@phdthesis{Bersi2017, author = {Bersi, Heidi}, title = {Etablierung eines 3D in vitro Blutgef{\"a}ß-/Gewebemodells zur Testung spezifischer Therapeutika zur Leuk{\"a}miebehandlung}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-152506}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2017}, abstract = {In Deutschland erkranken j{\"a}hrlich etwa 500.000 Menschen an Krebs, wovon circa 12.000 die Diagnose „Leuk{\"a}mie" gestellt bekommen [1]. Unter den Leuk{\"a}mien weist die akute myeloische Leuk{\"a}mie (AML) die ung{\"u}nstigste Prognose auf, sodass hier erheblicher Forschungsbedarf besteht. Zus{\"a}tzlich schnitten viele potentielle Therapeutika, die sich in bisherigen pr{\"a}klinischen Testsystemen als vielversprechend erwiesen haben, in klinischen Studien schlecht ab [8]. Ziel dieser Arbeit war daher die Etablierung eines 3D in vitro Blutgef{\"a}ß-/Gewebemodells als verbessertes pr{\"a}klinisches System zur Testung von Therapeutika, die zur erfolgreichen Behandlung von Leuk{\"a}mien beitragen sollen. Das 3D Blutgef{\"a}ßmodell bestand aus humanen prim{\"a}ren Endothelzellen, welche als Monolayer auf der Serosaseite einer dezellularisierten, porzinen, intestinalen Kollagenmatrix (SIS-Ser) wuchsen. Nach 14-t{\"a}giger Zellkultur wurden dem Versuchsansatz entsprechend nichtadh{\"a}rente THP-1 Zellen (AML-M5-Zelllinie) und Tipifarnib oder entsprechende Kontrolll{\"o}sungen beziehungsweise bimolekulare Antik{\"o}rperkonstrukte mit PBMCs als Effektorzellen hinzupipettiert. Nach 5-t{\"a}giger Inkubation mit Tipifarnib beziehungsweise 24-st{\"u}ndiger Behandlung mit Antik{\"o}rperkonstrukten wurde der therapiebedingte Anstieg der Apoptoserate in den malignen THP-1 Zellen mittels durchflusszytometrischer Analyse der Modell{\"u}berst{\"a}nde ermittelt. Zum Ausschluss verbliebener und durchflusszytometrisch zu analysierender Zellen wurde, stellvertretend f{\"u}r alle Suspensionszellen, eine Anti-CD13/DAB-F{\"a}rbung durchgef{\"u}hrt, welche negativ ausfiel. M{\"o}gliche Kollateralsch{\"a}den am Endothel wurden mittels histologischen F{\"a}rbemethoden an Gewebeparaffinschnitten untersucht. In der Durchflusszytometrie zeigte Tipifarnib sowohl im 2D als auch im 3D Modell {\"a}quivalente, dosisabh{\"a}ngige und antileuk{\"a}mische Auswirkungen auf die THP-1 Zellen. Bei Applikation der Antik{\"o}rperkonstrukte ließ lediglich die Kombination beider Hemibodies signifikante Effekte auf die THP-1 Zellen erkennen. Dabei zeigten sich bei konstanten Konzentrationen der Antik{\"o}rperkonstrukte im 3D Modell deutlich h{\"o}here Apoptoseraten (58\%) als im 2D Modell (38\%). Stellt man Vergleiche von Tipifarnib mit den T-Zell-rekrutierenden Antik{\"o}rperkonstrukten an, so ließen sich im 2D Modell {\"a}hnliche Apoptoseraten in den THP-1 Zellen erzielen (jeweils 38\% bei Anwendung von 500 nM Tipifarnib). In den 3D Modellen erzielten jedoch die niedriger konzentrierten Antik{\"o}rperkonstrukte bei k{\"u}rzerer Inkubationsdauer eine noch h{\"o}here spezifische Apoptoserate in den THP-1 Zellen (im Mittel 58\%) als 500 nM Tipifarnib (mittlere Apoptoserate 40\%). Bez{\"u}glich der Nebenwirkungen ließ sich im 3D Modell nach Applikation von Antik{\"o}rperkonstrukten kein wesentlicher Einfluss auf das Endothel erkennen, w{\"a}hrend Tipifarnib/DMSO als auch die mit DMSO versetzten Kontrolll{\"o}sungen zu einer dosisabh{\"a}nigen Destruktion des urspr{\"u}nglichen Endothelzellmonolayers f{\"u}hrten. Damit stellt die hier beschriebene, hoch spezifische, Hemibody-vermittelte Immuntherapie einen vielversprechenden Ansatz f{\"u}r zuk{\"u}nftige onkologische Therapien dar. Mithilfe des etablierten humanen 3D in vitro Modells konnte im Vergleich zur konventionellen Zellkultur eine nat{\"u}rlichere Mikroumgebung f{\"u}r Zellen geschaffen und die Auswirkungen der Testsubstanzen sowohl auf maligne Zellen, als auch auf die Gef{\"a}ßstrukturen untersucht werden.}, subject = {Tissue Engineering}, language = {de} } @phdthesis{Dally2013, author = {Dally, Iris}, title = {Entwicklung eines bioartifiziellen Rekonstruktionsgewebes f{\"u}r die Luftr{\"o}hrenchirugie und Umsetzung in einen GMP-Prozess}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-98422}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2013}, abstract = {Das Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung eines vaskularisierten, autologen Implantats zur Behandlung von schweren Verletzungen der Trachea im Umfeld der guten Herstellungspraxis. Die Matrix besteht aus einem circa 14 cm langen St{\"u}ck porcinen, azellularisierten D{\"u}nndarm und BioVaSc (Biological Vascularized Scaffold) genannt wird. Dieses wird dann mit isolierten und kultivierten Zellen des Patienten besiedelt und reift f{\"u}r zwei Wochen in einem speziell hierf{\"u}r entwickelten Bioreaktorsystem. Danach erfolgt die Analyse bzw. die Implantation in den Patienten. Nach der Pr{\"a}paration und {\"U}berpr{\"u}fung der Qualit{\"a}t, erfolgte die Azellularisierung der BioVaSc zur Entfernung der porcinen Zellen und der enzymatische Abbau der DNS, unter Erhalt des nat{\"u}rlichen Gef{\"a}ßsystems. Hierf{\"u}r ist Natriumdesoxycholat verwendet worden, wobei R{\"u}ckst{\"a}nde davon das Ansiedeln der autologen Zellen negativ beeinflussen k{\"o}nnten. Deshalb wurde ein Test etabliert, mit dessen Hilfe, das Auswaschen der Azellularisierungsdetergenz bis zur Sterilisation nachweisbar war. Des Weiteren k{\"o}nnten in der BioVaSc nat{\"u}rlicherweise enthaltene Endotoxine Immunreaktionen im sp{\"a}teren Empf{\"a}nger ausl{\"o}sen. Die gesetzlichen Grenzwerte konnten durch Modifikationen des Protokolls, unter Ber{\"u}cksichtigung der guten Herstellungspraxis, erreicht werden. Weiterhin konnte histologisch eine weitgehende DNS- und