@phdthesis{Hoehn2023,
  author    = {H{\"o}hn, Marie},
  title     = {Ver{\"a}nderung der Tumorimmunumgebung muriner Mamma-Karzinome durch Inhibierung der Kollagensynthese},
  doi       = {10.25972/OPUS-28492},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-284929},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2023},
  abstract  = {Das Mamma-Karzinom geh{\"o}rt zu den sogenannten desmoplastischen Tumorarten. Hierbei handelt es sich um Tumoren mit erh{\"o}hter Ansammlung von Bindegewebszellen und einer Akkumulation von Extrazellul{\"a}rer Matrix (EZM). Diese verdichtete EZM wirkt sowohl auf mechanischer als auch auf Signalweg-vermittelter Ebene als eine Barriere, welche die therapeutische Wirksamkeit erheblich vermindert. Einer der Hauptbestandteile der EZM ist Kollagen. Durch Anwendung von Pr{\"a}paraten, welche die Kollagensynthese und -reifung inhibieren, kann die rigide Struktur aufgelockert werden. Daraus ergibt sich eine verbesserte Versorgung mit N{\"a}hrstoffen und eine verbesserte Infiltrationsm{\"o}glichkeit f{\"u}r Immunzellen. Dies ist f{\"u}r die Effizienz der Immuntherapie, welche sich in den letzten Jahren als vielversprechende Alternative zu den Grunds{\"a}ulen der Krebstherapie entwickelt hat, unabdinglich. In der vorliegenden Arbeit wurden murine Mamma-Karzinome der 4T1-Linie nach Behandlung mit EZM-destabilisierenden Kollageninhibitoren auf ihre Immunumgebung hin untersucht. Verwendet wurden drei Wirkstoffe, welche an unterschiedlichen Punkten in die Kollagensynthese und -reifung eingreifen: βAPN als LOX(L)-Inhibitor, 1,4-DPCA als P4HA-Inhibitor und Minoxidil als LH-Inhibitor. Die Behandlung f{\"u}hrte zu einem deutlichen Anstieg aller untersuchten Immunzellen und deutet somit auf eine verbesserte Infiltrationsm{\"o}glichkeit hin. Zudem wurde die Expression maligner Signalwege, wie die der Angiogenese, Hypoxie, Metastasierungsneigung, Invasivit{\"a}t und Immunsuppression, verringert und tumorsuppressive Immunantworten verst{\"a}rkt. Die Kollageninhibition hatte zus{\"a}tzlich ein verringertes Tumorwachstum und eine Reduktion der Blutgef{\"a}ßdichte zufolge. Als Fazit gilt es festzuhalten, dass die Verwendung von Kollageninhibitoren in der Immuntherapie eine vielversprechende Option zur Verbesserung der Effizienz dieser Therapeutika darstellt. Diese Erkenntnis gilt es im Rahmen k{\"u}nftiger wissenschaftlicher Untersuchungen weiterzuentwickeln.},
  subject      = {Brustkrebs},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Frank2009,
  author    = {Frank, Andreas},
  title     = {Untersuchungen zur Anwendbarkeit und Validit{\"a}t von In-vitro-Methoden bez{\"u}glich der Inhibition von Cytochrom-P450-Enzymen durch Arzneipflanzenextrakte},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-36236},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2009},
  abstract  = {Um Arzneimittelwechselwirkungen von Arzneistoffen sowie neuen Arzneistoffkandidaten zu vermeiden, werden zur Absch{\"a}tzung des Interaktionsrisikos so genannte In-vitro-Interaktionsstudien durchgef{\"u}hrt. Hierf{\"u}r werden vor allem Mikrotiterplatten-basierte Fluoreszenz- und LC/MS-Methoden verwendet. Das Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung der Anwendbarkeit und Validit{\"a}t dieser In-vitro-Methoden bez{\"u}glich der Inhibition von CYP-Enzymen durch Arzneipflanzenextrakte. Die in dieser Arbeit erhaltenen Daten belegen, dass die verwendeten Fluoreszenz-Assays f{\"u}r Pflanzenextrakte keine validen Ergebnisse liefern und f{\"u}r die Bestimmung der inhibitorischen Aktivit{\"a}t von Pflanzenextrakten nur in wenigen F{\"a}llen geeignet sind. Bei einigen untersuchten Pflanzenextrakten wurden sehr starke inhibitorische Aktivit{\"a}ten gefunden, da durch Quenching des Fluoreszenzsignals falsch positive Ergebnisse vorget{\"a}uscht wurden. Ebenso war die Inhibition bei einigen Pflanzenextrakten aufgrund einer starken Eigenfluoreszenz sehr schwach oder konnte {\"u}berhaupt nicht bestimmt werden. Des Weiteren wurden als Referenzmethoden f{\"u}r die Bestimmung der Inhibition von CYP-Enzymen LC/MS-basierte Methoden mit Online-Festphasenextraktion verwendet, die speziell f{\"u}r Pflanzenextrakte entwickelt und validiert wurden. Die Ergebnisse der LC/MS-basierten CYP-Assays wurden durch die Pflanzenmatrix nicht beeinflusst, so dass diese Assays hervorragend als Referenzmethoden f{\"u}r die Bestimmung der inhibitorischen Aktivit{\"a}t von Pflanzenextrakten geeignet sind. Bei sehr hohen Extraktkonzentrationen zeigten einige Pflanzenextrakte sehr starke Abweichungen der mittels LC/MS und Fluorimetrie in Mikrotiterplatten erhaltenen inhibitorischen Aktivit{\"a}t. Die Verwendung von niedrigen Extraktkonzentrationen f{\"u}hrte zu einer besseren {\"U}bereinstimmung der erhaltenen Ergebnisse. D.h. vor allem bei hohen Extraktkonzentrationen sind starke Quenching- und Eigenfluoreszenz-Effekte zu erwarten. Dennoch sind auch bei niedrigen Extraktkonzentrationen diese Effekte nicht auszuschließen. In den meisten Ver{\"o}ffentlichungen wurden sehr hohe Testkonzentrationen f{\"u}r die Bestimmung der inhibitorischen Aktivit{\"a}t von Pflanzenextrakten verwendet, so dass mit hoher Wahrscheinlichkeit aufgrund von Quenching- und Eigenfluoreszenz-Effekten falsch positive bzw. negative Ergebnisse erhalten wurden. Untersuchungen zum Quenching haben gezeigt, dass die meisten Extrakte in den {\"u}blicherweise verwendeten Konzentrationen (ca. 10-1000 µg/ml) die Fluoreszenzintensit{\"a}t der Metabolite sehr stark reduzierten. Die Quenching-Effekte der Pflanzenextrakte beeinflussten das Fluoreszenzsignal aller enzymatisch gebildeten Metabolite (Cumarin-Derivate, Resorufin, Fluorescein), wobei die Quenching-Effekte bei Resorufin und Fluorescein in ihrer St{\"a}rke und H{\"a}ufigkeit geringer ausfielen. Bei CYP2B6, CYP2C9 und CYP2D6 wurden in Verbindung mit Fluoreszenzsubstraten, die eine Cumarinstruktur aufweisen, sehr oft falsch negative oder gar keine Ergebnisse erhalten, weil die Eigenfluoreszenz der Extrakte die Metabolitenfluoreszenz {\"u}berlagerte. Quenching-Effekte traten bei den untersuchten Pflanzenextrakten weitaus h{\"a}ufiger auf als eine Eigenfluoreszenz. Aufgrund dieser Tatsachen k{\"o}nnen die Mikrotiterplatten-basierten Fluoreszenz-Methoden nur eingesetzt werden, wenn vorher gezeigt wurde, dass die Pflanzenextrakte bei allen Testkonzentrationen sowie bei verschiedenen Metabolitenkonzentrationen weder Quenching- noch Eigenfluoreszenz-Effekte zeigen. Ebenso wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass die bisher in Ver{\"o}ffentlichungen durchgef{\"u}hrten Kontrollinkubationen nur bedingt zur Kompensation von