@phdthesis{Amschler2010,
  author    = {Amschler, Katharina},
  title     = {Sensibilisierung von Melanomzellen gegen{\"u}ber Zytostatika durch zwei verschiedene Mechanismen der NF-kB-Inhibition},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-56342},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2010},
  abstract  = {Die vorliegende Arbeit zeigt eine M{\"o}glichkeit auf, die bisher meist erfolglose Chemotherapie des malignen Melanoms zu verbessern: Durch Inhibition des Transkriptionsfaktors NF-kB, der f{\"u}r die Regulation vieler tumorrelevanter Gene verantwortlich ist, konnten die Tumorzellen gegen{\"u}ber der Wirkung von Zytostatika sensibilisiert werden. Zun{\"a}chst wurden acht verschiedene Melanomzellen in Bezug auf ihre NF-kB-Aktivit{\"a}t und der Expression NF-kB-regulierter Proteine vergleichen. Es konnte gezeigt werden, dass die Mehrzahl der Melanomzellen {\"u}ber konstitutive Aktivit{\"a}t von NF-κB verf{\"u}gt. Dabei bestand kein eindeutiger Zusammenhang zwischen der Expression NF-kB-regulierter Proteine und der Aktivit{\"a}t dieses Transkriptionsfaktors im Kern, was komplexe Regulationsmechanismen bei der Transkription und Translation vermuten l{\"a}sst. Anhand einer ausgew{\"a}hlten Melanomzelllinie konnte gezeigt werden, dass zwei verschiedene NF-kB-Inhibitoren, der Proteasom-Inhibitor Bortezomib und der neue IKK-Inhibitor KINK-1 die Aktivit{\"a}t von NF-kB deutlich hemmen. Beim Vergleich beider NF-kB-Inhibitoren ließen sich unerwartet verschiedene molekulare Wirkungsmechanismen nachweisen: W{\"a}hrend Bortezomib konzentrationsabh{\"a}ngig eine sehr starke Induktion von NOXA, eine Induktion von p53 sowie eine Abnahme von Cyclin D1 bewirkte, zeigte KINK-1 seine Effekte vor allem in der Reduktion von Chemokinen wie IL-8 und MCP-1. Passend zur Ver{\"a}nderung der Expression zellzyklus-relevanter Proteine hatte Bortezomib einen st{\"a}rkeren Effekt auf den Zellzyklus als KINK-1. Beide Inhibitoren wurden mit verschiedenen Zytostatika kombiniert und konnten einerseits die Apoptoseinduktion durch Zytostatika verst{\"a}rken und andererseits die durch Zytostatika reduzierte Invasion weiter reduzieren. Allerdings zeigte sich bei der Untersuchung tumorrelevanter Chemokine, dass KINK-1 im Gegensatz zu Bortezomib synergistische Effekte mit Camptothecin und Doxorubicin aufweist. Trotz molekularer Unterschiede bewirkten beide NF-kB-Inhibitoren vergleichbare funktionelle Effekte auf zellul{\"a}rer Ebene. Dies galt auch f{\"u}r ein pr{\"a}klinisches in-vivo-Modell, in dem die experimentelle Lungenmetastasierung von B16F10-Melanomzellen in M{\"a}usen ermittelt wurde: Hier wurden die M{\"a}use mit Camptothecin, KINK-1 und Bortezomib allein im Vergleich zu den jeweiligen Kombinationen aus Zytostatikum und NF-kB-Inhibitor behandelt. Beide Kombinationen zeigten eine signifikante Reduktion des Lungengewichts im Vergleich zu Camptothecin allein. Diese Arbeit konnte also den Nutzen aus NF-kB-Inhibition in Kombination mit Zytostatika f{\"u}r die hier verwendeten Substanzen bekr{\"a}ftigen und dabei einige molekulare Unterschiede aufdecken.},
  subject      = {Apoptosis},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Aumueller2014,
  author    = {Aum{\"u}ller, Ruth Inge},
  title     = {CD40-restringierte Aktivierung der TRAIL-Todesrezeptoren durch bifunktionelle rekombinante Proteine},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-106813},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2014},
  abstract  = {Der Ligand TRAIL wurde 1997 aufgrund seiner hohen Sequenzhomolgie ge-gen{\"u}ber dem TNFL CD95L entdeckt (28 \%). Allerdings besitzt TRAIL, anders als die Liganden CD95L und TNF, die bemerkenswerte Eigenschaft vor allem in ver{\"a}nderten Zellen Apoptose zu induzieren, w{\"a}hrend gesunde Zellen davor bewahrt werden. Die TRAIL-induzierte Apoptose wird durch die apoptoseinduzierenden Todesrezeptoren TRAILR1 und TRAILR2 vermittelt. Allerdings bindet und aktiviert l{\"o}sliches TRAIL haupts{\"a}chlich den Todesrezeptor TRAILR1, w{\"a}hrend membrangebundes TRAIL sowohl TRAILR1 als auch TRAILR2 gut aktiviert. In den letzten Jahren wurden verschiedene Methoden entwickelt, um die Bioaktivit{\"a}t l{\"o}slicher TNFL zu steigern. Hierzu z{\"a}hlen z.B.: Stabilisierung der trimeren Molek{\"u}lanordnung {\"u}ber die TNC-Dom{\"a}ne, Oligomerisierung des Flag-getaggten Liganden mithilfe des monoklonalen Antik{\"o}rpers M2, sowie