Zellfreiheit nachgewiesen werden, in der quantitativen Analyse ergab sich eine Abreicherung von 97\% im Vergleich zum Ausgangsmaterial. Zur Bestimmung der funktionellen Stabilit{\"a}t der azellularisierten Matrix wurde die maximal tolerable Zugspannung bestimmt. Zur Besiedlung der Gef{\"a}ße der Matrix wurden mikrovaskul{\"a}re Endothelzellen und f{\"u}r das Lumen Fibroblasten und Skelettmuskelzellen verwendet. Die Protokolle zur Isolation und Kultur sind hierzu unter den Bedingungen der guten Herstellungspraxis etabliert, optimiert und mit, soweit m{\"o}glich, zertifizierten Reagenzien durchgef{\"u}hrt worden. Zur genauen Charakterisierung der Zellen wurden diese immunhistologisch {\"u}ber vier Passagen analysiert, wobei sich je nach Zelltyp und Differenzierungsstadium unterschiedliche Expressionsmuster ergaben. Zur Herstellung des autologen Implantats wurden zun{\"a}chst die mikrovaskul{\"a}ren Endothelzellen in das vorhandene Gef{\"a}ßsystem der BioVaSc eingebracht und dann f{\"u}r sieben Tage im etablierten Bioreaktorsystem kultiviert. Danach erfolgte die Besiedlung des Lumens mit Skelettmuskelzellen und Fibroblasten und die weitere siebent{\"a}gige Kultur im Bioreaktorsystem. Die Besiedlung des Gef{\"a}ßsystems musste optimiert werden, um sowohl die Besiedlungsdichte zu steigern als auch die Effizienz zu erh{\"o}hen. Das Lumen konnte mit der etablierten Methode vollst{\"a}ndig besiedelt werden. Nach vierzehnt{\"a}giger Kultur im Bioreaktorsystem erfolgte die Kontrolle der Zellvitalit{\"a}t, wobei sowohl in den Gef{\"a}ßstrukturen als auch im Lumen der BioVaSc vitale Zellen nachweisbar waren. Histologische Analysen zeigten, dass die mikrovaskul{\"a}ren Endothelzellen in den verbliebenen vaskul{\"a}ren Strukturen CD31 und den vWF exprimieren. Wohingegen die histologische Unterscheidung zwischen Fibroblasten und Skelettmuskelzellen nicht m{\"o}glich ist. Zus{\"a}tzlich wurde die BioVaSc mit upcyte mvEC der Firma Medicyte besiedelt. Nach der vierzehnt{\"a}gigen Kultur im Bioreaktorsystem waren die Zellen sowohl in den Gef{\"a}ßstrukturen als auch im Lumen und im Bindegewebe vital nachweisbar. In der histologischen Analyse konnte die Ausbildung von CD31, eNOS und vWF nachgewiesen werden. Des Weiteren wurde die Matrix mit mesenchymalen Stammzellen besiedelt, um zu analysieren, ob die Scherkr{\"a}fte die Ausbildung endothelialer Marker stimulieren k{\"o}nnen. Nach vierzehnt{\"a}giger Kultur konnte in den histologischen Analysen keine Ausbildung von CD31 oder dem vWF gefunden, allerdings vitale Zellen nachgewiesen werden.}, subject = {Regenerative Medizin}, language = {de} } @phdthesis{Dickhuth2013, author = {Dickhuth, Janike}, title = {Steigerung der Proliferationsf{\"a}higkeit prim{\"a}rer humaner Keratinozyten aus oraler Mukosa im Zellkultursystem durch Anreicherung von humanen epidermalen Stammzellen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-94084}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2013}, abstract = {Da Defekte im Bereich der oralen Schleimhaut infolge von Traumata, angeborenen sowie erworbenen Krankheiten die ungest{\"o}rte Funktionsweise in Bezug auf Atmung, Nahrungsaufnahme und Sprache des Menschen empfindlich beeintr{\"a}chtigen und ein ad{\"a}quater, alle Funktionen wiederherstellender Wundverschluss mit dem limitierten Eigengewebe oft nicht m{\"o}glich ist, bietet das Tissue Engineering durch die Entwicklung eines Haut{\"a}quivalents eine aussichtsreiche Alternative. Um eine ausreichende Menge an Zellen f{\"u}r die Herstellung eines autologen Transplantates in kurzer Zeit zur Verf{\"u}gung zu stellen, sollte in der vorliegenden Arbeit eine Methode zur Steigerung der Proliferationsf{\"a}higkeit prim{\"a}rer humaner Keratinozyten aus oraler Mukosa im Zellkultursystem etabliert werden. Dazu mussten zun{\"a}chst {\"u}ber die Explantation von Gewebeproben gesunder Patienten orale Schleimhautzellen gewonnen und die prim{\"a}ren Keratinozyten von den mitwachsenden Fibroblasten isoliert werden. Dies wurde durch chemische und mechanische Separationsmethoden erreicht. Die Kultivierung der exprimierten Zellen erfolgte unter st{\"a}ndiger Beobachtung und physiologischen Bedingungen {\"u}ber einen Zeitraum von mehreren Wochen. Nach Konfluenz der zweiten Passage wurden die Zellen geerntet und f{\"u}r die Versuche vorbereitet. Die Steigerung der Proliferationsf{\"a}higkeit der Keratinozyten sollte durch die Anreicherung epidermaler Stammzellen erreicht werden, da diese insbesondere durch ihre F{\"a}higkeit zur asymmetrischen Teilung die Grundlage f{\"u}r die Regeneration, Differenzierung und Hom{\"o}ostase des Gewebes bilden. Eine M{\"o}glichkeit zur Isolation von Zellen mit Stammzelleigenschaften stellt die Adh{\"a}sion an beschichteten Zellkulturgef{\"a}ßen dar. Die Affinit{\"a}t des haupts{\"a}chlich in Stammzellen vorkommenden ß1­-Integrin-Rezeptors zu Bestandteilen der Basalmembran wie Kollagen­-IV und Laminin sollte die Trennung hoch proliferativer Zellen von weniger teilungsaktiven Zellen leisten und das Protein indirekt als Marker f{\"u}r die Stammzellen fungieren. {\"U}ber die Adh{\"a}sion der Keratinozyten an mit den Komponenten Kollagen-IV und Laminin beschichteten Gef{\"a}ßen ließen sich zwei Zellpopulationen (adh{\"a}rente und nicht-adh{\"a}rente Zellen) gewinnen. Unabh{\"a}ngig von der verwendeten Adh{\"a}sionskomponente zeigten die Fraktionen den charakteristischen Wachstumsverlauf (lag­-Phase, log­- Phase, station{\"a}re Phase und Absterbephase) in vitro kultivierter Zellen, allerdings konnte kein signifikanter Unterschied in Bezug auf die Vitalit{\"a}t und die Proliferationskinetik der Keratinozyten festgestellt werden. Eine nach der geleisteten Auftrennung der Keratinozyten zwischengeschaltete