Quenching- und Eigenfluoreszenz-Effekten geeignet sind. Das Auftreten und Ausmaß der Quenching- und Eigenfluoreszenz-Effekte sind abh{\"a}ngig vom Inhibitor (Pflanzenextrakt), der Inhibitorkonzentration, dem Metaboliten und dessen Anregungs- und Emissionswellenl{\"a}nge sowie der Metabolitenkonzentration, die durch die enzymatische Umsetzung des Substrats und der inhibitorischen Aktivit{\"a}t des Inhibitors bestimmt wird. W{\"a}hrend der Inhibitor, die zu testenden Inhibitorkonzentrationen, der Metabolit sowie dessen Anregungs- und Emissionswellenl{\"a}nge eine feste Gr{\"o}ße darstellen, ist die Metabolitenkonzentration je nach inhibitorischer Aktivit{\"a}t des Inhibitors sehr unterschiedlich. D. h. letztendlich h{\"a}ngt das genaue Ausmaß der Eigenfluoreszenz- und Quenching-Effekte von der inhibitorischen Aktivit{\"a}t der Pflanzenextrakte ab. Es konnte gezeigt werden, dass je geringer die Metabolitenkonzentration ist, desto st{\"a}rker wird das Fluoreszenzsignal reduziert (Quenching) bzw. erh{\"o}ht (Eigenfluoreszenz). Eine sinnvolle Kontrollinkubation zur Kompensation von Quenching- und Eigenfluoreszenz-Effekten kann also gar nicht durchgef{\"u}hrt werden. Bei In-vitro-Untersuchungen zur Bestimmung der inhibitorischen Aktivit{\"a}t ist die Metabolitenkonzentration nicht bekannt und somit der Einfluss der Effekte nicht bestimmbar.},
  subject      = {In vitro},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Mueller2015,
  author    = {M{\"u}ller, Elisabeth},
  title     = {Pan-Raf-Inhibition als neue therapeutische Strategie im Multiplen Myelom},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-124666},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2015},
  abstract  = {Das Multiple Myelom (MM) ist eine durch monoklonale Vermehrung terminal differenzierter Antik{\"o}rper-produzierender B-Lymphozyten (Plasmazellen) im Knochenmark charakterisierte maligne Krankheit, die sich v.a. in osteolytischen Knochendestruktionen, h{\"a}matopoetischer und Niereninsuffizienz {\"a}ußert. Verbesserte Therapieans{\"a}tze wie die Hochdosis-Chemotherapie mit Melphalan und anschließender autologer Stammzelltransplantation sowie die Einf{\"u}hrung neuer pharmakologischer Substanzklassen (Proteasom-Inhibitoren, Cereblon-bindende Thalidomidderivate) f{\"u}hrten zu einer Verl{\"a}ngerung der durchschnittlichen {\"U}berlebenszeit, f{\"u}r die meisten der Patienten ist die Erkrankung jedoch derzeit unheilbar. Die Erforschung neuer potenzieller therapeutischer Angriffspunkte auf Grund pathobiologischer Erkenntnisse bleibt daher unabdingbar. Ein Ansatz zur Verbesserung des Verst{\"a}ndnisses der Pathogenese ist die funktionelle, molekulare und genetische Analyse des Signalnetzwerkes im MM. Im Zusammenhang mit diesem Konzept wurde entdeckt, dass wachstums-regulierende Signalwege in MM Zellen aktiviert oder dereguliert sind und zum {\"U}berleben und der Proliferation des Tumors beitragen. So konnte beispielsweise von unserer Arbeitsgruppe bereits gezeigt werden, dass onkogenes Ras essentiell zum {\"U}berleben der MM Zellen beitr{\"a}gt. Da Ras derzeit mangels spezifischer Inhibitoren pharmakologisch nicht angreifbar ist, stellen weitere funktionelle Bestandteile des Signalweges eine potenzielle therapeutische Zielstruktur dar. W{\"a}hrend die Blockade von MEK1/2 in MM Zellen keinen Einfluss auf das {\"U}berleben hatte, konnte durch die Blockade von Raf in ersten Tests unserer Arbeitsgruppe Apoptose hervorgerufen werden. Aus diesem Grund habe ich in der vorliegenden Arbeit zur Evaluation eines neuen Therapieansatzes die Rolle der Raf-abh{\"a}ngigen Signaltransduktion eingehend untersucht. Als Grundlage diente dabei die Hypothese, dass die Raf-Kinasen entscheidende Effektoren der durch onkogenes Ras vermittelten apoptotischen Effekte darstellen. In einem ersten Schritt konnte ich nachweisen, dass alle drei Raf-Isoformen (A-, B- und C-Raf) in humanen MM Zelllinien und in prim{\"a}ren MM Zellen aktiviert sind. Mittels shRNA-vermittelter, Isoform-spezifischer Raf-Knockdown-Experimente konnte ich zeigen, dass nur ein simultaner Knockdown aller Isoformen, d.h. ein Pan-Raf-Knockdown, zu einer De-Phosphorylierung von MEK1/2 und ERK1/2 f{\"u}hrte. Dieser Versuch ließ sich mittels pharmakologischer Raf-Inhibition, bei der ebenfalls nur eine Pan-Raf-Blockade zu einer Herunterregulation von MEK1/2 und ERK1/2 in MM Zellen f{\"u}hrte, best{\"a}tigen. Das MEK/ERK-Modul stellte somit einen hervorragenden Surrogat- und Biomarker f{\"u}r die Pan-Raf-Aktivit{\"a}t dar. Im Gegensatz zur Blockade des MEK/ERK-Moduls f{\"u}hrte eine Hemmung der Pan-Raf-Aktivit{\"a}t mittels shRNA oder pharmakologischer Inhibitoren in allen untersuchten Zelllinien und in der Mehrheit der prim{\"a}ren MM Zellen zu einer starken Induktion von Apoptose. Da das Ansprechen auf eine Pan-Raf-Blockade nicht mit dem Ras-Mutationsstatus korrelierte, k{\"o}nnten die Raf-Kinasen eine von onkogenem Ras unabh{\"a}ngie Qualit{\"a}t als therapeutische Zielstruktur aufweisen. Zur Untersuchung m{\"o}glicher MEK/ERK-unabh{\"a}ngiger Effektormechanismen der Pan-Raf-Inhibition habe ich die mRNA-basierten Genexpressionsprofile von INA-6 Zellen nach pharmakologischer Pan-Raf- oder MEK-Inhibition verglichen. Dabei f{\"u}hrte die Pan-Raf-Inhibition zu einer Regulation von wesentlich mehr Genen, wobei sich auch die Art der regulierten Gene unterschied, darunter Gene mit tumorrelevanten Funktionen wie Regulation von Proliferation, Zellzyklus und Apoptose. F{\"u}r eine dieser Gengruppen, die Gruppe der PI3K-abh{\"a}ngigen, mTOR-assoziierten Gene, konnte ich eine Regulation auch auf der Proteinebene nachweisen: die Phosphorylierungen von mTOR, p70S6K, Rb und AKT und die Expression von CyclinD1 und PDK1 waren nach Pan-Raf-Inhibition, nicht jedoch nach MEK-Blockade herunterreguliert. Dieses Ergebnis deutet auf eine Ko-Regulation der PI3K-abh{\"a}ngigen Signaltransduktion durch die Raf-kinasen hin. Mittels spezifischer PI3K-Inhibitoren ließ sich sowohl bei der Regulation der untersuchten Proteine als auch bei der Induktion von Apoptose eine deutliche Verst{\"a}rkung der Pan-Raf-Inhibition in HMZL und in prim{\"a}ren Zellen erzielen. Zusammengefasst zeigt diese Arbeit, dass die Pan-Raf-Blockade eine neue Therapiem{\"o}glichkeit darstellt, die durch Kombination mit einer PI3K/AKT-Inhibition noch verst{\"a}rkt werden kann.},
  subject      = {Plasmozytom},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Schaefer2020,
  author    = {Sch{\"a}fer, Florian},
  title     = {Kontraktionsverhalten neonataler Rattenkardiomyozyten bei {\"U}berexpression phosphorylierungsdefizienter RKIP Mutanten S51/S52},