Generierung einer artifiziellen, antigenabh{\"a}ngigen Membranst{\"a}ndigkeit. In dieser Arbeit wurde der Oberfl{\"a}chenrezeptor CD40 zur Immobilisierung des generierten Fusionsproteins scFv:CD40-Flag-TNC-TRAIL genutzt. In verschieden Experimenten konnten mit scFv:CD40-Flag-TNC-TRAIL in CD40-exprimierenden Zellen starke Apoptoseinduktion ermittelt werden. Charakteris-tische Kennzeichen und Spaltprodukte der Apoptose konnten ausschließlich in CD40-positiven Tumorzellen detektiert werden. Dabei wurde in allen Versuchen die f{\"u}r die Apoptoseinduktion ben{\"o}tigte Konzentration des Konstrukts mithilfe des Proteinsyntheseinhibitors CHX um das 10- bis 100-fache verringert. Es konnte auch gezeigt werden, dass in CD40-positiven Zellen, nach Stimulation mit scFv:CD40-Flag-TNC-TRAIL, nicht-apoptotische Signalwege verst{\"a}rkt aktiviert werden. Dies war auf die agonistische Aktivit{\"a}t des monoklonalen Antik{\"o}rperfragments scFv:CD40 zur{\"u}ckzuf{\"u}hren. Die Antik{\"o}rperdom{\"a}ne war folglich nicht nur zur effizienten Aktivierung der TRAIL-Todesrezeptoren mittels Immobilisierung f{\"a}hig, sondern konnte zus{\"a}tzlich zur Stimulation des Immunsystems genutzt werden. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass der l{\"o}sliche, schwach aktive Ligand TRAIL mittels Oberfl{\"a}chenimmobilisierung {\"u}ber Antigen-Antik{\"o}rper-Wechselwirkungen in einen hochaktiven Liganden mit lokal begrenzter Toxizit{\"a}t {\"u}berf{\"u}hrt werden kann. Mithilfe dieses Fusionsproteins ist es somit m{\"o}glich die selektive Toxizit{\"a}t von TRAIL durch Steigerung seiner Aktivit{\"a}t effizient zu nutzen. Zus{\"a}tzlich kann durch die Antigenbindung der Wirkungsbereich weiter eingegrenzt werden (CD40-positive Tumoren), wodurch unerw{\"u}nschte Nebenwirkungen reduziert oder sogar ausgeschaltet werden k{\"o}nnen. Das in Tumoren oft heruntergefahrene Immunsystem kann CD40-abh{\"a}ngig stimuliert werden, um somit auch Tumorzellen in apoptoseresistenten Stadien zu eliminieren. Basierend auf diesen Ergebnissen k{\"o}nnen in der Zukunft weitere Studien zur Therapie von TRAIL-resistenten, CD40-exprimierenden Tumoren fortgef{\"u}hrt werden.},
  subject      = {Tumor-Nekrose-Faktor / Rekombinantes Protein},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Bahlo2008,
  author    = {Bahlo, Angela},
  title     = {Immunisierungsstrategien gegen Prionenerkrankungen und Untersuchungen zur Prionen-induzierten Neurodegeneration},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-28443},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2008},
  abstract  = {Prionenerkrankungen oder Transmissible Spongiforme Enzephalopathien (TSEs) sind {\"u}bertragbare Krankheiten, zu denen die Creutzfeldt-Jakob-Krankheit (CJD) beim Menschen, Scrapie bei Schafen und die Bovine Spongiforme Enzephalopathie (BSE) bei Rindern geh{\"o}ren. Der infekti{\"o}se Erreger (PrPSc) besteht dabei aus einer abnormalen Form des zellul{\"a}ren Prion-Proteins (PrPC) und unterscheidet sich von dieser nur in der Proteinstruktur. Ein Hauptproblem bei der Entwicklung von aktiven Immunisierungsstrategien gegen Prionenerkrankungen besteht in der fehlenden Reaktion des Immunsystems auf das ubiquit{\"a}r exprimierte Selbst-Antigen PrPC, welche auf einer Immuntoleranz gegen das k{\"o}rpereigene Protein beruht. In dieser Arbeit wurde ein transgenes Mausmodell f{\"u}r aktive Immunisierungsexperimente verwendet. Diese transgenen Tiere exprimieren Hamster-PrPC (HaPrP) unter der Kontrolle des Neuronen-spezifischen Enolase-Promotors (NSE) ausschließlich im Nervensystem auf einem Prnpo/o-Hintergrund. Durch die Verwendung eines „artfremden" Proteins (rekombinantes Maus-PrP) gegen endogenes Hamster-PrP als Vakzine sollte die Immunogenit{\"a}t des Proteins verst{\"a}rkt werden. Zus{\"a}tzlich wurde f{\"u}r die Immunisierungen ein Fusionsprotein aus Maus-PrP und einem T-Helferepitop des Tetanustoxins (P30) eingesetzt. Als Adjuvanz diente das bakterielle DNA-Motiv CpG-1826, welches die F{\"a}higkeit besitzt T-und B-Lymphozyten direkt zu stimulieren und die Sekretion von Interleukinen zu induzieren. Die Immunisierungen erfolgten subkutan und wurden monatlich durchgef{\"u}hrt. Nach jedem Boost wurden die Blutseren auf Antik{\"o}rper sowohl gegen Maus-PrP als auch gegen Hamster-PrP untersucht. Neben der Analyse der humoralen Immunantwort mittels ELISA, Westernblot und FACS, wurden die Seren der