@phdthesis{Sauer2001,
  author    = {Sauer, Christian},
  title     = {Untersuchungen zu den genetischen Ursachen heredit{\"a}rer Netzhautdegenerationen des Menschen},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-1936},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2001},
  abstract  = {Die Positionsklonierung hat sich als erfolgreiche Strategie zur Identifizierung und Isolierung von Genen erwiesen. Da ihre Anwendung im Allgemeinen keine Informationen {\"u}ber den zugrundeliegenden Pathomechanismus einer Erkrankung voraussetzt, eignen sich die Methoden der Positionsklonierung in besonderem Maße f{\"u}r die Erforschung heredit{\"a}rer Netzhauterkrankungen. Im Rahmen der hier vorliegenden Arbeit wurden sie zur Untersuchung ausgew{\"a}hlter retinaler Degenerationen eingesetzt. Dabei konnten wichtige Beitr{\"a}ge f{\"u}r die Aufkl{\"a}rung der genetische Ursachen dieser Erkrankungen geleistet werden. Die autosomal dominante North Carolina Makuladystrophie (NCMD) oder die zentral areol{\"a}re Pigmentepitheldystrophie (CAPED) sind allelische Erkrankungen mit allenfalls gering progredientem Verlauf. Ihr Genlokus liegt in einem etwa 7,2 cM großen Bereich auf 6q14-q16.2 zwischen den DNA-Markern D6S424 und D6S1671. Mit Hilfe von 21 polymorphen DNA-Markern welche den NCMD-Lokus (MCDR1) flankieren, wurden Kopplungsanalysen in drei deutschen NCMD-Familien durchgef{\"u}hrt. Die Analyse der krankheitsassoziierten Haplotypen erbrachte Hinweise auf einen gemeinsamen Vorfahren aller drei Familien. Dar{\"u}ber hinaus konnte der MCDR1-Lokus auf 3,2 cM eingeengt werden und wird von den Markern D6S249 und D6S475 flankiert. Dies bedeutet einen wichtigen Schritt auf dem Weg zur Klonierung des zugrundeliegenden Krankheitsgens. Eine h{\"a}ufige Ursache f{\"u}r den fr{\"u}hzeitigen Verlust der zentralen Sehsch{\"a}rfe bei Jungen ist die X-gebundene juvenile Retinoschisis (RS). Ihr Genlokus wurde in einen etwa 900 kb großen Bereich auf dem kurzen Arm des X-Chromosoms (Xp22.2) kartiert, wo er von den DNA-Markern DXS418 und DXS999/DXS7161 flankiert wird. Die Analyse von EST-Sequenzen aus dieser Region erm{\"o}glichte die Isolierung eines neuen retinaspezifischen Transkriptes, welches als RS1 bezeichnet wurde. Das RS1-Gen besteht aus sechs Exonen und codiert ein Protein, welches eine in der Evolution hoch konservierte Discoidin-Dom{\"a}ne enth{\"a}lt. Diese Dom{\"a}ne ist in anderen Proteinen u.a. an der Ausbildung von Zell-Zell-Interaktionen beteiligt. Mutationsanalysen in betroffenen Personen aus neun nicht-verwandten RS-Familien ergaben neun verschiedene Sequenzver{\"a}nderungen die mit dem Krankheitsbild der jeweiligen Familie segregierten. Einen ersten Einblick in die zeitliche und r{\"a}umliche Expression ergab die Untersuchung des murinen Orthologs Rs1h mit Hilfe von Northern Blot, RT-PCR und RNA in situ-Hybridisierungen. Rs1h wird in der Maus haupts{\"a}chlich in den Photorezeptoren exprimiert. Die Expression beginnt erst postnatal und ist mit der Entwicklung der Photorezeptoren korreliert. Das Auftreten zahlreicher weißlich-gelber Flecken, sogenannter Drusen, in radi{\"a}rer Anordung am hinteren