  doi       = {10.25972/OPUS-21374},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-213747},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2020},
  abstract  = {Durch Phosphorylierung inaktiviert GRK2 kardiale ß-Adrenorezeptoren und vermindert dadurch die Kontraktilit{\"a}t von neonatalen Rattenkardiomyozyten. Als nat{\"u}rlicher Inhibitor der GRK2 beeinflusst RKIP die Signalweiterleitung bei Stimulation von ß-Adrenorezeptoren. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass eine {\"U}berexpression von RKIP die Kontraktilit{\"a}t von neonatalen Rattenkardiomyozyten erh{\"o}ht. Es wurde die Anzahl auftretender Spontankontraktionen vor und nach Stimulation mit Isoproterenol erfasst sowie eine zeitliche Analyse der Calciumfreisetzung und -aufnahme nach elektrischer Stimulation durchgef{\"u}hrt. Im unstimulierten Zustand zeigten neonatale Rattenkardiomyozyten, die Wildtyp-RKIP {\"u}berexprimierten, verglichen mit der Kontrollgruppe, keine signifikanten Unterschiede hinsichtlich auftretender Spontankontraktionen. Nach Stimulation mit Isoproterenol zeigten neonatale Rattenkardiomyozyten, in denen Wildtyp-RKIP {\"u}berexprimiert wurde, eine signifikant h{\"o}here Anzahl auftretender Spontankontraktionen. Eine Analyse der Calciumtransienten zeigte bei RKIP-Wildtyp {\"u}berexprimierenden neonatalen Rattenkardiomyozyten eine erh{\"o}hte Calciumfreisetzung w{\"a}hrend der Systole sowie eine beschleunigte Calciumwiederaufnahme w{\"a}hrend der Diastole. Zudem wurden die RKIP-Mutanten RKIPS51V und RKIPS52V im Hinblick auf ihre Kontraktilit{\"a}t untersucht. Neonatale Rattenkardiomyozyten welche RKIPS51V und RKIPS52V {\"u}berexprimierten zeigten weder im Hinblick auf auftretende Spontankontraktionen noch bei der Analyse der Calciumtransienten signifikante Unterschiede zur Kontrollgruppe. Da auch eine Phosphorylierung an Aminos{\"a}ureposition 51 bzw. Aminos{\"a}ureposition 52 ohne direkte Auswirkung auf die Kontraktilit{\"a}t m{\"o}glich ist, wurde in einem in vitro Kinase Assay analysiert, ob neben der bekannten Phosphorylierungsstelle S153 eine weitere Phosphorylierung von RKIP durch PKA oder PKC erfolgt. Bei Einsatz der an Aminos{\"a}ureposition 153 phosphorylierungsdefizienten RKIP Mutante RKIPS153A konnte keine Phosphorylierung beobachtet werden. In der vorliegenden Arbeit konnte neben einer Phosphorylierung an S153 keine weitere Phosphorylierung von RKIP durch PKC oder PKA beobachtet werden.},
  subject      = {Herzinsuffizienz},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Arndt2000,
  author    = {Arndt, Petra},
  title     = {Klonierung und funktionelle Charakterisierung von organischen Kationentransportern aus der Rattenniere},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-793},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2000},
  abstract  = {Der organische Kationentransport im proximalen Tubulus der Niere spielt eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der Hom{\"o}ostase der K{\"o}rperfl{\"u}ssigkeiten und der Ausschleusung von toxischen organischen Kationen. Der Transport von organischen Kationen wird an der B{\"u}rstensaummembran durch den H+/organische Kationen-Austauscher vermittelt, w{\"a}hrend bei dem Transport von organischen Kationen an der basolateralen Membran das nach innen gerichtete negative Membranpotential eine treibende Kraft darstellt. Durch Expressionsklonierung wurde der erste organische Kationentransporter, rOCT1, aus der Rattenniere isoliert. Kurz darauf wurde im Rahmen dieser Arbeit ein zweiter organischer Kationentransporter ebenfalls aus der Ratenniere kloniert. rOCT2 besteht aus 593 Aminos{\"a}uren und besitzt 12 putative Transmembrandom{\"a}nen. Zum funktionellen Vergleich zwischen rOCT1 und rOCT2 wurde das Oozytenexpressionssystem verwendet. In der vorliegenden Arbeit wurde ein pharmakologisches Profil von rOCT2 erstellt. Das Substratsprektrum von rOCT2 ist dem von rOCT1 sehr {\"a}hnlich. Die Affinit{\"a}ten von rOCT2 gegen{\"u}ber verschiedenen Substanzen wurden direkt mit denen von rOCT1 verglichen. Einerseits fanden wir bei einigen Substraten Unterschiede in den Km- und Vmax-Werten, aber andererseits auch viele {\"A}hnlichkeiten zwischen beiden Transportern. Anionen (z. B. p-Aminohippurat) wurden als neue Gruppe von Inhibitoren f{\"u}r den durch rOCT1- und rOCT2-vermittelten Transport identifiziert. Die Potentialdifferenz ist die treibende Kraft des rOCT1- und rOCT2-vermittelten Transportes. Wir konnten potentialabh{\"a}ngige Ver{\"a}nderungen der Km-Werte von Cholin-induzierten Einw{\"a}rtsstr{\"o}men zeigen. Bei dem Austausch von Na+-Ionen gegen K+-Ionen im Reaktionspuffer wurde die Aufnahme von Cholin und MPP durch rOCT2 erniedrigt. Der bidirektionale Transport von MPP wurde gezeigt und trans-Stimulationsexperimente f{\"u}r MPP-Influx und MPP-Efflux durchgef{\"u}hrt, um die Asymmetrie des Transporters zu studieren. Dar{\"u}berhinaus wurde in der vorliegenden Arbeit die Interaktion von verschiedenen Substraten mit rOCT1 und rOCT2 untersucht und ein kompetitver und nicht-kompetitiver Hemmtyp bei der TEA-Aufnahme gefunden.},
  subject      = {Ratte},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Melber2012,
  author    = {Melber, Makito Bernhard},
  title     = {Impulsivit{\"a}t und Antworthemmung bei adulter Aufmerksamkeitsdefizit- und Hyperaktivit{\"a}tsst{\"o}rung (ADHS)},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-78862},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2012},
  abstract  = {Ziel der vorliegenden, experimentellen Arbeit war die Untersuchung der Pers{\"o}nlichkeitseigenschaft der Impulsivit{\"a}t bei adulten Patienten mit ADHS und vergleichbaren Versuchspersonen. Da die {\"A}tiopathogenese erh{\"o}hter Impulsivit{\"a}t bei Patienten mit ADHS bislang ungekl{\"a}rt ist, eine Beeinflussung des dopaminergen Systems durch vorausgehende Studien allerdings nahe liegt, wurden die verwendeten Impulsivit{\"a}tsmessungen zus{\"a}tzlich bez{\"u}glich einer m{\"o}glichen Beeinflussung durch den Val158Met-COMT-Polymorphismus analysiert. Die Untersuchung beinhaltet mit 71 adulten Patienten mit ADHS und 54 gesunden Kontrollpersonen, die nach Alter, Geschlecht, IQ, Kopfumfang und H{\"a}ndigkeit vergleichbar waren, eine der aktuell gr{\"o}ßten Stichproben adulter Patienten mit ADHS. W{\"a}hrend einer Stoppsignal-Aufgabe zur Erfassung der Antworthemmungsf{\"a}higkeit als Korrelat der Impulsivit{\"a}t wurden die Verhaltensdaten der Stichproben sowie die hirnphysiologischen Ver{\"a}nderungen mittels funktioneller Nahinfrarotspektroskopie aufgezeichnet und ausgewertet. Die erhobenen experimentellen Daten wurden anschließend mit selbstbewerteter