immunisierten M{\"a}use auf ihre F{\"a}higkeit getestet, die Prionenreplikation in vitro zu inhibieren. Mit der gew{\"a}hlten Immunisierungsstrategie war es mit beiden Proteinen m{\"o}glich, hohe Antik{\"o}rperantworten sowohl gegen Maus- als auch gegen Hamster-Prion-Protein zu induzieren. In Zellkultur waren die Seren in der Lage, signifikant den PrPSc-Gehalt zu reduzieren. Die immunisierten M{\"a}use wurden mit Hamsterprionen infiziert, um den Einfluss der induzierten Antik{\"o}rper auf den Verlauf der Krankheit zu untersuchen. Nach Immunisierung mit PrP-P30 zeigten die M{\"a}use gegen{\"u}ber mit Ovalbumin-behandelten Kontrolltiere eine signifikant verl{\"a}ngerte Inkubationszeit von ca. 30\%. Im Gegensatz dazu konnte nach Immunisierung mit PrP ohne das zus{\"a}tzliche T-Helferepitop keine Verl{\"a}ngerung in den Inkubationszeiten beobachtet werden. Abschließend wurde die Immunantwort in den immunisierten Tieren auf zellul{\"a}rer Ebene mittels Proliferationsanalyse von T-und B-Lymphozyten untersucht. Daf{\"u}r wurden Lymphozyten aus Milz und Lymphknoten der immunisierten NSEHa-Prnpo/o_M{\"a}usen isoliert, ex vivo mit Maus-PrP bzw. Hamster-PrP stimuliert und auf die Proliferation von CD4-positiven oder CD8-positiven T-Lymphozyten untersucht. Durch die Analyse wurde gezeigt, dass es nach Immunisierung mit rek.PrP oder PrP-P30 zu keiner spezifischen Proliferation von T-Lymphozyten kam. Die beobachtete humorale Immunantwort scheint also unabh{\"a}ngig von einer spezifischen T-Zell-Immunantwort zu wirken. Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, dass es m{\"o}glich ist, durch die Wahl von geeigneten Immunisierungsstrategien, die Toleranz gegen das Selbstprotein PrP zu brechen. Sie stellen eine Grundlage f{\"u}r weitere Forschungsans{\"a}tze dar, um prophylaktische Immunisierungen gegen Prionenerkrankungen in Zukunft zu realisieren. In einem weiteren Teil der Arbeit wurde die Funktion der apoptotischen Faktoren BAX und BCL-2 in der Prionen-induzierten Neurodegeneration in vivo untersucht. Dazu wurde neuroektodermales Gewebe aus BAX-/- und BCL-2-/- -Embryonen in das Gehirn von PrP-Knockout-M{\"a}usen (Prnpo/o) transplantiert. Diese PrPC-defizienten Tiere sind nicht mit Prionen infizierbar und k{\"o}nnen PrPSc nicht propagieren. Nach Langzeitinfektion mit Mausprionen wurden die Transplantate histochemisch auf Prionenpathologie untersucht. Die typischen neuropathologischen Ver{\"a}nderungen waren dabei strikt auf das PrPC-positive Transplantat begrenzt. Zus{\"a}tzlich wurden die Transplantate auf apoptotische Ver{\"a}nderungen untersucht und dabei TUNEL-F{\"a}rbungen und aktivierte-Caspase-3 F{\"a}rbungen durchgef{\"u}hrt. Es zeigten sich hierbei hinsichtlich Auspr{\"a}gung und St{\"a}rke der Pathologie keine Unterschiede zwischen den BAX-bzw. BCL-2-Knockout Transplantaten und wildtypischen Transplantaten. Daraus konnte gefolgert werden, dass in diesem Modell weder BAX noch BCL-2 eine signifikante Rolle bei der Prionenpathogenese spielen. Die Ergebnisse aus diesem Teil der Arbeit leisten einen wichtigen Beitrag f{\"u}r das bessere Verst{\"a}ndnis der durch Prionen-induzierten Neurodegeneration und sind f{\"u}r die Entwicklung von potentiellen therapeutischen Strategien hilfreich.},
  subject      = {Impfung},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Blank2009,
  author    = {Blank, Marc},
  title     = {Mechanismen der Glukokortikoid-induzierten Apoptose in T-Zellen},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-41332},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2009},
  abstract  = {Glukokortikoide induzieren Apoptose in vielen verschiedenen Zelltypen. Wenngleich die Glukokortikoid-induzierte Apoptose eine der zuerst entdeckten Formen des Programmierten Zelltodes war, ist sie dennoch kaum verstanden und daher heute noch Teil vieler Forschungen. Eine Bcl-2 {\"U}berexpression resultiert in einer Resistenz gegen{\"u}ber GC- induzierter Apoptose in einer Reihe von Zellen wie einigen Lymphomzell-linien, aber auch normalen Thymozyten, sowie reifen T- und B-Zellen. Glukokortikoide k{\"o}nnen die Transkription der BH3-only Gene Bim (BCL-2-interacting mediator of cell death) und Puma (p53-upregulated modulator of apoptosis), einer proapoptotischen Untergruppe der Bcl-2 Familie, induzieren. Dies legt nahe, dass Bim und Puma am Weg der GC-induzierten Apoptose beteiligt sind. Ceramid ist in der Lage {\"u}ber die