Augenpol ist das charakteristische Merkmal einer Gruppe von Netzhauterkrankungen mit gemeinsamer {\"A}tiologie, die unter dem Begriffen Doynsche Honigwaben Dystrophie (DHRD), Malattia Leventinese (MLVT) oder radi{\"a}re Drusen zusammengefasst werden. Der Genlokus dieser Erkrankung wurde auf den kurzen Arm von Chromosom 2 in den Bereich 2p16 kartiert. Die Durchsuchung von EST-Datenbanken f{\"u}hrte zur Identifizierung des neuronal exprimerten Gens pNEU60. Dieses besteht aus zwei Exonen, wobei der vollst{\"a}ndige codierende Bereich im zweiten Exon liegt. Die Analyse des pNEU60-Proteins ergab eine Struktur aus sieben Transmembrandom{\"a}nen, dem gemeinsamen Merkmal G-Protein gekoppelter Rezeptoren, wie z.B. Rhodopsin. Patienten mit radi{\"a}ren Drusen zeigten keinerlei Sequenzver{\"a}nderungen in pNEU60. Die Untersuchung von fast 200 Patienten mit der ph{\"a}notypisch sehr {\"a}hnlichen altersbedingten Makuladegeneration (AMD), f{\"u}hrte zur Identifizierung von drei potentiellen Mutationen, darunter eine nonsense-Mutation, sowie zwei polymorphen Ver{\"a}nderungen. Die Assoziation einer einzigen missense-Mutation (R345W) im ubiquit{\"a}r exprimierten Gen EFEMP1 (EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein 1) mit der DHRD und MLVT wurde von einer amerikanischen Arbeitsgruppe nachgewiesen. Die R345W Mutation in diesem proximal zu pNEU60 liegenden Gen wurde in den zur Verf{\"u}gung stehenden zwei MLVT-Familien sowie einer DHRD-Familie nachgewiesen. Bei der Analyse von 14 Patienten mit sporadischen radi{\"a}ren Drusen konnte weder die R345W Mutation, noch irgendeine andere krankheitsassoziierte Mutation nachgewiesen werden. Es wurden jedoch drei polymorphe Sequenzvarianten, sowie zwei polymorphe Di- bzw. Trinukleotidsequenzen identifiziert. Die Klonierung des orthologen EFEMP1-Gens des Rinds diente als Voraussetzung zur Untersuchung der Interaktionsf{\"a}higkeit von EFEMP1 mit anderen Proteinen. Mit der Anwendung des Hefe Zwei-Hybrid Systems konnte gezeigt werden, dass die EGF-Dom{\"a}nen von EFEMP1 eine Interaktion mit sich selbst erm{\"o}glichen. Die Einf{\"u}hrung der R345W Mutation hatte dabei keinen Einfluss auf diese Wechselwirkungen. Die beschriebene Interaktion mit dem zur Familie der Ubiquiline geh{\"o}renden Protein DA41 konnte nicht reproduziert werden. Das Gen welches mit der inkompletten Form der X-gebundenen kongenitalen station{\"a}ren Nachtblindheit (CSNB2) assoziiert ist, codiert die a1-Untereinheit des retinaspezifischen spannungsabh{\"a}ngigen L-Typ Kalziumkanals (CACNA1F). Mit Hilfe von RT-PCR Analysen und RNA in situ-Hybridisierungen wurde die r{\"a}umliche Expression dieses Gens in der Netzhaut untersucht. Dabei wurde das CACNA1F-Transkript in der {\"a}ußeren und inneren K{\"o}rnerschicht, sowie in der Ganglienzellschicht nachgewiesen.},
  subject      = {Netzhautdegeneration},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Marquardt2001,
  author    = {Marquardt, Andreas},
  title     = {Positionsklonierung des Morbus Best-Gens VMD2},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-414},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2001},
