@phdthesis{Heil2004,
  author    = {Heil, Martin},
  title     = {Synthese und Screening einer kombinatorischen Rezeptorbibliothek f{\"u}r biologisch relevante Tetrapeptide},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-9355},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2004},
  abstract  = {Im Rahmen der hier vorliegenden Doktorarbeit wurde eine 512 Mitglieder umfassende kombinatorische Rezeptorbibliothek auf der Basis eines Guanidiniocarbonylpyrrols mit einer tripeptidischen Seitenkette dargestellt werden. Die kombinatorische Synthese der Bibliothek erfolgte nach der „Split and Mix" Methode auf Amino-TentaGel als fester Phase in IRORI MikroKans unter Benutzung der IRORI Radiofrequenzcodierung zur Dekodierung der einzelnen Mitglieder der Bibliothek. Die Bibliothek ist f{\"u}r die selektive Erkennung von Tetrapeptiden mit freien C-Termini konzipiert. Als Zielliganden wurden zwei biologisch relevante Modellpeptide ausgew{\"a}hlt, zum einen das Alzheimer Modellpeptid L Val L Val L Ile L-Ala-OH und zum anderen das Tetrapeptid D-Glu-L-Lys-D-Ala-D-Ala-OH, das im Zusammenhang mit dem Aufbau von Zellw{\"a}nden bei Bakterien eine wichtige Rolle einnimmt. Die Bestimmung von Bindungskonstanten auf der festen Phase erfolgte mit Hilfe eines Fluoreszenzscreenings, wobei die intensive Fluoreszenz eines Dansylrestes ausgenutzt wurde. Es wurden f{\"u}r alle 512 Mitglieder der Bibliothek Bindungskonstanten in Wasser auf der festen Phase f{\"u}r beide Liganden bestimmt. Die Bindungskonstanten f{\"u}r das Alzheimer Modellpeptid variierten von 4200 M-1 f{\"u}r die besten Rezeptoren bis zu 20 M-1, also einem vollst{\"a}ndigen Verlust der Bindungsaktivit{\"a}t, f{\"u}r die schlechtesten Rezeptoren. Hierbei zeigte sich, dass die Mehrzahl gut bindender Rezeptoren in Position AA1 eine Lys(Boc) Seitenkette aufwiesen. Anschließend wurden molekulardynamische Rechnungen durchgef{\"u}hrt, um Struktur-Stabilit{\"a}tsbeziehungen aufstellen zu k{\"o}nnen. Die auf der festen Phase erhaltenen Ergebnisse konnten durch die Bestimmung von Bindungskonstanten in L{\"o}sung durch UV-Titrationen best{\"a}tigt werden. Weiterhin wurden Untersuchungen mit einem Rezeptor in der Gasphase mit Hilfe von FT-ICR IRMPD ESI-MS durchgef{\"u}hrt. Dar{\"u}ber hinaus wurden in vitro Untersuchungen zur Inhibierung der Fibrillenbildung der Amyloid Proteine A\&\#61538; (1-42) und A\&\#61538; (1-40) mit ausgew{\"a}hlten Rezeptoren durchgef{\"u}hrt. F{\"u}r die kinetische und quantitative Inhibierung der Fibrillenbildung konnten zwei Rezeptoren gefunden werden, die den Nukleationsprozess bei beiden Peptiden signifikant verz{\"o}gerten und auch zu einer geringeren Menge an gebildeten Amyloid-Plaques gegen{\"u}ber der Kontrolle f{\"u}hrten. Die Bestimmung von Bindungseigenschaften der Rezeptorbibliothek gegen das Tetrapeptid D-Glu-L-Lys-D-Ala-D-Ala-OH, das im Zusammenhang mit der Entwicklung von neuen Antibiotika steht, wurde ebenfalls {\"u}ber fluoreszenzspektroskopische Methoden auf der festen Phase durchgef{\"u}hrt. In diesem Fall wurde nicht nur