Analyse und Identifikation von Stammzellen mittels ß1­-Integrin­-Marker (z.B. durch einen Immunfluoreszenztest) k{\"o}nnte kl{\"a}ren ob die adh{\"a}rente Population {\"u}berhaupt einen erh{\"o}hten Anteil an hoch proliferativen Keratinozyten beinhaltet oder ob die zahlreichen notwendigen, aber f{\"u}r die Zellen belastenden, Zwischenschritte der hier angewendeten indirekten Methode ausl{\"o}send f{\"u}r die geringen Unterschiede sind. In Anlehnung an die von Stein et al. erarbeiteten guten Ergebnisse bez{\"u}glich der Proliferationskapazit{\"a}t oraler Keratinozyten nach Adh{\"a}sion an Kollagen­-IV­-beschichteten Zellkulturgef{\"a}ßen wurde bei der vorliegenden Arbeit auf die aufw{\"a}ndige immunhistochemische Untersuchung verzichtet. Ein verst{\"a}rktes Wachstum der adh{\"a}renten Population konnte nur bei vereinzelten Proben festgestellt werden; insgesamt konnte die priorit{\"a}r gew{\"u}nschte Steigerung der Proliferation prim{\"a}rer humaner Keratinozyten im Zellkultursystem zur raschen Bereitstellung von Zellen f{\"u}r die Entwicklung eines autologen Mundschleimhaut-Transplantates nicht erreicht werden. Die drei angewandten Verfahren zur Erfassung der Quantit{\"a}t f{\"u}hrten hinsichtlich der Wachstumssteigerung zu {\"a}hnlichen Ergebnissen. Da sie aber zum einen durch das Wegfallen der f{\"u}r die Zellz{\"a}hlung und den WST-1-Test notwendigen Zwischenschritte eine non­-invasive (ohne mechanische Irritation und Interaktion mit Zusatzstoffen), d.h. f{\"u}r die Zellen schonende Methode darstellt und sich zum anderen die Ergebnisse der Real-Time-­Zellanalyse, im Gegensatz zur Endpunkt-­Messung, direkt auf die vorangegangenen Messungen beziehen, {\"u}berzeugte die Auswertung mittels Impedanzmessung in Genauigkeit und Darstellung der Ver{\"a}nderung des Zellwachstums {\"u}ber die Zeit.}, subject = {Tissue Engineering}, language = {de} } @phdthesis{Gastberger2024, author = {Gastberger, Katharina}, title = {Einfluss der perizellul{\"a}ren Matrix auf die Produktion extrazellul{\"a}rer Matrix von nativen porcinen Chondrozyten im 3D-Bioprinting in Agarose-Hydrogelen \(in\) \(vitro\)}, doi = {10.25972/OPUS-34716}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-347168}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2024}, abstract = {Chondrozyten stellen die zellul{\"a}re Komponente von hyalinem Knorpel dar, der die Gelenkfl{\"a}chen diarthrotischer Gelenke bedeckt. {\"U}ber die perizellul{\"a}re Matrix (PZM) sind sie mit der extrazellul{\"a}ren Matrix des Knorpelgewebes, die im Wesentlichen aus Wasser, Kollagen-Typ-II (Koll-II) und Glykosaminoglykan (GAG) gebildet wird, verbunden. Die PZM gilt als wichtiges modulatorisches und protektives Element in der Signal- und Mechanotransduktion sowie f{\"u}r die Hom{\"o}ostase innerhalb des Knorpelgewebes. Degenerative und inflammatorische Prozesse f{\"u}hren zu irreparablen Sch{\"a}den der Gewebearchitektur und -funktionalit{\"a}t. Die Regenerative Medizin strebt den Ersatz destruierter Gelenkfl{\"a}chen durch mittels Tissue Engineering hergestellten Neoknorpel an. 3D-Bioprinting gilt hier als attraktive Methode, nimmt jedoch {\"u}ber Scherkr{\"a}fte w{\"a}hrend des Druckvorgangs auch sch{\"a}digenden Einfluss auf das {\"U}berleben oder die Funktionalit{\"a}t der Zellen. Zielsetzung dieser Arbeit war es, den m{\"o}glichen protektiven Einfluss der PZM w{\"a}hrend des Druckvorgangs zu untersuchen. Aus porcinem Frischknorpel isolierte Chondrozyten wurden nach cast bzw. 3D-Bioprinting in Agarose-Biotinte hinsichtlich ihres {\"U}berlebens und ihrer Syntheseleistung von knorpelspezifischem Koll-II und GAG untersucht. Chondrozyten ohne PZM wurden mit Chondrozyten verglichen, die nach enzymatischer Isolation noch perizellul{\"a}r Kollagen-Typ-VI als Marker der PZM aufwiesen. Chondrozyten mit PZM zeigten allgemein eine st{\"a}rkere Produktion von Koll-II als Chondrozyten ohne PZM. Nach 3D-Bioprinting konnte f{\"u}r Chondrozyten ohne PZM eine signifikant geringere Produktion von GAG nachgewiesen werden als in der cast-Vergleichsgruppe, w{\"a}hrend dies f{\"u}r Chondrozyten mit PZM nicht gezeigt werden konnte. Der gezeigte protektive Einfluss der PZM gegen{\"u}ber Scherkr{\"a}ften w{\"a}hrend des Druckvorgangs er{\"o}ffnet neue Methoden f{\"u}r das Cartilage Tissue Engineering. Weitere Untersuchungen sind notwendig, um dies zu best{\"a}tigen und die Translation in die klinische Forschung erm{\"o}glichen.}, subject = {Hyaliner Knorpel}, language = {de} } @phdthesis{Goettlich2019, author = {G{\"o}ttlich, Claudia}, title = {Etablierung eines humanen 3D Lungentumor-Testsystems zur Analyse von Behandlungseffekten}, doi = {10.25972/OPUS-16413}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-164132}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2019}, abstract = {Lungenkrebs ist weltweit f{\"u}r die meisten krebsassoziierten Tode verantwortlich. Ursache daf{\"u}r ist unter anderem, dass viele Medikamente in der klinischen Anwendung, aufgrund nicht {\"u}bertragbarer Ergebnisse aus der Pr{\"a}klinik, scheitern. Zur Entwicklung neuer Therapiestrategien werden deshalb Modelle ben{\"o}tigt, welche die in vivo Situation besser widerspiegeln. Besonders wichtig ist es dabei, zu zeigen, f{\"u}r welche Fragestellungen ein neues Testsystem valide Ergebnisse liefert. In dieser Arbeit ist es mit Hilfe des Tissue Engineering gelungen, ein humanes 3D in vitro Lungentumor-Testsystem weiter zu entwickeln und f{\"u}r verschiedene Fragestellungen zu validieren. Zudem konnten sowohl f{\"u}r die Herstellung als auch f{\"u}r die Behandlung der Tumormodelle SOPs etabliert werden. Hier wurde zun{\"a}chst beobachtet, dass die Auswerteparameter f{\"u}r die Beurteilung von Behandlungseffekten eine