  abstract  = {Die Dissertation beschreibt die Positionsklonierung von VMD2, einem Krankheitsgen des Menschen, dass der dominant vererbten vitelliformen Makuladystrophie Typ 2 (VMD2) zugrundeliegt. Zu diesem Zweck wurde zun{\"a}chst ein etwa 1.4 Mbp großer Klon-'Contig' aus artifiziellen Phagenchromosomen ('phage artificial chromosomes', PAC) erstellt, der die VMD2-Kandidatengenregion auf Chromosom 11q12-q13.1 physikalisch repr{\"a}sentiert. Durch die Identifizierung polymorpher (CA)n-Dinukleotidmarker aus dem kritschen Intervall und anschließender Kopplungsanalyse gelang es, die Kandidatengenregion auf ca. 500 kbp zu reduzieren. In der {\"o}ffentlichen Datenbank (GenBank) bereitgestellte Nukleins{\"a}uresequenzen zweier genomischer Klone aus dem Kern des relevanten chromosomalen Bereichs von zusammen etwa 290 kbp wurden dazu genutzt, {\"u}ber eine Kombination aus computergest{\"u}tzter Vorhersagen kodierender Sequenzen, Kartierung von EST-Klonen ('expressed sequence tags'), RT-PCR-Analysen und, wenn erforderlich, 5'-RACE-Experimenten, acht neue Gene des Menschen zu isolieren. Von den charakterisierten Genen erwiesen sich mehrere als potentielle Kandidaten f{\"u}r VMD2. Ein Gen, provisorisch als Transkriptionseinheit TU15B bezeichnet, konnte durch eine Mutationsanalyse schließlich eindeutig mit der Erkrankung assoziiert werden und wurde 1998 als VMD2 publiziert. Drei Gene aus der untersuchten Region kodieren Mitglieder einer Familie von Fetts{\"a}uredesaturasen (FADS1, FADS2 und FADS3), w{\"a}hrend ein anderes Gen ('Rabin3 interacting protein-like 1'; RAB3IL1) signifikante Sequenzidentit{\"a}t zu einem Transkript der Ratte besitzt, welches das GTPase-interagierende Protein Rabin3 kodiert. Den putativen Translationsprodukten drei weiterer Gene (C11orf9, C11orf10 und C11orf11) konnte bislang keine pr{\"a}zise Funktion zugeschrieben werden. Mit FTH1 ('ferritin heavy chain 1') und FEN1 ('flap endonuclease 1') liegen zudem zwei bekannte Gene im analysierten Intervall, deren cDNA-Sequenzen bereits 1984 bzw. 1995 von anderen Forschungsgruppen isoliert und publiziert wurden. Zweifellos kann die Region als sehr genreicher Abschnitt des menschlichen Genoms bezeichnet werden. Neben der Erstellung des PAC-'Contigs', der Einengung der VMD2-Kandidatenregion und der Klonierung von VMD2 war die vollst{\"a}ndige genetische Charakterisierung der genannten Fetts{\"a}uredesaturase-Gene ein weiterer Schwerpunkt der Arbeit. Unabh{\"a}ngig von der Klonierung und Charakterisierung des VMD2-Gens sowie der chromosomal eng benachbarten Gene, richtete sich mein Interesse schließlich noch auf drei Gene des Menschen, provisorisch als TU51, TU52 und TU53 bezeichnet, die gemeinsam mit VMD2 eine Genfamilie bilden und auf den Chromosomen 19p13.2-p13.12 (TU51), 12q14.2-q15 (TU52) und 1p32.3-p33 (TU53) lokalisiert werden konnten. Durch die Aufkl{\"a}rung der kodierenden Nukleins{\"a}uresequenzen der Gene wurden konservierte Sequenzabschnitte innerhalb der Genfamilie erkennbar, die auf wichtige funktionelle Abschnitte der Translationsprodukte schließen lassen.},
  subject      = {Makuladystrophie},
  language  = {de}
}