Impulsivit{\"a}t des I7-Impulsivit{\"a}tsfragebogens nach Eysenck verglichen und auf m{\"o}gliche Zusammenh{\"a}nge {\"u}berpr{\"u}ft. Zudem wurden die beobachteten Ergebnisse der vorliegenden Arbeit auf einen m{\"o}glichen Einfluss durch den Val158Met-COMT-Polymorphismus untersucht. Auf der Verhaltensebene zeigten Patienten mit ADHS im Vergleich zu gesunden Kontrollpersonen sowohl f{\"u}r die SSRZ als auch f{\"u}r die Go-RZ signifikant langsamere Reaktionszeiten. Im Vergleich der funktionellen Daten konnten f{\"u}r Patienten mit ADHS w{\"a}hrend der erfolgreichen Stopp-Trials signifikant bzw. tendenziell verminderte Aktivierungen im Bereich des IFC und DLPFC in beiden Hemisph{\"a}ren festgestellt werden. Die Untersuchung der selbstbewerteten Impulsivit{\"a}t anhand des I7-Fragebogens ergab ebenfalls einen signifikanten Unterschied zwischen den beiden Stichproben. Bez{\"u}glich der Zusammenh{\"a}nge zwischen den einzelnen Impulsivit{\"a}tsmessungen konnten f{\"u}r Patienten mit ADHS signifikant bzw. tendenziell negative Zusammenh{\"a}nge zwischen SSRZ und Oxygenierung im rechten IFC sowie zwischen SSRZ bzw. Go-RZ und I7-Impulsivit{\"a}tswerten festgestellt werden. In der Untersuchung des Einflusses durch den Val158Met-COMT-Polymorphismus ergab sich ein sehr heterogenes Bild, in dem sich keine eindeutig systematischen Genotyp- oder Interaktionseffekte zeigten. W{\"a}hrend die beobachteten Befunde auf Verhaltensebene auf eine generelle Verlangsamung adulter Patienten mit ADHS im Vergleich zu gesunden Kontrollpersonen hindeuten, k{\"o}nnte das verminderte Aktivierungsmuster im Bereich des IFC und DLPFC w{\"a}hrend der erfolgreichen Stopp-Trials bei Patienten mit ADHS m{\"o}glicherweise das zugrundeliegende funktionelle Korrelat zu den beobachteten Reaktionsunterschieden zwischen den beiden Stichproben darstellen. Obwohl Patienten mit ADHS im Vergleich zu gesunden Kontrollen aufgrund ihrer erh{\"o}hten Impulsivit{\"a}t defizit{\"a}r erscheinen, deuten die Befunde bez{\"u}glich des Zusammenhangs zwischen selbstbewerteter und experimentell erhobener Impulsivit{\"a}t innerhalb der Patientengruppe einen m{\"o}glichen Vorteil erh{\"o}hter I7-Impulsivit{\"a}tswerte f{\"u}r die Reaktionsf{\"a}higkeit in der Stoppsignal-Aufgabe an. Bez{\"u}glich der Beeinflussung der erhobenen Daten durch den Val158Met-COMT-Polymorphismus lassen sich anhand der Befunde dieser Arbeit keine klaren Schlussfolgerungen ziehen.},
  subject      = {Aufmerksamkeits-Defizit-Syndrom},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Ehlis2007,
  author    = {Ehlis, Ann-Christine},
  title     = {Hirnelektrische Hypofrontalit{\"a}t bei schizophrenen Patienten und ihre Bedeutung f{\"u}r die Auswahl der neuroleptischen Medikation},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-26566},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2007},
  abstract  = {Hintergrund und Ziel der Untersuchung: Patienten mit schizophrenen Erkrankungen zeigen in einer Vielzahl von Untersuchungssituationen eine verminderte Funktion frontaler Hirnregionen (Hypofrontalit{\"a}t), die insbesondere auch den anterioren cingul{\"a}ren Cortex (ACC) betrifft. Verschiedene Arten antipsychotischer Medikation unterscheiden sich hinsichtlich ihrer Wirkung auf Metabolismus und Funktion des Frontalcortex, wobei es Hinweise darauf gibt, dass atypische Antipsychotika diesen Bereich des Gehirns positiv beeinflussen, w{\"a}hrend konventionelle Antipsychotika (Typika) hier nur geringe oder sogar negative Effekte zeigen. Hinsichtlich der Auswahl eines Antipsychotikums zu Beginn einer medikament{\"o}sen Behandlung gibt es bislang keine etablierten neurophysiologischen/biologischen Marker, die eine Vorhersage der Therapie-Response unter verschiedenen Arten antipsychotischer Medikation erlauben. Ziel der Studie war es daher, die Eignung der NoGo-Anteriorisierung (NGA) als Pr{\"a}diktor der Therapie-Response schizophrener Patienten unter typischer bzw. atypischer Medikation zu untersuchen. Die NGA ist ein neurophysiologischer Marker, der die Funktion pr{\"a}frontaler Areale einschließlich des ACC widerspiegeln soll. Unter Zuhilfenahme dieses Parameters wurde an einer Gruppe schizophrener Patienten {\"u}berpr{\"u}ft, ob das Ausmaß der initialen Hypofrontalit{\"a}t eine Vorhersage der individuellen Therapie-Response erlaubt. Methoden: Es wurden 76 Patienten mit Erkrankungen aus dem schizophrenen Formenkreis zu jeweils drei Messzeitpunkten neurophysiologisch, neuropsychologisch und psychometrisch getestet. Die Baseline-Messung (t1) fand innerhalb der ersten drei Tage eines station{\"a}r-psychiatrischen Aufenthalts, die beiden Folgemessungen (t2, t3) drei bzw. sechs Wochen nach Beginn einer Therapie mit typischen (n=36) oder atypischen Antipsychotika (n=40) statt. Im Rahmen der neurophysiologischen Untersuchung f{\"u}hrten die Patienten eine Go-NoGo-Aufgabe durch, wobei anhand der durch Go- und NoGo-Stimuli evozierten ereigniskorrelierten Potentiale individuell die NGA ermittelt wurde. Beide Behandlungsgruppen wurden aufgrund der NGA-Werte zu t1 in Patienten mit initial starker vs. schwacher Frontalhirnfunktion unterteilt (Mediansplit). Ergebnisse: Alle Patientengruppen zeigten eine signifikante Besserung der psychotischen Symptomatik im Verlauf des 6-w{\"o}chigen Untersuchungszeitraums. Außerdem hatten Atypika hypothesengem{\"a}ß einen signifikant positiven Einfluss auf die Entwicklung der neuropsychologischen Testleistungen, w{\"a}hrend Typika oftmals mit einer Verschlechterung entsprechender Maße einhergingen. Atypika hatten zudem eine g{\"u}nstigere Wirkung auf die subjektiv erlebte Lebensqualit{\"a}t der Patienten. Dar{\"u}ber hinaus war die zu t1 erhobene NGA ein signifikanter Pr{\"a}diktor der Therapie-Response. Niedrige Werte der NGA zu Beginn der Behandlung sagten dabei ein besonders gutes Ansprechen auf atypische Antipsychotika voraus, w{\"a}hrend hohe Werte der NGA zu t1 mit einer besonders deutlichen klinischen Besserung unter typischer Medikation einhergingen. Die NGA korrelierte zudem signifikant mit den neuropsychologischen Testleistungen, unterlag selbst aber keinen systematischen Ver{\"a}nderungen unter typischer vs. atypischer Medikation. Schlussfolgerung: Der auf der Basis fr{\"u}herer Untersuchungen vermutete Zusammenhang zwischen der NGA und pr{\"a}frontalen Hirnfunktionen konnte anhand der vorliegenden Befunde best{\"a}tigt werden. Außerdem war aufgrund der zu Beginn einer station{\"a}r-psychiatrischen Behandlung gemessenen NGA eine signifikante Vorhersage der Therapie-Response unter typischen und atypischen Antipsychotika m{\"o}glich. Die NGA k{\"o}nnte somit im klinischen Alltag zu einer individualisierten Entscheidungsfindung bei der Auswahl eines antipsychotischen Pr{\"a}parats, unter Ber{\"u}cksichtigung pathophysiologischer Aspekte der Erkrankung, beitragen.},