geringe Varianz aufweisen und das 3D Modell deshalb als Testsystem geeignet ist. Ein Vergleich der Morphologie, des EMT-Status und der Differenzierung der Tumorzelllinien im 3D Modell mit Tumorbiopsaten von Adenokarzinompatienten verdeutlichte, dass die 3D Modelle tumorrelevante Merkmale besitzen. So sind die Zelllinien auf der biologischen Matrix, verglichen mit der jeweiligen 2D Kultur, durch eine reduzierte Proliferationsrate gekennzeichnet, welche eher der in vivo Situation entspricht. F{\"u}r die Etablierung und Validierung des 3D Modells als Testsystem war es notwendig, klinisch relevante Therapien in dem Modell anzuwenden und die Ergebnisse der Behandlung in vitro mit denen im Patienten zu vergleichen. Dabei konnte zun{\"a}chst best{\"a}tigt werden, dass eine zielgerichtete Therapie gegen den EGFR in dem 3D System zu einer verst{\"a}rkten Induktion der Apoptose im Vergleich zu 2D f{\"u}hrt. Dies entspricht klinischen Beobachtungen, bei denen EGFR-mutierte Patienten gut auf eine Therapie mit Tyrosin-Kinase-Inhibitoren (TKI) ansprechen. Anschließend wurde in dieser Arbeit erstmals in vitro gezeigt, dass die Behandlung mit einem HSP90-Inhibitor bei KRAS-Mutation wie in behandelten Patienten keine eindeutigen Vorteile bringt, diese jedoch in Experimenten der 2D Zellkultur mit den entsprechenden Zelllinien vorhergesagt werden. Die Ergebnisse aus dem in vitro Modell spiegeln damit verschiedene klinische Studien wider und unterstreichen das Potenzial des 3D Lungentumor-Testsystems die Wirkung zielgerichteter Therapien vorherzusagen. Durch die Messung von Signalwegsaktivierungen {\"u}ber Phospho-Arrays und Western Blot konnten in dieser Arbeit Unterschiede zwischen 2D und 3D nach Behandlung gezeigt werden. Diese lieferten die Grundlage f{\"u}r bioinformatische Vorhersagen f{\"u}r Medikamente. Mit fortschreitender Erkrankung und dem Entstehen invasiver Tumore, die m{\"o}glicherweise Metastasen bilden, verschlechtert sich die Prognose von Krebspatienten. Zudem entwickeln Patienten, die zun{\"a}chst auf eine Therapie mit TKI ansprechen, bereits nach kurzer Zeit Resistenzen, die ebenfalls zur Progression des Tumorwachstums f{\"u}hren. Zur Wirkungsuntersuchung von Substanzen in solchen fortgeschrittenen Erkrankungsstadien wurde das bestehende Testsystem erweitert. Zum einen wurde mit Hilfe des Wachstumsfaktors TGF-β1 eine EMT ausgel{\"o}st. Hier konnte beobachtet werden, dass sich die Expression verschiedener EMT- und invasionsassoziierter Gene und Proteine ver{\"a}nderte und die Zellen vor allem in dynamischer Kultur verst{\"a}rkt die Basalmembran der Matrix {\"u}berquerten. Zum anderen wurde die Ausbildung von Resistenzen gegen{\"u}ber TKI durch die Generierung von resistenten Subpopulationen aus einer urspr{\"u}nglich sensitiven Zelllinie und anschließender Kultivierung auf der Matrix abgebildet. Dabei zeigte sich keine der klinisch bekannten Mutationen als urs{\"a}chlich f{\"u}r die Resistenz, sodass weitere Mechanismen untersucht wurden. Hier konnten Ver{\"a}nderungen in der Signaltransduktion sowie der Expression EMT-assoziierter Proteine festgestellt werden. Im letzten Teil der Arbeit wurde eine neuartige Behandlung im Bereich der Immuntherapie erfolgreich in dem 3D Modell angewendet. Daf{\"u}r wurden T-Zellen, die einen chim{\"a}ren Antigen-Rezeptor (CAR) gegen ROR1 tragen, in statischer und dynamischer Kultur zu den Tumorzellen gegeben und der Therapieeffekt mittels histologischer F{\"a}rbung und der Bestimmung der Apoptose evaluiert. Zus{\"a}tzlich konnten Eigenschaften der T-Zellen, wie deren Proliferation sowie Zytokinaussch{\"u}ttung quantifiziert und damit eine spezifische Wirkung der CAR transduzierten T-Zellen gegen{\"u}ber Kontroll-T-Zellen nachgewiesen werden. Zusammenfassend ist es in dieser Arbeit gelungen, ein humanes 3D Lungentumor-Testsystem f{\"u}r die Anwendung in der pr{\"a}klinischen Entwicklung von Krebsmedikamenten sowie der Grundlagenforschung im Bereich der Tumorbiologie zu etablieren. Dieses Testsystem ist in der Lage relevante Daten zu Biomarker-geleiteten Therapien, zur Behandlung fortgeschrittener Tumorstadien und zur Verbesserung neuartiger Therapiestrategien zu liefern.}, subject = {Tissue Engineering}, language = {de} } @phdthesis{Hoppensack2013, author = {Hoppensack, Anke}, title = {Entwicklung eines humanen In-vitro-Modells des renalen proximalen Tubulus}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-81562}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2013}, abstract = {Die Epithelzellen des renalen proximalen Tubulus resorbieren große Mengen an Wasser, Glucose und weiteren wertvollen Substanzen aus dem Prim{\"a}rharn, um deren Ausscheidung zu verhindern. Weiterhin sekretieren sie harnpflichtige Substanzen in den Prim{\"a}rharn und sind in der Lage, in die Zelle aufgenommene Substanzen enzymatisch umzusetzen. Diese Funktionen machen den renalen proximalen Tubulus zu einer wichtigen Einheit f{\"u}r die Nie-renfunktion. Sie f{\"u}hren aber auch zu einer hohen Empfindlichkeit gegen{\"u}ber toxischen Effek-ten von Fremdstoffen. Daher ist ein In-vitro-Modell des renalen proximalen Tubulusepithels sowohl f{\"u}r die Erforschung physiologischer und pathologischer Mechanismen als auch zur Testung der Toxizit{\"a}t von Substanzen, insbesondere neuen Arzneimitteln, bedeutend. Ein weiteres Forschungsfeld, f{\"u}r das ein In-vitro-Gewebe von großem Nutzen w{\"a}re, ist die Ent-wicklung von bioartifiziellen Nierenersatzsystemen. Aufgrund Spezies-spezifischer Unterschiede, z.B. in der Expression von Transportproteinen und Enzymen, ist ein Modell mit humanen Zellen anzustreben. Bisher besteht jedoch ein Mangel an Modellen, die das renale proximale Tubulusepithel f{\"u}r die oben genannten