D-Glu-L-Lys-D-Ala-D-Ala-OH, sondern auch die inverse Sequenz auf Bindungsaktivit{\"a}t untersucht. Hierbei zeigte sich, dass das Bakterien Modellpeptid mit deutlich h{\"o}heren Bindungskonstanten auf der festen Phase erkannt wurde als das inverse Peptid. Die Bindungskonstanten f{\"u}r D-Glu-L-Lys-D-Ala-D-Ala-OH liegen f{\"u}r die besten Rezeptoren bei 17000 M-1, f{\"u}r die inverse Sequenz nur bei 5500 M-1, obwohl beide Liganden f{\"u}r Rezeptoren mit einem oder zwei Lysinen an Position AA1, AA2 oder AA3 die h{\"o}chsten Bindungskonstanten aufwiesen. Der Faktor der Bindungskonstanten zwischen sehr gut bindenden Rezeptoren und schlecht bindenden Rezeptoren betrug f{\"u}r beide Peptide {\"u}ber 200! Die besseren Bindungseigenschaften von D-Glu-L-Lys-D-Ala-D-Ala-OH im Vergleich zu der inversen Sequenz konnten durch molekulardynamische Rechnungen darauf zur{\"u}ckgef{\"u}hrt werden, dass das inverse Peptid beide Carboxylate intramolekular {\"u}ber eine Salzbr{\"u}cke mit der Lysin-Seitenkette stabilisieren kann, w{\"a}hrend D-Glu-L-Lys-D-Ala-D-Ala-OH nur eine Salzbr{\"u}cke zu einem der beiden Carboxylate ausbilden kann und das andere Carboxylat somit f{\"u}r eine effektive Komplexierung mit dem Guanidiniocarbonylpyrrol zur Verf{\"u}gung steht. Die auf der festen Phase erhaltenen Bindungskonstanten f{\"u}r das Bakterien-Modellpeptid konnten ebenfalls durch die Bestimmung von Bindungskonstanten in L{\"o}sung durch UV- und Fluoreszenztitrationen best{\"a}tigt werden. Kationische Guanidiniocarbonylpyrrol-Rezeptoren sind in der Lage anionische Tetrapeptide mit hohen Assoziationskonstanten, selbst in so polaren L{\"o}semitteln wie Wasser, zu binden. Abschließend kann gesagt werden, dass die Komplexstabilit{\"a}ten von einer fein abgestimmten Kombination von elektrostatischen und hydrophoben Wechselwirkung abh{\"a}ngen.},
  subject      = {Kombinatorische Synthese},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Hoffmann2003,
  author    = {Hoffmann, Markus Fritz Heinrich},
  title     = {Induktion von Sekund{\"a}rstrukturen durch den Einbau von Alanyl-PNA in Peptide und Proteine},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-6308},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2003},
  abstract  = {Die Aktivit{\"a}t von Biooligomeren wird wesentlich beeinflusst von deren molekularer Struktur bzw. Konformation. Eine Einflussnahme auf die Struktur sollte deswegen auch mit einer Aktivit{\"a}tsver{\"a}nderung einhergehen, ein „Schalten" von Struktur somit ein „Schalten" von Aktivit{\"a}t nach sich ziehen. Alanyl-PNA ist ein Oligopeptid alternierender Konfiguration mit Nukleobasen in \&\#946;-Position der Alanyl-Einheiten, das durch Wasserstoffbr{\"u}ckenbildung und \&\#960;-Stacking mit einem komplement{\"a}ren Strang Paarungsduplexe mit \&\#946;-faltblattartiger linearer Struktur eingeht. Der Einbau eines Alanyl-PNA-Stranges in ein Peptid oder Protein und Zugabe des korrespondierenden Gegenstranges sollte zu einer lokalen Induktion eines \&\#946;-Faltblattes f{\"u}hren und strukturelle Ver{\"a}nderungen im