  subject      = {Schizophrenie},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Humrich2009,
  author    = {Humrich, Jan},
  title     = {G-Protein betagamma-Regulation durch Phosducin-like Proteine},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-40059},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2009},
  abstract  = {Phosducin-like Protein existiert in zwei Splicevarianten: PhLPLONG (PhLPL) und PhLPSHORT (PhLPS). Sie unterscheiden sich in der L{\"a}nge ihres N-Terminus und in ihrem Expressionsmusters: Die lange Form (PhLPL) wird ubiquit{\"a}r exprimiert und bindet G-Protein-betagamma-Untereinheiten (Gbetagama), was zur Hemmung von Gbetagamma-abh{\"a}ngigen Funktionen f{\"u}hrt. Der um 83 Aminos{\"a}uren verl{\"a}ngerte N-Terminus besitzt ein hoch konserviertes Motiv, welches f{\"u}r die Gbetagamma-Bindung und Regulation von entscheidender Bedeutung ist. Im Gegensatz hierzu besitzt die kurzen Spliceform PhLPS, deren Expression in verschiedenen Gewebetypen deutlich geringer ist, diese hoch konservierte Region nicht. In der vorliegenden Arbeit wurde nun erstmals die Rolle von PhLPL und PhLPS bei der Gbetagamma-Regulation in intakten Zellen untersucht. Hierbei konnte {\"u}berraschenderweise gefunden werden, dass PhLPS der potentere und effizientere Regulator f{\"u}r Gbetagamma-abh{\"a}ngige Signale war. PhLPL hingegen schien in seiner Gbetagamma-regulierenden F{\"a}higkeit limitiert zu werden. Die Ursache dieser Limitierung von PhLPL in intakten Zellen wurde auf eine konstitutive Phosphorylierung seines verl{\"a}ngerten N-Terminus durch die ubiquit{\"a}re Casein Kinase 2 (CK2) zur{\"u}ckgef{\"u}hrt. Die verantwortlichen Phosphorylierungsstellen (S18, T19, S20) wurde identifiziert und die Mutation der CK2-Phosphorylierungsstellen (PhLPLA18-20) f{\"u}hrte zu einer Verbesserung der hemmenden Funktion von PhLPL in Zellen. In vitro-Assays zur Bindungsf{\"a}higkeit von rekombinantem PhLPL (vor und nach CK2-Phosphorylierung) zeigten allerdings: die Phosphorylierung beeinflusste die Affinit{\"a}t nicht. Eine genaue Analyse der N-terminalen Strukuren von PhLPL zeigte indes, dass die Regulationsf{\"a}higkeit von PhLPL in intakten Zellen vor allem in dem konservierten Gbetagamma-Bindungsmotiv zu suchen war. Die Mutation einer einzigen Aminos{\"a}ure (W66V) war ausreichend, um sowohl die Gbetagamma-Bindungsf{\"a}higkeit, als auch die F{\"a}higkeit zur funktionellen Hemmung in intakten Zellen zu verlieren. Was war also der Mechanismus der Hemmung von Gbetagamma durch PhLPS und die phophorylierungsdefiziente Mutante von PhLPL? Ein erster Hinweis hierauf kam von der Beobachtung, dass die Gbeta- und Ggamma-Untereinheiten in Anwesenheit von PhLPS in ihrem Proteingehalt deutlich reduziert vorlagen (wie in Western Blots gezeigt). Dieser Mechanismus schien von proteasomalen Abbauwegen abzuh{\"a}ngen (gezeigt durch Effekte des spezifischen Proteasominhibitors Lactazystin). Allerdings schien eine Stabilisierung der Gbeta- und Ggamma-Untereinheiten (durch N-terminale Fusion mit einem Protein zur vitalen Proteinf{\"a}rbung) nicht die Funktionsf{\"a}higkeit von Gbetagamma in Anwesenheit von PhLPS bewahren zu k{\"o}nnen. Ganz im Gegenteil, es wurde gezeigt, dass Gbeta und Ggamma hierbei nicht mehr zu einem funktionellen Dimer assoziierten. Dies war ein Hinweis darauf, dass m{\"o}glicherweise Proteinfaltungsmechanismen bei der Regulation essentiell sein k{\"o}nnten. Eine postulierte Rolle bei der Faltung von WD40-Repeatproteinen wie der Gbeta-Untereinheit wurde dem Chaperonin-Komplex CCT (chaperonin containing TCP) zugedacht. Folgerichtig konnte PhLPS mit seinen funktionell aktiven Dom{\"a}nen an endogenes TCP-1alpha (einer Untereinheit von CCT) binden. Ferner konnte gezeigt werden, dass die Hemmung des CCT-Komplexes durch RNA-Interferenz mit TCP-1alpha ebenso wie PhLPS zur spezifischen Reduktion von Gbetagamma f{\"u}hrte. In dieser Arbeit wurde also ein neuartiger Mechanismus der G-Protein-Regulation durch Hemmung der Proteinfaltung von Gbetagamma beschrieben. Ein Schaltmechanismus zwischen direkter Gbetagamma-Bindung (induziert durch CK2-Phosphorylierung von PhLPL) und Hemmung der Proteinfaltung von Gbetagamma (induziert durch alternatives Splicen oder durch Dephosphorylierung von PhLP) wird postuliert.},
  subject      = {G-Proteine},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Voelker2013,
  author    = {V{\"o}lker, Michael},
  title     = {Entwicklung, Charakterisierung und Anwendung neuer In-vitro-Methoden zur Untersuchung des Fremdstoffmetabolismus und der Inhibition fremdstoffmetabolisierender Enzyme},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-99434},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2013},
  abstract  = {Arzneistoffe werden nach ihrer Applikation durch verschiedene fremdstoff-metabolisierende Enzyme des Organismus biochemisch ver{\"a}ndert. Durch eine Hemmung dieser Enzyme, z. B. durch Grapefruitsaft oder einen gleichzeitig eingenommenen Arzneistoff, kann es insbesondere bei Arzneistoffen mit geringer therapeutischer Breite, wie z. B. Theophyllin oder Phenprocoumon, zu gef{\"a}hrlichen Nebenwirkungen kommen. Besonders gef{\"a}hrdet sind multimorbide Patienten, die eine Therapie mit einer Vielzahl von Arzneimitteln erhalten. Um den Metabolismus von neuen Wirkstoffen und deren Interaktionspotential zu untersuchen, werden u. a. In-vitro-Experimente mit Zellfraktionen oder einzelnen Enzymen durchgef{\"u}hrt. Bei Inhibitionsassays wird der Einfluss von Arzneistoffen auf die Umsetzung eines Testsubstrates untersucht. Ein Großteil dieser Arbeit besch{\"a}ftigt sich daher mit der Entwicklung von Methoden, mit denen die Inhibition wichtiger fremd-stoffmetabolisierender Enzyme, wie Cytochrom-P450-Enzyme (CYP-Enzyme), Glutathion-S-Transferasen (GSTs) und Carboxylesterasen (CES), untersucht werden kann. Dabei wurde auch eine Charakterisierung der Testsubstrate vorgenommen. Dar{\"u}ber hinaus wurden die Bioaktivierung von Clopidogrel und die Bildung von reaktiven Metaboliten untersucht. Aufgrund aktueller Diskussionen {\"u}ber die Interaktion zwischen Clopidogrel und Omeprazol wurde in dieser Arbeit die Bioaktivierung von Clopidogrel mit Hilfe von LC/MS/MS-Analysen und rekombinanten CYP-Enzymen sowie humanen Lebermikrosomen untersucht. Aufgrund der Instabilit{\"a}t des aktiven Metaboliten wurde in den inkubierten Proben eine Derivatisierung mit Dimedon durchgef{\"u}hrt. Die Untersuchungen zeigten, dass die