An-wendungsbereiche ad{\"a}quat abbilden. Das Ziel dieser Arbeit war deshalb der Aufbau eines humanen In-vitro-Modells des renalen proximalen Tubulus unter Verwendung von humanen Nierenzellen (human kidney-derived cells, hKDCs), die Eigenschaften renaler Vorl{\"a}uferzellen aufweisen. In Kombination mit die-sen Zellen wurden verschiedene Kultursubstrate getestet. Dabei zeigte sich, dass die Zellen sowohl in Zellkulturplatten als auch auf Kollagen-Typ-I-beschichteten Insertmembranen mehrschichtig wachsen, ohne die typische Morphologie renaler proximaler Tubuluszellen auszubilden. In einem dreidimensionalen Kollagen-Typ-I-Hydrogel bildeten die hKDCs hin-gegen tubul{\"a}re bzw. zyst{\"a}re Strukturen mit einer kubischen bis hochprismatischen Morpho-logie. Da f{\"u}r die oben erw{\"a}hnten Anwendungsbereiche jedoch eine planare Zellschicht ben{\"o}-tigt wird, erfolgte die Testung weiterer biologischer Matrices. Diese waren die Small intestinal submucosa (SIS) und das Biological vascularized scaffold (BioVaSc). Beide ließen sich aus porcinem D{\"u}nndarm herstellen, wobei bei der SIS die Mucosa sowie das Mesenterium ent-fernt wurden. Bei der BioVaSc handelt es sich um ein Darmsegment mit erhaltenem Ge-f{\"a}ßsystem, dass zur Perfusion genutzt wird. Nach ihrer Kultur auf der SIS wiesen die hKDCs das typische Wachstum und die charakteris-tische Morphologie des renalen proximalen Tubulusepithels auf. Dazu geh{\"o}ren die Kontakt-hemmung, die das einschichtige Wachstum erm{\"o}glicht, die kubisch bis hochprismatische Morphologie sowie die Bildung eines B{\"u}rstensaums an der apikalen Zellmembran. Anhand einer Kollagen-Typ-IV- und einer Alcianblau-F{\"a}rbung ließ sich die Bildung einer Basalmemb-ran an der Grenze zur SIS nachweisen. B{\"u}rstensaum- und Basalmembranbildung zeigten die zellul{\"a}re Polarisierung. Weiterhin waren typische Markerproteine renaler proximaler Tu-buluszellen wie N-Cadherin und Aquaporin-1 immunhistochemisch, zum Teil deutlich st{\"a}rker als bei den Ausgangszellen, nachweisbar. Dies belegt einen positiven Einfluss der extrazellu-l{\"a}ren Matrixkomponenten der SIS auf die Ausbildung von Charakteristika des renalen proxi-malen Tubulusepithels. Die Albuminaufnahme als spezifische Funktion war ebenfalls nach-weisbar. Die molekularen Ver{\"a}nderungen der hKDCs w{\"a}hrend der Kultivierung auf der SIS ließen sich weiterhin mittels Raman-Spektroskopie best{\"a}tigen. Aufgrund der starken Interak-tion zwischen Tubulusepithel und umgebenden Kapillarnetzwerk wurde weiterhin die Co-Kultur mit Endothelzellen etabliert. F{\"u}r den Vergleich der hKDCs mit einer etablierten humanen Zelllinie renaler proximaler Tu-buluszellen wurde die HK-2-Zelllinie verwendet. Mit dieser Zelllinie ließen sich die Ergebnisse der hKDCs jedoch nicht reproduzieren, was auf die fehlende Sensitivit{\"a}t der transformierten Zelllinie auf die Substrateigenschaften zur{\"u}ckzuf{\"u}hren ist. In der dynamischen Kultur mit der BioVaSc als Matrix waren ein inhomogenes Wachstum sowie eine variierende Markerexpression zu beobachten. Die ließ sich vor allem auf den starken Einfluss der Aussaatdichte sowie die Festigkeit der Matrix zur{\"u}ckf{\"u}hren. Bei einer erfolgreichen Optimierung der Kultur kann dieses Modell jedoch f{\"u}r komplexere Studien in der pharmakologischen Entwicklung n{\"u}tzlich sein. Mit der Kombination aus hKDCs und SIS ist es gelungen, eine einzelne, durchg{\"a}ngige Zell-schicht zu generieren, die wichtige Charakteristika des renalen proximalen Tubulusepithels aufweist. Weitere Untersuchungen sind nun n{\"o}tig, um die Funktionalit{\"a}t des Modells weiter-gehend zu charakterisieren (z.B. der Transport von Substanzen und Sensitivit{\"a}t gegen{\"u}ber toxischen Substanzen). Anschließend kann es f{\"u}r die spezifischen Anwendungen weiterentwickelt werden.}, subject = {Niere}, language = {de} } @phdthesis{Kerscher2006, author = {Kerscher, Alexander Georg}, title = {Entwicklung einer mikroskopierbaren Perfusions-Kulturkammer f{\"u}r die Kultivierung, die In-Vitro-Vitalit{\"a}ts- und die Funktionsdiagnostik von endokrinen Zellen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-20282}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2006}, abstract = {Als Therapie des Diabetes mellitus Typ II stellt die Xenotransplantation von porzinen Langerhans-Inseln in mikroverkapselter Form eine attraktive Alternative zu den t{\"a}glichen Insulininjektionen dar. Kultivierung und Funktionsdiagnostik der isolierten porzinen Langerhans-Inseln sind technisch anspruchsvoll und bieten noch immer Potential f{\"u}r Verbesserungen. Werden die Zellen in Zellkulturflaschen {\"u}ber mehrere Tage kultiviert, sinkt die Vitalit{\"a}t unter ein akzeptables Niveau. Bei der Beurteilung der Vitalit{\"a}t und Funktion der Inseln gehen wertvolle Zellen f{\"u}r eine sp{\"a}tere Transplantation verloren. Dies schr{\"a}nkt eine ausgiebige Diagnostik vor der Transplantation ein. Ziel der Arbeit ist es, eine M{\"o}glichkeit zur Verbesserung der Kulturbedingungen zu finden und exakte Ergebnisse bei der Funktions- und Vitalit{\"a}tsdiagnostik ohne Verlust von Zellen zu erreichen. Vorversuche konnten beweisen, dass eine Verbesserung der Vitalit{\"a}t von Langerhans-Inseln in Kultur an der Methode der Kultivierung in Zellkulturflaschen scheitert. Stattdessen wurde das Prinzip der Perfusionskultur in spezialisierten Beh{\"a}ltnissen f{\"u}r die systematische Verbesserung der Kulturbedingungen und zur genaueren Diagnostik mittels Mikroskopie und Funktionsdiagnostik gew{\"a}hlt. Mit einem solchen System ist sowohl Kultivierung als auch Funktions- und Vitalit{\"a}tsdiagnostik in einem Beh{\"a}lter m{\"o}glich. Beim Prinzip der Perfusionskultur befindet sich das