Aktivierung der proapoptotischen Bcl-2 Mitglieder Bax und Bak die {\"a}ußere Mitochondrienmembran zu sch{\"a}digen und damit zur Aktivierung von Caspasen zu f{\"u}hren. Verschiedene apoptotische Stimuli, wie z.B. Glukokortikoide, f{\"u}hren so {\"u}ber eine Erh{\"o}hung des endogenen Ceramid Levels zur Apoptose. Ceramid kann auf zwei verschiedenen Wegen gebildet werden: zum einen durch Hydrolyse von Sphingomyelin (katalysiert durch saure (a), oder neutrale (n) Sphingomyelinase (SMase)), zum anderen durch de novo Biosynthese. Studien an Thymozyten zeigen, dass von den beiden M{\"o}glichkeiten der Ceramidsynthese, lediglich die Inhibition der aSMase zu einer Resistenz gegen{\"u}ber GC-induzierter Apoptose f{\"u}hrt. Um nun die Rolle von Bim und der aSMase bei der Glukokortikoid-induzierten Apoptose zu untersuchen, wurde die murine T-Zelllymphomlinie WEHI7.15a zu Hilfe genommen. W{\"a}hrend die {\"U}berexpression retroviral eingebrachter shRNAs gegen Bim und aSMase keine Wirkung auf die Glukokortikoid-induzierte Apoptose zeigten, f{\"u}hrte der knockdown des Glukokortikoid-Rezeptors selbst zu einer Resistenz gegen{\"u}ber Dexamethason. Auch der pharmakologische Inhibitor der Sphingomyelin-Hydrolyse, Imipramin, zeigte sowohl in vitro, als auch in vivo keine Wirkung auf die Glukokortikoid-induzierte Apoptose. Dar{\"u}ber hinaus waren sowohl Thymozyten, als auch periphere T-Zellen von aSMase knockout M{\"a}usen genauso sensitiv auf die Glukokortikoid-induzierte Apoptose wie Wildtyp-Zellen. Die in vitro knockdown Ergebnisse von Bim und vom Glukokortikoid-Rezeptor selbst, konnten weiterhin ex vivo, durch das Einbringen der shRNAs in h{\"a}matopoetische Stammzellen, welche zur Rekonstitution bestrahlter M{\"a}use genutzt wurden, best{\"a}tigt werden. W{\"a}hrend der Bim knockdown keinerlei Einfluss auf die Glukokortikoid-induzierte Apoptose ex vivo zeigte, konnte die verminderte Expression des Glukokortikoid-Rezeptors den Zelltod verhindern. Im Gegensatz hierzu zeigten sowohl der GR knockdown, als auch der Bim knockdown im h{\"a}matopoetischen System einen Einfluss auf die Thymozytenentwicklung in vivo.},
  subject      = {Glucocorticosteroidrezeptor},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Cordes2007,
  author    = {Cordes, Tatjana},
  title     = {Bindungsverhalten der verschiedenen NFAT-Transkriptionsfaktoren an den nur77-Promotor und ihre Kooperationsf{\"a}higkeit mit MEF2D bei der Aktivierung des nur77-Promotors},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-25964},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2007},
  abstract  = {Sowohl NFAT- (Nukle{\"a}re Faktoren aktivierter T-Zellen) als auch MEF2- ('myosin-enhancer factor 2') Transkriptionsfaktoren spielen eine wichtige Rolle bei der Differenzierung, Proliferation oder Apoptose vieler eukaryotischer Zellen. Sie sind in einer Vielzahl von Zellen aktiv und k{\"o}nnen dort die Transkription ihrer Zielgene nach Stimulation der Zellen mit anschließendem Calcium-Einstrom aktivieren. Dabei kooperieren sie oft mit anderen Transkriptionsfaktoren. Kurz vor Beginn dieser Arbeit erschienen zwei Ver{\"o}ffentlichungen, die eine Kooperation von MEF2D mit NFATc2 bei der Aktivierung des nur77-Promotors, der bei der negativen Selektion von T-Zellen aktiv ist, beschrieben. Im Rahmen dieser Arbeit sollte nun das Bindungsverhalten verschiedener NFAT-Proteine an den nur77-Promotor und ihre Kooperationsf{\"a}higkeit mit MEF2D bei der Aktivierung des nur77- und anderer Promotoren untersucht werden. Es konnte gezeigt werden, dass verschiedene NFAT-Faktoren direkt an ein Oligonukleotid des nur77-Promotors (von Position -274 bis -247 bp reichend) binden. Diese Bindung wird zwar durch eine Bindung von MEF2-Faktoren an den Promotor unterst{\"u}tzt, ist jedoch nicht wesentlich beeintr{\"a}chtigt, wenn MEF2-Faktoren aufgrund von einer Mutation in ihrer Bindungssequenz nicht binden k{\"o}nnen. Dagegen f{\"u}hrt eine Mutation der NFAT-Bindungsstelle zu einer aufgehobenen Bindung von NFAT-Faktoren an den Promotor. Desweiteren zeigte sich, dass nicht nur endogenes NFATc2 sondern auch verschiedene NFATc1-Isoformen an den Promotor binden k{\"o}nnen. In ihrer F{\"a}higkeit mit MEF2D zu kooperieren, zeigte sich kein Unterschied zwischen den getesteten NFAT-Isoformen NFATc1/\&\#945;A, NFATc1/\&\#945;C oder NFATc2. So aktivierten in Transfektionsversuchen in Jurkat T-Zellen und 293 T-Zellen alle NFAT-Proteine die Luciferase-Reporter-Gen-Konstrukte gemeinsam mit MEF2D in etwa additiver Weise. Dies konnte an verschiedenen Luciferase-Reporter-Genen (nur77-gesteuert, hFasL-gesteuert und desmin-gesteuert) nachgewiesen werden, was auf eine m{\"o}gliche Kooperation der verschiedenen NFAT-Faktoren mit MEF2D (und evtl. auch anderen MEF2-Faktoren) nicht nur bei der Apoptose von T-Zellen sondern auch in anderen Zellen hinweist.},