Umwandlung zum 2-Oxo-Clopidogrel durch mehrere CYP-Enzyme erfolgt. Neben CYP2C19 sind CYP1A2, CYP2B6, CYP2C9 und CYP3A4 beteiligt. Anhand von selektiven Inhibitoren konnte CYP3A4 f{\"u}r die Bildung des aktiven Metaboliten aus 2-Oxo-Clopidogrel identifiziert werden. Neben der Biotransformation durch CYP-Enzyme wird haupts{\"a}chlich der Carbons{\"a}ureester des Clopidogrels hydrolysiert. Untersuchungen mit humanen Subzellfraktionen und rekombinanten Carboxylesterasen zeigen, dass die Esterhydrolyse durch CES1 katalysiert wird. Des Weiteren wurde der Metabolismus von Omeprazol untersucht. Es stellte sich heraus, dass die 5-Hydroxylierung und die 5-O-Demethylierung haupts{\"a}chlich durch CYP2C19 und CYP2D6 erfolgen. Dabei besitzt Omeprazol die h{\"o}chste Affinit{\"a}t zu CYP2C19. Die Bildung von Omeprazolsulfon wird hingegen nur durch CYP3A4 katalysiert. Mit Hilfe etablierter CYP-Inhibitionsassays wurde der Einfluss von Clopidogrel und Omeprazol auf neun verschiedene CYP-Enzyme untersucht. Durch Clopidogrel wurden CYP2B6 (IC50 = 6 nM), CYP2C19 (IC50 = 0.4 µM) und CYP1A2 (IC50 = 2.8 µM) gehemmt. Omeprazol inhibiert v. a. CYP2C19 (IC50 = 2 µM) und CYP3A4 (IC50 = 17 µM). Im Folgenden wurde auch der Einfluss von Omeprazol auf die Bildung von 2-Oxo-Clopidogrel untersucht. Die Bioaktivierung wurde allerdings erst bei einer Omeprazol-Konzentration von mehr als 10 µM beeinflusst. Am st{\"a}rksten wurde dabei CYP2C19 (IC50 ca. 100 µM) gehemmt. Aufgrund der recht schwachen Inhibition von CYP2C19 durch Omeprazol und der Tatsache, dass mehrere CYP-Enzyme die Bildung von 2-Oxo-Clopidogrel katalysieren, l{\"a}sst sich der Wirkungsverlust von Clopidogrel bei einer gleichzeitigen Einnahme von Omeprazol anhand der Ergebnisse der In-vitro-Versuche nicht durch eine Hemmung von CYP2C19 erkl{\"a}ren. Eine bisher nur wenig bei In-vitro-Interaktionsstudien untersuchte Klasse fremdstoffmetabolisierender Enzyme sind die Carboxylesterasen (CES), die v. a. bei der Bioaktivierung von Esterprodrugs eine wichtige Rolle spielen. F{\"u}r die Entwicklung von Inhibitionsassays wurden zun{\"a}chst verschiedene Modellsubstrate ausgew{\"a}hlt. Nach Inkubation dieser Substrate mit humanen Subzellfraktionen und rekombinanten Carboxylesterase-Enzymen wurden die Metaboliten mit Hilfe einer HPLC/UV-Analyse quantifiziert. Es zeigte sich, dass Methyl-4-nitrobenzoat und Mycophenolatmofetil selektiv durch CES1 hydrolysiert werden. Die Hydrolyse von Phenylacetat, p-Nitrophenylacetat und 4-Methylumbelliferylacetat wurde durch alle verwendeten Enzyme katalysiert. Dar{\"u}ber hinaus konnte eine Hydrolyse der aus Boswellia-Arten (Weihrauch) stammenden 3-O-Acetyl-11-keto--boswellias{\"a}ure durch CES2 beobachtet werden. Aufgrund der bei den meisten Modellsubstraten auftretenden Instabilit{\"a}t im Inkubationspuffer war eine Korrektur mit Hilfe von Blindproben erforderlich. Die Hydrolyse konnte durch Erniedrigung des pH-Wertes des Inkubationspuffers von 7.4 auf 6.5 und durch die Zugabe von Essigs{\"a}ure zur Stoppl{\"o}sung verlangsamt werden. Anschließend wurde die Beeinflussung der Hydrolyse von p-Nitrophenylacetat durch Pflanzenextrakte untersucht. Es zeigte sich, dass zahlreiche Extrakte die Esterasen aus der humanen Leber hemmten und die Aktivit{\"a}t bei einer Extraktkonzentration von 25-50 µg/ml weit unterhalb von 50 \% lag. Die Inhibition von CES durch Pflanzenextrakte stellt daher ein bisher unbekanntes Risiko f{\"u}r Arzneimittelinteraktionen dar. Cytochrom-P450-Enzyme (CYP-Enzyme) sind die wichtigste Gruppe fremdstoff-metabolisierender Enzyme. Zur Untersuchung der Beeinflussung dieser Enzyme durch neue Wirkstoffe werden daher standardm{\"a}ßig In-vitro-Interaktionsstudien durchgef{\"u}hrt. Von der Food and Drug Administration (FDA) wurden daher f{\"u}r jedes CYP-Enzym verschiedene Arzneistoffe als Testsubstrate vorgeschlagen. Zus{\"a}tzlich kommen bei solchen Untersuchungen Modellsubstrate zum Einsatz, deren Metaboliten fluoreszieren und die somit f{\"u}r ein Hochdurchsatz-Screening mit Hilfe von Mikrotiterplatten verwendet werden k{\"o}nnen. In dieser Arbeit wurde eine Reihe von Modellsubstanzen (Cumarin- und Harman-Derivate) auf ihre Eignung als Substrate f{\"u}r CYP-Inhibitionsassays untersucht. Nach der Entwicklung von Methoden zur Detektion der Metaboliten, die durch LC/MS/MS-Analysen oder durch HPLC/Fluoreszenzanalysen erfolgte, wurden die CYP-Enzyme identifiziert, die an der Umsetzung der Substrate beteiligt sind und mit Hilfe von CYP-Enzymen und humanen Lebermikrosomen wurden die Km-Werte der Substrate bestimmt. Die Untersuchungen zur Stabilit{\"a}t der CYP-Enzyme {\"u}ber 60 min zeigten, dass diese bei 37 °C stark an Aktivit{\"a}t verlieren, insbesondere CYP1A2. F{\"u}r eine maximale Umsetzungsgeschwindigkeit war eine NADPH-Konzentration von 1 mM ausreichend. Die Untersuchung von 14 Standardsubstraten ergab, dass die Mehrheit selektiv durch das entsprechende CYP-Enzym umgesetzt wird. Die Amodiaquin-N-deethylierung, die Tolbutamidhydroxylierung, die Chlorzoxazon-6-hydroxylierung und die 4-Nitrophenol-2-hydroxylierung wurden durch mehrere CYP-Enzyme katalysiert. Als Positivkontrollen f{\"u}r die Inhibitionsassays und zur Identifizierung der am Metabolismus beteiligten CYP-Enzyme werden von der FDA verschiedene Inhibitoren vorgeschlagen. Da nicht zu allen Inhibitoren Daten {\"u}ber deren Isoenzymselektivit{\"a}t vorliegen, wurde mit Hilfe der Assays die inhibitorische Aktivit{\"a}t von zw{\"o}lf Inhibitoren auf neun verschiedene CYP-Enzyme untersucht. Alle Inhibitoren hemmten das jeweilige angegebene CYP-Enzym. Bei Furafyllin (CYP1A2), Tranylcypromin (CYP2A6), Clopidogrel (CYP2B6), Montelukast (CYP2C8), Sulfaphenazol (CYP2C9), Chinidin (CYP2D6) und Ketoconazol (CYP3A4) konnte eine Konzentration ermittelt werden, bei der nur ein CYP-Enzym gehemmt wird. F{\"u}r Quercetin, Nootkaton, Diethyldithiocarbamat, Sertralin und Ticlopidin wurde eine Inhibition mehrerer CYP-Enzyme festgestellt. Mit Hilfe der CYP-Inhibitionsassays wurden Extrakte lebertoxischer Arzneipflanzen, wie z. B. Tussilago farfara (Huflattich) oder Chelidonium majus (Sch{\"o}llkraut), untersucht. Alle Extrakte hemmten konzentrationsabh{\"a}ngig die CYP-Enzyme, am st{\"a}rksten die Enzyme der Subfamilie CYP2C. Als In-vitro-Substrate f{\"u}r CYP-Inhibitionsassays werden aufgrund ihrer starken Fluoreszenz h{\"a}ufig Cumarin-Derivate eingesetzt. In dieser Arbeit wurden daher 18 O-alkylierte bzw. O-benzylierte Derivate von 7-Hydroxycumarin, 7-Hydroxy-4-methylcumarin und 7-Hydroxy-4-trifluormethylcumarin synthetisiert und die Umsetzung durch verschiedene CYP-Enzyme mit Hilfe der zuvor optimierten