Medium stets in Bewegung um die Zellen und Gewebe und sorgt so f{\"u}r einen kontinuierlichen Zustrom exakt definierten Mediums und permanenten Abtransport der Stoffwechselprodukte. Im Rahmen dieser Arbeit wurde f{\"u}r die Anforderungen im eigenen Labor ein maßgeschneidertes System mit mehreren Versionen von Beh{\"a}ltnissen f{\"u}r Perfusionskulturen entwickelt, deren jeweils neuere Version auf den Erfahrungen mit den Vorversionen aufbaut. In die Entwicklung fließen ebenso umfangreiche theoretische {\"U}berlegungen ein, sowie systematische Tests zu den physikalischen Eigenschaften der Beh{\"a}ltnisse. Die zuletzt entwickelte ist die Version V6SMTE, die in der Arbeit „W{\"u}rzburger Kammer" genannt wird. Dieser Beh{\"a}lter ist aus Edelstahl, mit einem Deckglas zur makro- und mikroskopischen Begutachtung, Zu- und Abl{\"a}ufen und einem Anschluss zum Entfernen von Gasblasen. Im Inneren befindet sich ein Einsatz, der eine stufenlose Regulierung des Volumens um die Zellen erm{\"o}glicht, so dass f{\"u}r Kultur und Funktionspr{\"u}fung bzw. Mikroskopie jeweils optimale Bedingungen erreicht werden. Weiterhin kann {\"u}ber einen Temperatursensor die Temperatur im Inneren des Beh{\"a}lters gemessen und {\"u}ber Heizelemente an der Außenwand computergesteuert reguliert werden. Die Zellen und Gewebe k{\"o}nnen auf unterschiedlichen Tr{\"a}germaterialien eingesetzt werden. W{\"a}hrend der Kultur kann ein Deckel ge{\"o}ffnet und die Zellen manipuliert werden. Das System ist unabh{\"a}ngig vom Brutschrank, ist sterilisierbar und wieder verwendbar. Kultiviert wurde endokrines Gewebe (isolierte Langerhans-Inseln, humanes Nebenschilddr{\"u}sengewebe). Dieses wurde zur Funktionspr{\"u}fung mit verschiedenen Mediatoren stimuliert, das Medium fraktioniert aufgefangen und sein Hormongehalt mit ELISA oder RIA bestimmt. Die Zellen wurden nativ und mit Fluoreszenzfarbstoffen (FDA, PI) gef{\"a}rbt mit bis zu 400facher Vergr{\"o}ßerung unter dem Auflichtmikroskop beurteilt. Im Zuge der Auswertung der anfallenden Proben auf ihren Insulingehalt wurde f{\"u}r diese Arbeit ein Insulin-ELISA entwickelt, der bei vergleichbarer Genauigkeit deutlich g{\"u}nstiger ist, als der bisher verwendete kommerzielle ELISA. Mit der W{\"u}rzburger Kammer kultivierte Langerhans-Inseln zeigten eine vergleichbare Vitalit{\"a}t im Vergleich zur Zellkulturflasche, die mit der W{\"u}rzburger Kammer gewonnenen Perifusionskurven sind in hohem Maß reproduzierbar, Zusammenh{\"a}nge von H{\"o}he der Glukoseexposition und Kultivierungsdauer mit der Insulinaussch{\"u}ttungskurve konnten eindrucksvoll beschrieben werden. Erstmals wurde auch im eigenen Labor die aus der Literatur bekannte paradoxe Insulinaussch{\"u}ttung beschrieben. Beispielhaft f{\"u}r andere endokrine Gewebe wurde humanes Nebenschilddr{\"u}sengewebe erfolgreich in der W{\"u}rzburger Kammer kultiviert und Vitalit{\"a}ts- und Funktionsdiagnostik unterzogen. Das Kultursystem erm{\"o}glicht die Kultivierung und eine komplette Analyse von Funktion, Vitalit{\"a}t und Morphologie von endokrinen Zellen. Es kann somit in idealer Weise zur Verbesserung der Kulturbedingungen und zur Beurteilung von endokrinen Zellen vor der Transplantation herangezogen werden.}, language = {de} } @phdthesis{Klug2016, author = {Klug, Alexander}, title = {Biomechanische und zellbiologische Untersuchung zu augmentierten Biomaterial-basierten Kreuzbandkonstrukten}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-142379}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2016}, abstract = {Aktueller Goldstandard bei der Rekonstruktion des ACL des Menschen sind au-tologe Transplantate. Diese sind allerdings je nach Entnahmeort mit einer mehr oder weniger hohen Entnahmemorbidit{\"a}t und dem Risiko f{\"u}r Folgeerkrankungen verbunden. Um dies zu umgehen, wurde ein xenogenes Kollagenimplantat aus Kollagen-I-Fasern von Ratten entwickelt und das native Konstrukt bereits in einer Vorl{\"a}uferstudie getestet. Im Rahmen dieser Arbeit wurden diese Kreuzbandkonstrukte mit Hilfe diverser Crosslinker modifiziert und hinsichtlich ihrer Biomechanik, Biokompatibilit{\"a}t und ihres in-vivo Verhaltens untersucht. Bewusst wurde dabei auf die Zellbesiedlung dieser Konstrukte verzichtet, da un-ter Ber{\"u}cksichtigung wirtschaftlicher Gesichtspunkte eines sp{\"a}teren humanen Einsatzes hierf{\"u}r eine Arzneimittelzulassung notwendig gewesen w{\"a}re. Mit Hilfe der Crosslinker wurde versucht, die mechanische Stabilit{\"a}t sowie die Resistenz gegen kollagenabbauende Enzyme der Synovia zu erh{\"o}hen, um die Gefahr post-operativer Instabilit{\"a}ten zu verringern. Dabei sollten Fragen bez{\"u}glich Immun-antwort, Biokompatibilit{\"a}t sowie Biodegradierbarkeit genau ber{\"u}cksichtigt wer-den. Als Crosslinker wurden f{\"u}r einen Vergleich in vitro neben 0,5 \% Genipin auch 10 \% HMDI sowie Glukose und EDC/NHS herangezogen. Dabei zeigten die Genipin-gecrosslinkten Einzelfasern die gr{\"o}ßte Reißfestigkeits-zunahme, wohingegen auf Minikonstruktbasis 10 \% HMDI zu den h{\"o}chsten UTS-Werten f{\"u}hrte. Ebenso ließen sich bez{\"u}glich der Biokompatibilut{\"a}t in vitro bei den Crosslinkern 0,5 \% Genipin und 10 \% HMDI Vorteile gegen{\"u}ber den beiden an-deren erkennen. Schließlich erfolgte im Rahmen eines Tierversuchs an 16 Minipigs der Einbau von 0,5 \% Genipin-gecrosslinkten Konstrukten als Kreuzbandersatz und an-schließend die biomechanische Testung sowie nach Paraffineinbettung auch eine durchlichtmikrokopische deskriptive Auswertung der Transplantate. W{\"a}hrend nach 6 Wochen eine deutliche Reißfestigkeitsabnahme zu verzeichnen war, erreichte diese nach 6 Monaten wieder fast 60 \% ihrer urspr{\"u}nglichen UTS. Somit konnte ein Remodeling des eingesetzten Implantats angenommen wer-den. Dies best{\"a}tigte sich in der durchgef{\"u}hrten histologischen Untersuchung. Hier war das Implantat deutlich vaskularisiert, von zahlreichen Fibroblasten durchsetzt und wies eine synoviale Deckschicht auf. Allerdings scheint vor allem wegen der Schw{\"a}che der Konstrukte nach 6 Wochen sowie den vermutlich auf-grund des Crosslinkers auftretenden Reaktionserscheinungen innerhalb des Kniegelenks ein Einsatz im humanen Bereich zum gegenw{\"a}rtigen Zeitpunkt noch nicht ausgereift. Dennoch l{\"a}sst sich gerade anhand des stattfindenden Remodelings das große Potential kollagenbasierter Materialien f{\"u}r den Kreuzbandersatz erkennen. Eine weitere Optimierung des bestehenden Konstrukts sollte deshalb forciert werden.