  subject      = {Transkriptionsfaktor},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Effenberger2012,
  author    = {Effenberger, Madlen},
  title     = {Funktionelle Charakterisierung von YB-1 im Zytoplasma des Multiplen Myeloms},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-76816},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2012},
  abstract  = {Das Y-Box-bindende Protein 1 (YB-1) ist ein Vertreter der hochkonservierten Familie eukaryotischer K{\"a}lteschockproteine und ein DNA/RNA-bindendes Protein. In Abh{\"a}ngigkeit von seiner Lokalisation {\"u}bernimmt es Aufgaben bei der DNA-Transkription oder mRNA-Translation. YB-1 ist ein potentielles Onkogen beim Multiplen Myelom (MM), dass in prim{\"a}ren MM-Zellen exprimiert ist. F{\"u}r die funktionellen Untersuchungen von YB-1 in der vorliegenden Arbeit wurden humane Myelomzelllinien (HMZL) verwendet, die als in vitro Modell dieser malignen B Zell-Erkrankung dienen. Aufgrund der potentiellen Expression von YB-1 im Zellkern und/oder Zytoplasma von HMZL, wurde zun{\"a}chst die Lokalisation des Proteins bestimmt. Es konnte gezeigt werden, dass YB 1 in den HMZL ausschließlich im Zytoplasma lokalisiert ist. Eine Translokation von YB-1 in den Nukleus kann durch die Serin-Phosphorylierung (Aminos{\"a}ure 102) in der K{\"a}lteschockdom{\"a}ne induziert werden. Die analysierten Myelomzelllinien zeigen jedoch kein nukle{\"a}res YB 1 und keine S102-Phosphorylierung. Diese Ergebnisse st{\"u}tzen die These, dass die Regulation der mRNA-Translation im Zytoplasma die vorherrschende Funktion von YB-1 beim MM ist. YB-1 k{\"o}nnte {\"u}ber diesen Mechanismus seine anti-apoptotische Wirkung vermitteln und die MM-Zellen vor genotoxischem Stress sch{\"u}tzen. Um YB-1-regulierte mRNAs zu identifizieren wurden YB 1-Immunpr{\"a}zipitationen mit zwei HMZL, einer Maus-Plasmozytomzelllinie und einem prim{\"a}ren Maus-Plasmazelltumor durchgef{\"u}hrt. Zu den YB-1-gebundenen mRNAs geh{\"o}ren Translationsfaktoren und ribosomale Proteine, die eine starke Beteiligung von YB-1 beim RNA-Metabolismus best{\"a}tigen. In der vorliegenden Arbeit wurden spezifisch zwei mRNA-Kandidaten untersucht, die f{\"u}r den malignen Ph{\"a}notyp von MM-Zellen wichtig sein k{\"o}nnen: das translationell kontrollierte Tumorprotein TCTP und MYC. Sowohl TCTP als auch MYC wurden bereits in Zusammenhang mit der Proliferation und Apoptose-Resistenz von malignen Zellen beschrieben. Die immunhistochemische Untersuchung der Knochenmarkbiopsien von MM-Patienten ergab eine gute Ko-Expression von YB-1 und TCTP in intramedull{\"a}ren MM-Zellen, w{\"a}hrend MYC erst in extramedull{\"a}rem MM-Tumormaterial verst{\"a}rkt mit der hohen YB 1-Expression korreliert. Die funktionellen Analysen der Arbeit haben gezeigt, dass YB 1 f{\"u}r die Translation der TCTP- und MYC-mRNA essentiell ist. Es kontrolliert die Verteilung dieser mRNAs zwischen translationell aktiven und inaktiven messenger Ribonukleoprotein-Partikeln. Die shRNA-vermittelte Reduktion von YB-1 f{\"u}hrte zur Hemmung der TCTP- und MYC-Translation in der Phase der Initiation. Um den Einfluss der Kandidaten auf das {\"U}berleben der HMZL zu untersuchen, wurden proteinspezifische Knockdown-Experimente durchgef{\"u}hrt. Beim shRNA-vermittelten TCTP-Knockdown konnten keine Auswirkungen auf die Proliferation oder Viabilit{\"a}t von MM-Zellen beobachtet werden. Im Gegensatz dazu ist MYC f{\"u}r das {\"U}berleben und Wachstum der HMZL ausschlaggebend, denn der MYC-Knockdown induzierte Apoptose. Wie beim YB 1-Knockdown war ein Anstieg der Caspase-Aktivit{\"a}t und der Zusammenbruch des mitochondrialen Membranpotentials in den HMZL nachweisbar. Da es beim MYC-Knockdown gleichzeitig zur einer Reduktion der YB 1-Protein- und mRNA-Expression kam, wurde der Einfluss von MYC auf die Transkription des YB-1-Gens untersucht. Mit Hilfe von embryonalen Mausfibroblasten, die ein induzierbares MYC als Transgen besitzen, konnte gezeigt werden, dass die Aktivierung von MYC mit einer Zunahme der YB-1-mRNA einher geht. YB-1 ist somit ein direktes Zielgen des Transkriptionsfaktors MYC. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit haben zum ersten Mal ein gegenseitiges regulatorisches Netzwerk aufgezeigt, in dem YB 1 transkriptionell durch MYC reguliert wird und YB-1 f{\"u}r die Translation der MYC-mRNA essentiell ist. Die Ko-Expression beider Proteine tr{\"a}gt zum Wachstum und {\"U}berleben von malignen Plasmazellen bei.},