LC/LC/Fluoreszenz-basierten Assays untersucht. An der O-Desalkylierung der Cumarin-Derivate waren haupts{\"a}chlich CYP1A2, CYP2B6 und im geringeren Ausmaß CYP2C19, CYP2D6 und CYP2E1 beteiligt. Die h{\"o}chste Affinit{\"a}t besaßen die Substrate zu CYP1A2. Debenzylierungen wurden neben CYP1A2 haupts{\"a}chlich durch CYP3A4 katalysiert. Die h{\"o}chsten Umsetzungsgeschwindigkeiten wurden f{\"u}r die Debenzylierung von 7-Benzyloxy-4-methylcumarin (BMC, 14 pmol/pmol P450/min) und 7-Benzyloxy-4-trifluormethylcumarin (BFC, 9 pmol/pmol P450/min) beobachtet. F{\"u}r 7-Methoxy-4-trifluormethylcumarin (MFC) war die Umsetzungs¬geschwindigkeit f{\"u}r die O-Demethylierung mit CYP1A2 und CYP2B6 im Vergleich zu CYP2C9 deutlich h{\"o}her. MFC und 7-Ethoxy-4-trifluormethylcumarin (EFC) eignen sich daher v. a. f{\"u}r Inhibitionsuntersuchungen von CYP2B6. Bei den untersuchten 7 Alkyloxycumarinen handelt es sich in allen F{\"a}llen nicht um selektive CYP-Substrate. Sie k{\"o}nnen demnach nicht f{\"u}r Inhibitionsuntersuchungen mit humanen Lebermikrosomen verwendet werden. Ein Einsatz f{\"u}r Simultanbestimmungen der Hemmung mehrerer CYP-Enzyme in einem Versuch (Cocktail-Assay) ist aus diesem Grund ebenfalls nicht m{\"o}glich. Durch LC/MS-Analysen nach Inkubation der Cumarin-Derivate mit humanen Lebermikrosomen zeigte sich, dass neben den entsprechenden O Desalkylmetaboliten mehrere Hydroxymetaboliten entstehen und der O Desalkylmetabolit insbesondere bei Derivaten mit l{\"a}ngeren Alkylsubstituenten nicht der Hauptmetabolit ist. Ein Ziel der Arbeitsgruppe ist es zudem, neue In-vitro-Substrate zur Untersuchung der Inhibition von CYP-Enzymen mit besseren enzymkinetischen und analytischen Eigenschaften zu entwickeln. Grundstruktur hierf{\"u}r ist das -Carbolin, da -Carbolin-Derivate eine starke Fluoreszenz aufweisen. Von dem Naturstoff Harmin ist bekannt, dass dieser durch CYP1A2, CYP2C9, CYP2C19 und CYP2D6 O-demethyliert wird. Durch Modifizierung der Harman-Struktur sollte die CYP-Isoenzymselektivit{\"a}t f{\"u}r die O-Dealkylierung gesteigert werden und Substrate f{\"u}r weitere CYP-Enzyme erhalten werden. Hierf{\"u}r wurden in der Arbeitsgruppe u. a. 2-Benzyl-7-benzyloxyharman (BBH), 2-Benzyl-7-methoxyharman (BMH), 7-Methoxy-9-(4-carboxybenzyl)harman (MCBH) und 2-Methyl-7-methoxyharman (MMH) hergestellt. In dieser Arbeit wurden LC/LC/Fluoreszenz- und LC/MS/MS-Methoden zur Quantifizierung der aus diesen Derivaten entstehenden O-Desalkylmetaboliten entwickelt und die Substrate charakterisiert. Die Einf{\"u}hrung von Benzylsubstituenten an der phenolischen Hydroxylgruppe von Harmol (BBH) f{\"u}hrte zum Metabolismus durch CYP3A4 und die Substitution mit einem Carboxybenzylrest am Indolstickstoff (MCBH) verst{\"a}rkte die Selektivit{\"a}t zu den Enzymen der Subfamilie 2C. Durch die Methylierung des Pyridin-Stickstoffs des Harmins (MMH) wurde ein selektives Substrat f{\"u}r CYP2D6 erhalten, weshalb bei dieser Substanz auch humane Lebermikrosomen verwendet werden k{\"o}nnen. Durch die im Vergleich zu anderen CYP2D6-Substraten erhaltene hohe Umsetzungsgeschwindigkeit l{\"a}sst sich die Proteinkonzentration minimieren. F{\"u}r die {\"u}berwiegend an der O-Dealkylierung der Substrate beteiligten CYP-Enzyme wurden die Km-Werte ermittelt. Bei der Untersuchung von verschiedenen CYP-Inhibitoren zeigte sich, dass mit diesen Substraten vergleichbare IC50-Werte, wie mit den Standardsubstraten, erhalten werden. Die Harman-Derivate k{\"o}nnen daher zur Untersuchung der Inhibition wichtiger CYP-Enzyme eingesetzt werden und bieten eine Alternative zu den bisher vorhandenen Fluoreszenz-Substraten. Durch die Einstellung des pH-Wertes im Anschluss an die Inkubation lassen sich die Metaboliten ebenfalls fluorimetrisch in der Mikrotiterplatte detektieren und k{\"o}nnen f{\"u}r ein Hochdurchsatz-Screening eingesetzt werden. Allerdings m{\"u}ssen die Fluoreszenzeigenschaften weiter verbessert werden, um eine kontinuierliche Bestimmung w{\"a}hrend der Inkubation zu erm{\"o}glichen. In der pharmazeutischen Industrie besteht ein großes Interesse an der Detektion von reaktiven Metaboliten, um eine potentielle Lebertoxizit{\"a}t von neuen Wirkstoffen vorhersagen zu k{\"o}nnen. Hierf{\"u}r werden die Testsubstanzen mit humanen Lebermikrosomen inkubiert und die reaktiven Metaboliten mit Glutathion abgefangen. Zur Optimierung der LC/MS/MS-Analysen wurde in dieser Arbeit die Fragmentierung solcher Addukte anhand von Standardsubstanzen untersucht. Bei allen untersuchten Glutathion-Addukten trat eine Abspaltung der Pyroglutamins{\"a}ure bei positiver Polarit{\"a}t mit einer vergleichbaren Signalintensit{\"a}t auf, weshalb eine Detektion dieses Fragmentes durch einen Neutral-Loss-Scan am besten geeignet erschien. Mit Hilfe der Screening-Methode wurden zuerst Arzneistoffe untersucht, von denen reaktive Metaboliten bekannt sind. F{\"u}r die Bioaktivierung von Clozapin konnten CYP1A2, CYP2D6 und CYP3A4 identifiziert werden, w{\"a}hrend die Toxifizierung von Paracetamol haupts{\"a}chlich durch CYP1A2 und CYP3A4 erfolgte. Auff{\"a}llig war, dass mit steigender Paracetamolkonzentration keine S{\"a}ttigung der Umsetzung auftrat. Durchgef{\"u}hrte Molek{\"u}lver{\"a}nderungen am Glutathion, wie die Einf{\"u}hrung eines Dansylrestes oder eines Biotins, f{\"u}hrten zu keiner deutlichen Verbesserung der Detektion der reaktiven Metaboliten. Dar{\"u}ber hinaus zeigte sich, dass bei den markierten GSH-Derivaten die Umsetzung durch GSTs erheblich reduziert ist. Mit der Screening-Methode wurden allerdings viele falsch positive Signale erhalten, so dass diese nicht f{\"u}r eine Untersuchung von Extrakten lebertoxischer Pflanzen eingesetzt werden konnte. F{\"u}r eine eindeutige und schnelle Identifizierung der Signale als Glutathion-Addukte ist daher die hochaufl{\"o}sende Massenspektrometrie erforderlich. Eine weitere Klasse fremdstoffmetabolisierender Enzyme sind die Glutathion-S-Transferasen (GSTs), {\"u}ber deren Inhibition durch Arzneistoffe und Pflanzenextrakte in der Literatur nur wenige Daten vorliegen. Zur Entwicklung von Inhibitionsassays wurden die in der Literatur beschriebenen Substrate 1-Chlor-2,4-dinitrobenzol, 4 Nitrochinolin-N-oxid, 1,2-Dichlor-4-nitrobenzol und 4-Nitrobenzylchlorid verwendet. Die Detektion der Metaboliten erfolgte im Gegensatz zu der h{\"a}ufig eingesetzten Photometrie mit Hilfe der HPLC/UV- bzw. einer LC/MS/MS-Analyse. F{\"u}r die Kalibrierung wurden zun{\"a}chst die entsprechenden Glutathionkonjugate aus den Substraten synthetisiert. Bei den durchgef{\"u}hrten diskontinuierlichen Assays stellte die h{\"a}ufig auftretende nichtenzymatische Reaktion der Substrate mit