}, subject = {Tissue Engineering}, language = {de} } @phdthesis{Kreutner2018, author = {Kreutner, Jakob}, title = {Charakterisierung des Knochens und seiner Mikrostruktur mit hochaufl{\"o}sender 3D-MRT}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-168858}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2018}, abstract = {Neue Therapieans{\"a}tze durch Tissue Engineering erfordern gleichzeitig angepasste Diagnosem{\"o}glichkeiten und nicht-invasive Erfolgskontrollen. Speziell die 3D-MR-Bildgebung ist ein vielversprechendes Instrument, um Parameter mit hoher r{\"a}umlicher Pr{\"a}zision zu quantifizieren. Vor diesem Hintergrund wurden im Rahmen dieser Arbeit neue Ans{\"a}tze f{\"u}r die hochaufl{\"o}sende 3D-MRT in vivo entwickelt und deren Eignung im Bereich des Tissue Engineerings gezeigt. Welchen Vorteil die Quantifizierung von Parametern bietet, konnte im Rahmen einer pr{\"a}-klinischen Studie an einem Modell der H{\"u}ftkopfnekrose gezeigt werden. Der Therapieverlauf wurde zu verschiedenen Zeitpunkten kontrolliert. Trotz der niedrigen r{\"a}umlichen Aufl{\"o}sung, konnten durch eine systematische Auswertung der Signalintensit{\"a}ten von T1- und T2-FS-gewichteten Aufnahmen R{\"u}ckschl{\"u}sse {\"u}ber Ver{\"a}nderungen in der Mikrostruktur gezogen werden, die dar{\"u}ber hinaus in guter {\"U}bereinstimmung mit Ergebnissen von ex vivo µCT-Aufnahmen waren. Dort konnte eine Verdickung der Trabekelstruktur nachgewiesen werden, welche sehr gut mit einer Signalabnahme in den T1-gewichteten Aufnahmen korrelierte. Die radiale Auswertung der Daten erlaubte dabei eine komprimierte Darstellung der Ergebnisse. Dadurch wurde eine effiziente Auswertung der umfangreichen Daten (verschiedene Tiere an mehreren Zeitpunkten mit einer Vielzahl an Einzelaufnahmen) erm{\"o}glicht und eine unabh{\"a}ngige Bewertung erreicht. Um die Limitationen der begrenzten Aufl{\"o}sung von 2D-Multi-Schichtaufnahmen aufzuheben, wurden neue Ans{\"a}tze f{\"u}r eine hochaufgel{\"o}ste 3D-Aufnahme entwickelt. Hierf{\"u}r wurden Spin-Echo-basierte Sequenzen gew{\"a}hlt, da diese eine genauere Abbildung der Knochenmikrostruktur erlauben als Gradienten-Echo-basierte Methoden. Zum einen wurde eine eigene 3D-FLASE-Sequenz entwickelt und zum anderen eine modifizierte 3D-TSE-Sequenz. Damit an Patienten Aufnahmen bei klinischer Feldst{\"a}rke von 1,5 T mit einer hohen r{\"a}umlichen Aufl{\"o}sung innerhalb einer vertretbaren Zeit erzielt werden k{\"o}nnen, muss eine schnelle und signalstarke Sequenz verwendet werden. Eine theoretische Betrachtung bescheinigte der TSE-Sequenz eine um 25 \% h{\"o}here Signaleffizienz verglichen mit einer FLASE-Sequenz mit identischer Messzeit. Dieser Unterschied konnte auch im Experiment nachgewiesen werden. Ein in vivo Vergleich der beiden Sequenzen am Schienbein zeigte eine vergleichbare Darstellung der Spongiosa mit einer Aufl{\"o}sung von 160 × 160 × 400 µm. F{\"u}r die Bildgebung des H{\"u}ftkopfs mit der neuen Sequenz waren jedoch aufgrund der unterschiedlichen Anatomie weitere Modifikationen notwendig. Um l{\"a}ngere Messzeiten durch ein unn{\"o}tig großes Field-of-View zu vermeiden, mussten Einfaltungsartefakte unterdr{\"u}ckt werden. Dies wurde durch die orthogonale Anwendung der Anregungs- und Refokussierungspulse in der TSE-Sequenz effizient gel{\"o}st. Technisch bedingt konnte jedoch nicht eine vergleichbare Aufl{\"o}sung wie am Schienbein realisiert werden. Der Vorteil der 3D-Bildgebung, dass Schichtdicken von deutlich weniger als 1 mm erreicht werden k{\"o}nnen, konnte jedoch erfolgreich auf den Unterkiefer {\"u}bertragen werden. Der dort verlaufende Nervus Mandibularis ist dabei eine wichtige Struktur, deren Verlauf im Vorfeld von verschiedenen operativen Eingriffen bekannt sein muss. Er ist durch eine d{\"u}nne kn{\"o}cherne Wand vom umgebenden Gewebe getrennt. Im Vergleich mit einer 3D-VIBE-Sequenz zeigte die entwickelte 3D-TSE-Sequenz mit integrierter Unterdr{\"u}ckung von Einfaltungsartefakten eine {\"a}hnlich gute Lokalisierung des Nervenkanals {\"u}ber die gesamte L{\"a}nge der Struktur. Dies konnte in einer Studie an gesunden Probanden mit verschiedenen Beobachtern nachgewiesen werden. Durch die neue Aufnahmetechnik konnte dar{\"u}ber hinaus die Aufl{\"o}sung im Vergleich zu bisherigen Studien deutlich erh{\"o}ht werden, was insgesamt eine pr{\"a}zisere Lokalisierung des Nervenkanals erlaubt. Ein Baustein des Tissue Engineerings sind bio-resorbierbare Materialien, deren Abbau- und Einwachsverhalten noch untersucht werden muss, bevor diese f{\"u}r die klinische Anwendung zugelassen werden. Die durchgef{\"u}hrten in vitro µMR-Untersuchungen an Polymerscaffolds zeigten die reproduzierbare Quantifizierung der Porengr{\"o}ße und Wandst{\"a}rke. Dar{\"u}ber hinaus wurde eine inhomogene Verteilung der Strukturparameter beobachtet. Die Ergebnisse waren in guter {\"U}bereinstimmung mit µCT-Aufnahmen als Goldstandard. Unterschiedliche Varianten der Scaffolds konnten identifiziert werden. Dabei bewies sich die MR-Bildgebung als zuverl{\"a}ssige Alternative. Insgesamt zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit, welche Vorteile und Anwendungsm{\"o}glichkeiten die 3D-MRT-Bildgebung bietet, und dass auch mit klinischer Feldst{\"a}rke in vivo Voxelgr{\"o}ßen im Submillimeterbereich f{\"u}r alle Raumrichtungen erreichbar sind. Die erzielten Verbesserungen in der r{\"a}umlichen Aufl{\"o}sung erh{\"o}hen die Genauigkeit der verschiedenen Anwendungen und erm{\"o}glichen eine bessere Identifikation von kleinen Abweichungen, was eine fr{\"u}here und zuverl{\"a}ssigere Diagnose f{\"u}r Patienten verspricht.