  subject      = {Plasmozytom},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Ehrenschwender2009,
  author    = {Ehrenschwender, Martin},
  title     = {Auswirkungen einer aktivierenden PIK3CA-Mutation auf die Signaltransduktion von FasL und TRAIL in kolorektalen Karzinomzellen},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-44377},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2009},
  abstract  = {Die Todesrezeptoren Fas, TRAILR1 und TRAILR2 werden seit einigen Jahren aufgrund ihrer F{\"a}higkeit, Apoptose zu induzieren, als therapeutisch interessantes Ziel bei der Therapie maligner Tumoren angesehen. Gleichzeitig werden immer mehr Entit{\"a}ten von Tumoren beschrieben, die eine Resistenz gegen die Todesrezeptor-induzierte Apoptose aufweisen. In dieser Konstellation k{\"o}nnen neben den blockierten proapoptotischen Signalen insbesondere auch Todesrezeptor-assoziierte, protumoral wirksame Signalwege sichtbar werden, die unter anderen Umst{\"a}nden durch die Apoptose maskiert werden. In dieser Arbeit wurde die von FasL- und TRAIL-induzierte Signaltransduktion in einer apoptoseresistenten Variante der kolorektalen Karzinomzelllinie HCT116 untersucht. Eine aktivierende Mutation des PIK3CA-Gens protektiert diese Zellen aufgrund der konstitutiven Aktivierung des onkogenen PI3K/Akt-Signalweges gegen{\"u}ber Todesrezeptor-vermittelter Apoptose. Durch Vergleich isogener Zelllinien, welche f{\"u}r den PIK3CA-Locus funktionell haploid waren und entweder ein Wildtyp oder ein mutiertes Allel trugen, konnte die Signaltransduktion von Fas und der TRAIL-Todesrezeptoren in apoptoseresistenten Tumorzellen, sowie deren Zusammenspiel mit dem PI3K/Akt-Signalweg im Detail untersucht werden. So wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass nach Stimulation der HCT116 PIK3CA-mut protektierten Zellen mit FasL oder TRAIL die initialen Schritte der Apoptoseinduktion durch Todesrezeptoren bis hin zur Bildung des DISC und der Aktivierung von Caspase-8 ungest{\"o}rt vonstatten gehen. Der durch die PIK3CA-Mutation induzierte Schutzmechanismus muss deshalb unterhalb dieser fr{\"u}hen apoptoseinduzierenden Ereignisse wirksam werden. Dar{\"u}ber hinaus zeigte sich, dass Todesliganden in HCT116 PIK3CA-mut Zellen den proinflammatorischen NF\&\#954;B-Signalweg aktivieren, wohingegen dieser Signalweg in HCT116 PIK3CA-wt Zellen durch die ablaufende Apoptose inhibiert wurde. W{\"a}hrend HCT116 PIK3CA-wt Zellen nach Stimulation von Fas oder den TRAIL-Todesrezeptoren morphologisch die klassischen Anzeichen des apoptotischen Zelltods zeigten, ver{\"a}nderten die HCT116 PIK3CA-mut protektierten Zellen ihre Morphologie von einer mesenchymal-l{\"a}nglichen hin zu einer am{\"o}boid-abgerundeten Form, die Zellen blieben jedoch vital. Die {\"A}nderung der Zellmorphologie konnte mit dem Vorhandensein enzymatisch aktiver Casapse-8 verkn{\"u}pft werden, generiert durch den Todesrezeptor-assoziierten DISC. Caspase-8 vermittelte die Reorganisation des Aktinzytoskeletts durch Spaltung und der damit einhergehenden Aktivierung von ROCK-1. Blockade der Caspase-8 Aktivierung in HCT116 PIK3CA-mut Zellen durch pharmakologische Inhibitoren oder ektope {\"U}berexpression von cFLIPS verhinderte entsprechend den FasL- oder TRAIL-induzierten {\"U}bergang zur am{\"o}boid-abgerundeten Zellform. Funktionell zeigten die am{\"o}boid-abgerundeten HCT116 PIK3CA-mut Zellen im Vergleich zu unstimulierten HCT116 PIK3CA-mut Zellen eine erh{\"o}hte Invasivit{\"a}t, was anhand erh{\"o}hter Spiegel an Urokinase im {\"U}berstand nachgewiesen werden konnte. Diese Arbeit beschreibt mit der Induktion einer am{\"o}boid-abgerundeten Zellmorphologie erstmals eine nicht-apoptotische Funktion von Caspase-8 im Kontext der Todesrezeptor-Signaltransduktion, die von der enzymatischen Aktivit{\"a}t abh{\"a}ngig ist. Weiterhin konnte ROCK-1 als Caspase-8 Substrat identifiziert werden. Ob durch die Aktivierung von ROCK-1 und die Reorganisation des Aktinzytoskeletts neben der Ausbildung einer am{\"o}boiden Zellmorphologie auch der am{\"o}boide Typ der Zellmigration in Gang gesetzt wird, m{\"u}ssen zuk{\"u}nftige Studien zeigen.},