Gesamtpeptid hervorrufen. Es kann dann von einem molekularen Schalter gesprochen werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine vom cyclischen Peptidantibiotikum Gramicidin S abgeleitete 18mer-Peptid-Alanyl-PNA-Chim{\"a}re 20 mit eingebautem Alanyl-PNA-Pentamer dargestellt. Es konnte mittels temperaturabh{\"a}ngiger UV-Spektroskopie gezeigt werden, dass sich bei Zugabe des komplement{\"a}ren Gegenstranges nichtkovalente Duplexe bilden. CD-spektroskopische Untersuchungen dieses Dimers lieferten keine eindeutigen Beweise f{\"u}r das vorliegen eines \&\#946;-Faltblattes. Es konnte anhand des humanen Interleukins 8 gezeigt werden, dass der Einbau von Alanyl-PNA durch die Technik der native chemical ligation in gr{\"o}ßere Peptide m{\"o}glich ist. Hierf{\"u}r wurde der N-terminale Thioester 31 des humanen Interleukins hIL8(1-55) durch Expression des Fusionsproteines in E.coli und Expressed Protein Ligation dargestellt. Nach Umsetzung des Thioesters 31 mit einem Alanyl-PNA-Peptid-Hybrid 29, das N-terminal mit einem freien Cystein substituiert ist, wurde durch native chemical ligation ein von dem humanen Interleukin 8 abgeleitetes 77 Aminos{\"a}uren enthaltendes Peptid 30 mit eingebauter Alanyl-PNA erhalten. Dar{\"u}ber hinaus wurden mit keinem, einem oder zwei Lysinen substituierte Alanyl-PNA-Hexamere dargestellt und Strukturuntersuchungen unterworfen. Es konnte mittels temperaturabh{\"a}ngiger UV-Spektroskopie gezeigt werden, dass der Einbau zweier Lysine sowohl die L{\"o}slichkeit als auch die Bildungskinetik ver{\"a}ndert, die Stabilit{\"a}t (Tm-Wert) der Duplexe jedoch unver{\"a}ndert l{\"a}sst. Diese Hexamere wurden Kristallisationsversuchen unterworfen, bisher konnten noch keine Kristalle erhalten werden. Basierend auf den im Rahmen dieser Arbeit erhaltenen Ergebnissen sollte es in Zukunft dar{\"u}ber hinaus m{\"o}glich sein, genaueren Aufschluss {\"u}ber die Struktur von Alanyl-PNA zu erhalten. Die Erh{\"o}hung der L{\"o}slichkeit von Alanyl-PNA durch Einbau zweier Lysine erm{\"o}glicht nicht nur weitere Kristallisationsversuche, sondern man gelangt auch in Konzentrationsbereiche, in denen NMR-Untersuchungen an Alanyl-PNA m{\"o}glich werden, die bisher aufgrund zu schlechter L{\"o}slichkeit zu keinen zufrieden stellenden Ergebnissen gef{\"u}hrt haben. Durch weitere Optimierung der native chemical ligation und Bereitstellung gr{\"o}ßerer Mengen von Interleukin 8 Derivaten mit eingebauter Alanyl-PNA sollte es in Zukunft m{\"o}glich sein, den Einfluss des komplement{\"a}ren Alanyl-PNA-Stranges auf die Struktur des Gesamtsystems und dessen biologischer Aktivit{\"a}t zu untersuchen. Durch Variation und Optimierung der Sequenz und des {\"o}rtlichen Einbaus der Alanyl-PNA kann so vielleicht das Fernziel eines molekularen strukturellen Schalters f{\"u}r Peptide bzw. Proteine erreicht werden. Ebenso ist es denkbar, dass durch den Einbau von Alanyl-PNA in zwei verschiedene Peptide bzw. Proteine nichtkovalente Protein-Protein-Komplexe erhalten werden k{\"o}nnen.},
  subject      = {Peptide},
  language  = {de}
}