}, subject = {Kernspintomografie}, language = {de} } @phdthesis{Kriegebaum2011, author = {Kriegebaum, Ulrike}, title = {Entwicklung eines gewebenahen Konstruktes aus einer Matrix mit in vitro kultivierten Fibroblasten und Keratinozyten zum Ersatz der Oralmukosa unter Einsatz von Tissue Engineering}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-57403}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2011}, abstract = {In der Mund-, Kiefer- und Gesichtschirurgie besteht ein großer Bedarf an Transplantaten zur intra- und extraoralen Defektdeckung in der chirurgischen Therapie, insbesondere f{\"u}r die Rekonstruktion nach Traumen oder Tumorresektionen f{\"u}r den Erhalt von Funktion und {\"A}sthetik. Konventionelle Methoden wie die Verwendung von autologen, freien Spalt- und Vollhaut-Transplantaten zeigen Nachteile wie z. B. die Entnahmemorbidit{\"a}t der Spenderregion oder die Notwendigkeit eines zweiten chirurgischen Eingriffs zur Deckung des Entnahmedefektes. Zudem sind diese Transplantate nur in kleinen Mengen verf{\"u}gbar oder haben eine unterschiedliche Gewebestruktur sowie andere Keratinisierungsmuster. Diese Nachteile sollen mit Hilfe eines im Tissue Engineering hergestellten Oralmukosa-{\"A}quivalentes umgangen werden. Dazu wurden zun{\"a}chst Methoden zur Isolierung und Kultivierung prim{\"a}rer, oraler Fibroblasten bzw. Keratinozyten entwickelt, die das Ausgangsmaterial f{\"u}r die Herstellung von Dermal-{\"A}quivalenten bzw. von organotypischen Kokulturen in vitro bilden. Die Zellen wurden sowohl histologisch als auch immunhistochemisch charakterisiert und nach Optimierung der Kulturbedingungen zur Entwicklung von Oralmukosa-{\"A}quivalenten (OM{\"A}s) eingesetzt. Dabei ist auch die Wahl eines geeigneten Tr{\"a}germaterials ein entscheidender Faktor. Deshalb wurden in dieser Arbeit verschiedene Unterlagen auf Eignung als Scaffold f{\"u}r das Tissue Engineering von Oralmukosa getestet. Unter anderem wurden die Materialien Vicryl (resorbierbares Polyglactin-910-Netz), DRT (dermale Regenerationsmatrix aus bovinem Kollagen-I vernetzt mit einem Glycosaminoglycan) und TFE (equine Kollagen-I-Membran) in Zellkulturversuchen auf Biokompatibilit{\"a}t und Stabilit{\"a}t gepr{\"u}ft. Dazu wurden zun{\"a}chst Fibroblasten auf die Scaffolds ausges{\"a}t um Dermal-{\"A}quivalente (D{\"A}s) zu erhalten. Das Wachstum der Zellen wurde mittels Elektronenmikroskopie sowie immunhistochemischen Methoden untersucht. Die Analyse zeigte gutes Zellwachstum und somit gute Biokompatibilit{\"a}t auf allen verwendeten Materialien. In folgenden Experimenten wurden zus{\"a}tzlich Keratinozyten auf D{\"A}s ausges{\"a}t und somit organotypische OM{\"A}s entwickelt. Die generierten Konstrukte wurden mit Hilfe von IIF-F{\"a}rbungen von Kryoschnitten sowie RT-qPCR bez{\"u}glich ihrer Zellarchitektur, ihrer F{\"a}higkeit zur Bildung einer Basalmembran und ihrer F{\"a}higkeit zur Differenzierung untersucht. Es stellte sich heraus, dass auf allen drei Tr{\"a}gern Fibroblasten-Keratinozyten Kulturen hergestellt werden konnten. Dabei zeigte Vicryl eine gute Biostabilit{\"a}t, jedoch ohne Ausbildung der nat{\"u}rlichen Stratifizierung der Keratinozytenschichten. Auf TFE dagegen zeigte sich die beste Architektur und Proliferation der Zellen mit Stratifizierung der Keratinozyten, allerdings eine schlechte Biostabilit{\"a}t. DRT stellte sich als die Matrix heraus, die die gew{\"u}nschten Eigenschaften am besten vereint. Das Ergebnis war jedoch im Bezug auf die Dicke der Epithelschicht sowie deren Differenzierung und Ausbildung einer Basalmembran noch zu verbessern. Dies konnte mit Hilfe der Kulturmethode an der Luft-Fl{\"u}ssigkeits-Grenzfl{\"a}che erreicht werden. Jedoch gelang bez{\"u}glich der Zellarchitektur noch immer kein optimales Ergebnis. Erst der Einsatz einer weiteren Membran, SIS (azellularisierter Schweinedarm), die durch ihren nat{\"u}rlichen Ursprung {\"a}hnlich strukturiert ist wie humane Submukosa, zeigte, dass die angewandte Methodik zur Herstellung von OM{\"A}s funktionierte. Auf diesem Tr{\"a}ger gelang die Herstellung eines Transplantates, das eine mit normaler Oralmukosa vergleichbare, regul{\"a}re Zellarchitektur mit dermaler und epidermaler Komponente aufwies, die qualitativ noch besser war als auf TFE. Auch die Biostabilit{\"a}t w{\"a}hrend des Versuchszeitraumes war wie bei Vicryl und DRT gegeben. Die Neusynthese einer Basalmembran konnte mittels IIF-F{\"a}rbung nachgewiesen werden. Die Proliferation der Keratinozyten war in der Basalschicht lokalisiert und nahm Richtung apikal ab. Lediglich eine Differenzierung des Transplantates war mittels immunhistochemischer Methoden nicht nachweisbar. Auf diese Weise konnte in der vorliegenden Arbeit ein OM{\"A} entwickelt werden, dessen Aufbau mit dem von nat{\"u}rlicher Oralmukosa vergleichbar war. Die in dieser Arbeit gewonnen Erkenntnisse dienen somit als Grundlage zur Optimierung und Verwirklichung des klinischen Einsatzes von mittels Tissue Engineering hergestellten, autologen OM{\"A}s.}, subject = {Tissue Engineering}, language = {de} }