  subject      = {Apoptosis},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Felcht2007,
  author    = {Felcht, Moritz},
  title     = {Todesrezeptor-vermittelte MAP-Kinasen-Aktivierung in Keratinozyten},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-24414},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2007},
  abstract  = {Die vorliegende Promotionsarbeit besch{\"a}ftigte sich mit der Frage, ob der Todesligand TRAIL in Keratinozyten eine Aktivierung verschiedener Mitogen-aktivierter Protein Kinasen (MAPK) induzieren kann und welche physiologische Relevanz diese TRAIL-induzierte MAPK-Aktivit{\"a}t hat. In unseren Analysen konnte nachgewiesen werden, dass TRAIL die MAPKERK1/2, MAPKJNK1/2 und MAPKp38 mit unterschiedlicher Kinetik aktivieren kann. Diese Aktivierung zeigte sich beeinflusst vom verwendeten Zelltyp, der Zeitdauer der Stimulation sowie dem Ausmaß der TRAIL-induzierten Caspase-Aktivit{\"a}t. Die TRAIL-vermittelte Aktivierung der MAPKERK1/2 beginnt sehr rasch und kann {\"u}ber einen l{\"a}ngeren Zeitraum detektiert werden, w{\"a}hrend die MAPKJNK erst sp{\"a}t aktiviert wird. Im Gegensatz dazu zeigt die MAPKp38 eine biphasische Aktivierung. Die TRAIL-induzierte Aktivierung der MAPK ist teilweise von aktiven Caspasen abh{\"a}ngig, denn eine Pr{\"a}inkubation mit dem pharmakologischen Caspase-Inhibitor zVAD-fmk hemmt sowohl die TRAIL-induzierte MAPKJNK- als auch die MAPKp38-Aktivit{\"a}t. Untersuchungen mit ektoper Expression des physiologischen Caspase-8 Inhibitors c-FLIPL konnten zeigen, dass cFLIPL nicht nur die Spaltung von Caspase-8, sondern auch die verz{\"o}gerte TRAIL-induzierte MAPKp38-Aktivit{\"a}t hemmen kann. In der vorliegenden Arbeit wurde außerdem nachgewiesen, dass TRAIL in Keratinozyten nicht nur Apoptose induziert, sondern auch an der Sekretion des proinflammatorischen Chemokins CXCL-8 beteiligt ist. Dabei war die MAPKp38, aber nicht die MAPKERK1/2 an der TRAIL-induzierten Sekretion von CXCL-8 beteiligt. Zuk{\"u}nftig werden weitere detailliertere Untersuchungen insbesondere zur physiologischen Bedeutung der TRAIL-induzierten MAPKJNK- und MAPKERK1/2-Aktivit{\"a}t erforderlich sein, f{\"u}r die diese Arbeit eine wichtige Grundlage gelegt hat.},
  subject      = {Interleukin 8},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Frebel2007,
  author    = {Frebel, Karin},
  title     = {Funktionelle Charakterisierung von Bag-1, dem Cochaperon von Hsp70, in der neuronalen Differenzierung und im neuronalen {\"U}berleben},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-24396},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2007},
  abstract  = {Bag-1 Defizienz in M{\"a}usen f{\"u}hrt in der embryonalen Entwicklung zu einem lethalen Ph{\"a}notyp mit schweren Defekten in Nervensystem und Leber. Neben der Expression der Inhibitor of Apoptosis Proteinen (IAP), ist ein Komplex aus Akt, Hsp70, Bag-1 und B-Raf f{\"u}r die Phosphorylierung eines spezifischen AS-Restes des pro-apoptotischen Proteins Bad f{\"u}r das {\"U}berleben wichtig (Gotz und Wiese et al., 2005). Das Ziel dieser Arbeit bestand darin, die Funktionen der Maus Bag-1 Isoformen in der neuronalen Entwicklung anhand von in vitro Modellen n{\"a}her zu charakterisieren. {\"U}berexpression von Bag-1S und Bag-1L in PC12 Zellen zeigte, dass Bag-1S im Zytoplasma und im Zellkern exprimiert wird, Bag-1L nur im Zellkern. Eine eingef{\"u}hrte Punktmutation, die die Interaktion mit Hsp70 verhindert, f{\"u}hrte zu einer zytoplasmatischen Expression von Bag-1Sm. Die Mutante Bag-1Lm blieb nukle{\"a}r lokalisiert. {\"U}berexpression von Bag-1S f{\"u}hrte zu einer Reduktion der Neuritenl{\"a}nge. Bag-1L und die mutanten Isoformen zeigten diesen Effekt nicht. Der inhibierende Einfluss von Bag-1S auf das Neuritenwachstum ist bislang spekulativ. Die Regulation erfolgt vermutlich {\"u}ber den Komplex Bag-1, Hsp70, Akt und B-Raf. Die Analyse von Bag-1 - /- Neuralen Stammzellen zeigte im Vergleich zu Bag-1 +/+ Neuralen Stammzellen eine erh{\"o}hte Apoptose. Wurde durch Vireninfektion Bag-1S oder Bag-1L zur{\"u}ck in die Zellen gebracht, waren diese wieder in der Lage zu {\"u}berleben. Die Mutanten zeigten diese Effekte nicht, so dass Hsp70 ein notwendiger