12-Stamm MG1655 \&\#916;fim\&\#916;flu exprimiert. Da Antigen 43 in Wildtypst{\"a}mmen posttranslational glykosyliert vorliegt, sind die Experimente zus{\"a}tzlich unter Einfluß der heterologen, AIDA I-spezifischen Heptosyltransferase Aah ('Autotransporter Adhesin Heptosyltransferase') durchgef{\"u}hrt worden. Anhand von Bindungsstudien (intermolekulare Autoaggregation, Zelladh{\"a}sionstests) wurde gezeigt, daß sich einzelne Ag43-Varianten teilweise in ihren Eigenschaften unterscheiden. Im direkten Vergleich mit AIDA-I ('Adhesin Involved in Diffuse Adherence') enteropathogener Escherichia coli (EPEC) konnte f{\"u}r Ag43 nur eine Funktion als schwaches Adh{\"a}sin nachgewiesen werden. Die heterologe O-Glykosylierung beeinflußte die Funktionalit{\"a}t des Antigen 43 in unterschiedlichem Ausmaß. Je nach Autotransporter-Variante f{\"u}hrte die Heptosylierung entweder zu signifikant reduzierten Affinit{\"a}ten, oder sie hatte keinen Effekt auf die Bindungskapazit{\"a}t des Ag43. Antigen 43 weist zudem strukturelle Homologien zu vergleichbaren Dom{\"a}nen anderer Autotransporter auf. F{\"u}r viele dieser Proteine konnte bereits eine adh{\"a}sive oder invasive Funktion nachgewiesen werden. Eine m{\"o}gliche Interaktion von Ag43 mit eukaryontischen Rezeptoren ist hingegen noch nicht bzw. nur unvollst{\"a}ndig untersucht worden. In Overlay assays und ELISAs wurde f{\"u}r Antigen 43 hier erstmals die spezifische Bindung an die extrazellul{\"a}ren Matrixkomponenten Kollagen und Laminin gezeigt. Zusammenfassend deuten die Ergebnisse dieser Arbeit darauf hin, daß das Escherichia coli spezifische Autotransporterprotein Antigen 43 nicht nur an der bakteriellen Biofilmbildung, sondern auch an der Besiedlung epithelialer Gewebe beteiligt sein kann. Seine Expression verschafft Bakterien einen Kolonisationsvorteil, der mit erh{\"o}hter Fitneß einhergeht. Die Aah-vermittelte O-Glykosylierung scheint f{\"u}r die Funktionalit{\"a}t von Ag43 nicht zwingend erforderlich zu sein. Des weiteren ist im Rahmen der vorliegenden Arbeit ein Testsystem entwickelt worden, das auf der Basis von Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierungen (FISH) die Differenzierung von verschiedenen (uro-)pathogenen Mikroorganismen erm{\"o}glicht. Das etablierte Protokoll eignet sich nicht nur f{\"u}r die diagnostische Erregeridentifizierung, sondern auch in Abh{\"a}ngigkeit des Probenmaterials zur Untersuchung von (Multispezies-)Biofilmen.},
  subject      = {Escherichia coli},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Schielke2010,
  author    = {Schielke, Stephanie},
  title     = {Functional and molecular characterization of FarR - a transcriptional regulator of the MarR family in Neisseria meningitidis},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-48550},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2010},
  abstract  = {Neisseria meningitidis is a facultatively pathogenic human commensal and strictly adapted to its niche within the human host, the nasopharynx. Not much is known about the regulatory processes required for adaptation to this environment. Therefore the role of the transcriptional regulator NMB1843, one of the two predicted regulators of the MarR family in the meningococcal genome, was investigated. As this gene displayed a high sequence homology to FarR, the Fatty acid resistance Regulator in N. gonorrhoeae, we designated the meningococcal protein FarR (NmFarR). Homology modeling of this protein revealed a dimeric structure with the characteristic winged helix-turn-helix DNA binding motif of the MarR family. NmFarR is highly conserved among meningococcal strains and expression of farR during exponential growth is controlled post-transcriptionally, being highest in the late exponential phase. By means of electrophoretic mobility shift assays (EMSAs) the direct and specific binding of FarR to the farAB promoter region was shown, comparable to its homologue in gonococci. As FarR is involved in fatty acid resistance in N. gonorrhoeae, susceptibility assays with the medium chain lauric acid (C12:0), the long chain saturated palmitic acid (C16:0) and the long chain unsaturated linoleic acid (C18:2) were performed, testing a wide variety of strains of both species. In contrast to the unusually susceptible gonococci, a high intrinsic fatty acid resistance was detected in almost all meningococcal isolates. The molecular basis for this intrinsic resistance in N. meningitidis was elucidated, showing that both a functional FarAB efflux pump system as well as an intact lipopolysaccharide (LPS) are responsible for palmitic acid resistance. However, even despite circumvention of the intrinsic resistance, FarR could not be connected with fatty acid resistance in meningococci. Instead, FarR was shown to directly and specifically repress expression of the Neisseria adhesin A (nadA), a promising vaccine candidate absent in N. gonorrhoeae. Microarray analyses verified these results and disclosed no further similarly regulated genes, rendering the FarR regulon the smallest regulon in meningococci reported until now. The exact FarR binding site within the nadA promoter region was identified as a 16 bp palindromic repeat and its influence on nadA transcription was proved by reporter gene fusion assays. This repression was also shown to be relevant for infection as farR deficient mutant strains displayed an increased attachment to epithelial cells. Furthermore, farR transcription was attested to be repressed upon contact with active complement components within human serum. Concluding, it is shown that FarR adopted a role in meningococcal host niche adaptation, holding the balance between immune evasion by repressing the highly antigenic nadA and host cell attachment via this same adhesin.},
  subject      = {Transkription <Genetik>},
  language  = {en}
}