Glutathion ein Problem dar. Durch die Erniedrigung des pH-Wertes des Inkubationspuffers von 7.4 auf 6.5 und der Senkung der Inkubationstemperatur von 37 °C auf 25 °C konnte die nichtenzymatische Reaktion w{\"a}hrend der Inkubation erheblich verlangsamt werden. Die nichtenzymatische Reaktion nach der Inkubation konnte durch Zugabe von Oxidationsmitteln gestoppt werden. Von den getesteten humanen Lebersubzell¬fraktionen besaß die cytosolische Fraktion bei allen Substraten die h{\"o}chste Aktivit{\"a}t. Im Rahmen der Assayentwicklung wurde die Glutathion-, die Proteinkonzentration und die Inkubationszeit optimiert. Es wurden die Km- und Vmax-Werte f{\"u}r die Umsetzung der Substrate ermittelt. Als Positivkontrolle diente das ebenfalls synthetisierte Glutathionkonjugat der Etacryns{\"a}ure, f{\"u}r das die IC50-Werte mit jedem Substrat bestimmt wurden. Dabei konnte ein Einfluss des pH-Wertes des Inkubationspuffers und der Inkubationstemperatur auf die gemessene inhibitorische Aktivit{\"a}t beobachtet werden. Anschließend wurde ein Screening von Arzneistoffen, ausgew{\"a}hlten Naturstoffen und etwa 50 Pflanzenextrakten auf eine Inhibition der GSTs in humanem Lebercytosol mit 1-Chlor-2,4-dinitrobenzol, das am schnellsten von allen Substraten umgesetzt wurde, durchgef{\"u}hrt. Von den getesteten Naturstoffen fiel eine ausgepr{\"a}gte Hemmung durch Biflavonoide auf. Nahezu alle untersuchten Pflanzenextrakte hemmten die GSTs. Eine starke Inhibition der GSTs zeigten Extrakte aus Cinnamomum cassia (Zimt), die sich als nicht-kompetitiv herausstellte. Weiterhin wurde eine starke Hemmung der Extrakte gerbstoffhaltiger Pflanzen, wie z. B. Hamamelis virginiana (virginische Zaubernuss) oder Krameria triandra (Ratanhia), beobachtet. Hier resultierten IC50-Werte zwischen 5 und 30 µg/ml. Ein Vergleich verschiedener Methoden zur Detektion des Metaboliten 2,4 Dinitrophenyl-S-glutathion zeigte, dass die Photometrie f{\"u}r die Untersuchung der Inhibition von Pflanzenextrakten aufgrund der St{\"o}rung durch die Pflanzenmatrix ungeeignet ist. Mit Hilfe der verwendeten HPLC/UV- sowie der LC/MS/MS-Analyse konnte der Metabolit selektiv erfasst werden und reproduzierbare Ergebnisse f{\"u}r die Inhibition der GSTs durch Pflanzenextrakte erzielt werden. Neben den GSTs wurde auch die Beeinflussung der Glutathionreduktase (GR) in dieser Arbeit untersucht. Hierf{\"u}r wurde ein HPLC-basierter Assay entwickelt, bei dem das reduzierte Glutathion mit 5,5´-Dithiobis(2-nitrobenzoes{\"a}ure) derivatisiert und das entstandene gemischte Disulfid aus Glutathion und 5-Thio-2-nitrobenzoes{\"a}ure quantifiziert wurde. Zur Untersuchung der Inhibition durch Pflanzenextrakte wurde humanes Lebercytosol verwendet, das von allen humanen Lebersubzellfraktionen die h{\"o}chste Aktivit{\"a}t besaß. Im Vergleich zu den GSTs wurde die GR durch die {\"u}berwiegende Zahl der ausgew{\"a}hlten Pflanzenextrakte kaum gehemmt. Eine nennenswerte Inhibition der GR konnte nur bei Extrakten von Juglans regia (Walnuss) beobachtet werden. Fazit In dieser Arbeit wurden eine Reihe von In-vitro-Methoden zur Untersuchung der Inhibition von CYP-Enzymen und weiteren fremdstoffmetabolisierenden Enzymen, wie CES oder GSTs, entwickelt. Aufgrund der dabei angewendeten selektiven HPLC-basierten Quantifizierung der Metaboliten durch UV-, Fluoreszenz- oder MS-Detektion k{\"o}nnen mit diesen Methoden auch Proben mit komplexer Matrix untersucht werden. F{\"u}r alle Assays wurden die Inkubationsbedingungen optimiert und die enzymkinetischen Parameter vieler Substrate ermittelt. Dar{\"u}ber hinaus wurden wichtige Erkenntnisse {\"u}ber die Isoenzymselektivit{\"a}t dieser Substrate gewonnen. Die Eignung der Assays wurde anhand von Standardinhibitoren bewiesen. Schließlich wurde die inhibitorische Aktivit{\"a}t von zahlreichen Pflanzenextrakten bestimmt, deren Auswirkung auf fremdstoffmetabolisierende Enzyme bisher unbekannt war. Die in dieser Arbeit beschriebenen Methoden k{\"o}nnen f{\"u}r die Untersuchung des Metabolismus von Arzneistoffen und der Inhibition fremdstoffmetabolisierender Enzyme, die f{\"u}r eine Zulassung neuer Wirkstoffe erforderlich ist, routinem{\"a}ßig eingesetzt werden.},
  subject      = {Xenobiotikum},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Wettstein2020,
  author    = {Wettstein, Lars},
  title     = {Elektrochemische Abscheidung von Bruschitschichten auf Titan in Gegenwart von Kristallisationsinhibitoren zur Steuerung von Kristallitgr{\"o}ße und biologischer Reaktion},
  doi       = {10.25972/OPUS-21750},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-217502},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2020},
  abstract  = {Es erfolgte eine elektrochemische Abscheidung von Bruschitschichten auf Titan in Gegenwart von Kristallisationsinhibitoren. Dabei wurden die Kristallisationsinhibitoren Zitronens{\"a}ure, treta-Natriumdiphosphat-Decahydrat und Phytins{\"a}ure verwendet und die entstandenen Schichten mit denen ohne Inhibitorzugabe verglichen. Um das Ausmaß der Inhibierung zu verifizieren, wurde die Masse aller Schichten gemessen, welche f{\"u}r die Inhibition mit Zitronens{\"a}ure und Phytins{\"a}ure abnahm und f{\"u}r Natriumdiphosphat zunahm. Die kristallographische Zusammensetzung der mit und ohne Inhibierung abgeschiedenen Schichten wurde mit Hilfe der R{\"o}ntgendiffraktometrie bestimmt und zeigte, dass sich reine Bruschitschichten mit unterschiedlichem amorphem Anteil abschieden. Die daraus entstandenen Werte lieferten zugleich die Informationen {\"u}ber die einzelnen Kristallitgr{\"o}ßen innerhalb der Schichten. {\"U}ber den Einfluss der Inhibitoren auf die Schichtmorphologie gaben rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen weiteren Aufschluss. Die Inhibition verursachte teils mit Rissen durchzogene Schichten, deren Kristallformationen sich von Standardelektrolyt unterschieden. Ausgew{\"a}hlte Proben wurden unter verschiedenen Bedingungen desinfiziert bzw. sterilisiert und nachfolgend erneut gewogen und mittels R{\"o}ntgendiffraktogrammetrie und Rasterelektronenmikroskopie analysiert. Nach der Desinfektion entstanden reine Bruschitschichten, die an Masse verloren aber trotzdem die typischen Kristallformationen zeigten. Die Sterilisation f{\"u}hrte zur Umwandlung von Bruschit in Monetit und Hydroxylapatit. Des Weiteren wurde die biologische Reaktion der Schichten auf humane f{\"o}tale Osteoblasten-Zelllinien zur {\"U}berpr{\"u}fung der Zellvertr{\"a}glichkeit ermittelt. Die entstandenen Ergebnisse waren nicht verwertbar und enthielt sehr hohe Standardabweichungen.},
  subject      = {Elektrochemische Abscheidung},
  language  = {de}
}