Interaktionspartner f{\"u}r die {\"u}berlebensf{\"o}rdernde Wirkung von Bag-1 ist. Bag-1 -/- Neurale Stammzellen zeigten außerdem gliale Differenzierungsdefekte, die nicht durch eine R{\"u}ckf{\"u}hrung der Isoformen gerettet werden konnten. Zus{\"a}tzliche Experimente, die Neurale Stammzellen gezielt in die gliale Differenzierung durch Gabe von CNTF oder LIF leiten, zeigten, dass Bag-1 -/- Neurale Stammzellen durchaus in der Lage sind, gliale Zellen zu bilden. Bag-1 gilt auch als Modulator nukle{\"a}rer Rezeptoren, wie dem Glucocorticoid-Rezeptor (GR). Die Kotransfektion der Bag-1 Isoformen mit GR-GFP, zeigte {\"A}nderungen des Expressionsmusters bei Bag-1L und Bag-1Lm, jedoch nicht bei Bag-1S und Bag-1Sm. Die Etablierung einer Methode zur in vivo Analyse von Glucocorticoid-Signalwegen in der Neuroneogenese von adulten M{\"a}usen, war in ihren ersten Ans{\"a}tzen erfolgreich, so dass diese nach einigen Optimierungen f{\"u}r weitere Analysen genutzt werden kann.},
  subject      = {Apoptosis},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Gise2007,
  author    = {Gise, Alexander von},
  title     = {Suppression der Apoptose durch C-Raf erfordert MEK1 und Phosphatidylinositol 3-Kinase abh{\"a}ngige Signale},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-24947},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2007},
  abstract  = {Unterhalb des Interleukin 3 (Il-3) Rezeptors sind zwei Ras-abh{\"a}ngige Signalwege beschrieben, die entweder zur Aktivierung von C-Raf oder von PI3-Kinase (PI3K)/Proteinkinase B (PKB, AKT) f{\"u}hren und Wachstum und {\"U}berleben vermitteln. Fr{\"u}here Untersuchungen des Mechanismus, {\"u}ber den C-Raf Apoptose unterdr{\"u}ckt, zeigten die Notwendigkeit einer Anwesenheit der zytoplasmatischen Kinase an den Mitochondrien. Diese Translokation konnte entweder durch {\"U}berexpression des antiapoptotischen Proteins Bcl-2 oder aber durch Fusion der Kinase mit dem mitochondriellen Protein Mas p70 erreicht werden. Aktiviertes mitochondriell gebundenes C-Raf ist nicht in der Lage ERK1 und ERK2 zu aktivieren, vermag aber durch Inaktivierung des proapoptotischen Bcl-2 Familienmitgliedes BAD Apoptose zu unterdr{\"u}cken. Ungeachtet dieser Ergebnisse deuteten andere genetische und biochemische Untersuchungen auch auf eine Bedeutung der Raf Effektoren MEK und ERK in der Unterdr{\"u}ckung des programmierten Zelltodes hin. Im Rahmen dieser Arbeit wurde daher die Bedeutung von MEK und MEK-abh{\"a}ngigen Signalwegen f{\"u}r das zellul{\"a}res {\"U}berleben untersucht. Wir nutzten f{\"u}r diese Untersuchungen {\"u}berwiegend die Il-3 abh{\"a}ngige Zelllinie 23D. MEK war essentiell f{\"u}r das zellul{\"a}re {\"U}berleben und Wachstum nach Stimulation durch Il-3. Eine konstitutiv aktive MEK1 Mutante verz{\"o}gerte signifikant das Einsetzen der Apoptose nach Entzug des Wachstumsfaktors, w{\"a}hrend eine dominant negative Mutante den Zelltod akzelerierte. In der Fibroblastenzelllinie NIH 3T3 unterdr{\"u}ckte eine konstitutiv aktive Mutante von ERK2, {\"a}hnlich effektiv wie onkogenes MEK, durch Doxorubicin induzierten Zelltod. Diese Beobachtung l{\"a}sst auf einen, das {\"U}berleben der Zelle vermittelnden, Signalweg von MEK schließen, der zur Aktivierung von ERK f{\"u}hrt. Der protektive Effekt von aktiviertem MEK in 32D Zellen wurde durch MEK- und PI3K-abh{\"a}ngige Mechanismen vermittelt. Die dabei beobachtete Aktivierung von PI3K f{\"u}hrt zur Phosphorylierung und Aktivierung von AKT. Die Abh{\"a}ngigkeit von MEK und PI3K Signalwegen konnte auch f{\"u}r den Schutz von 32D Zellen vor Apoptose durch onkogenes C-Raf gezeigt werden. Diese Befunde ließen sich ebenso in der Il-3 abh{\"a}ngigen pro-B Zelllinie BaF3 verifizieren, was darauf schließen l{\"a}sst, dass die Rekrutierung von MEK/ERK im antiapoptotischen Signalweg von aktiviertem Raf ein allgemeing{\"u}ltiger Mechanismus ist. Dass in diesem antiapoptotischen Signalweg von C-Raf auch der PI3K Effektor AKT notwendig ist zeigten weitere Untersuchungen, in denen eine dominant negative Mutante von AKT den protektiven Effekt von aktiviertem C-Raf inhibierte, w{\"a}hrend eine konstitutiv aktive Form von AKT einen synergistischen Effekt mit C-Raf in der Unterdr{\"u}ckung der Apoptose hatte. Diese Daten zeigen einen, zellul{\"a}res {\"U}berleben vermittelnden Effekt von Raf, der durch MEK und AKT vermittelt wird.},
  subject      = {Apoptosis},
  language  = {de}
}