@phdthesis{Bender2007,
  author    = {Bender, Florian Lothar Paul},
  title     = {Aufkl{\"a}rung des Pathomechanismus bei der pmn-Mausmutante, einem Mausmodell f{\"u}r Motoneuronerkrankungen},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-23711},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2007},
  abstract  = {Die pmn-Maus dient als Modell f{\"u}r degenerative Motoneuronerkrankungen: W{\"a}hrend heterozygote M{\"a}use klinisch unauff{\"a}llig sind, entwickeln homozygote einige Anzeichen, wie man sie auch bei humanen Motoneuronerkrankungen findet. Ab der 2. postnatalen Woche weisen sie eine progrediente Schw{\"a}che der Hinterl{\"a}ufe auf. Innerhalb kurzer Zeit sind auch andere Muskelgruppen betroffen, was zwischen der 4. und 6. postnatalen Woche zum Tod durch Atemversagen f{\"u}hrt. Verantwortlich f{\"u}r die Erkrankung der pmn-M{\"a}use ist eine Punktmutation im Tubulin-spezifischen Chaperon E (tbce) Gen, die zu einem Aminos{\"a}ureaustausch an einer evolution{\"a}r konservierten Aminos{\"a}ure im TBCE-Protein f{\"u}hrt. TBCE wird ubiquit{\"a}r exprimiert und spielt eine Rolle bei der Assemblierung der Mikrotubuli. Ph{\"a}notypisch sind von der Mutation spezifisch Motoneurone betroffen. Nach der Herstellung und Charakterisierung eines Antiserums gegen TBCE war es m{\"o}glich, nach Unterschieden zwischen pmn-mutierten und wildtypischen Motoneuronen hinsichtlich der Stabilit{\"a}t und der subzellul{\"a}ren Lokalisation des TBCE Proteins zu suchen. Western Blot Analysen mit R{\"u}ckenmarkslysaten von vier Wochen alten pmn-M{\"a}usen zeigen eine deutliche Reduktion der TBCE-Expression. Mittels Immunfluoreszenz waren in isolierten embryonalen Motoneuronen indes keine Unterschiede hinsichtlich der Expressionsst{\"a}rke und der subzellul{\"a}ren Lokalisation festzustellen. Das TBCE-Protein wird {\"u}berwiegend im Zellsoma exprimiert und befindet sich dort im Golgi-Apparat und an den Centrosomen, die als Generatoren der axonalen Mikrotubuli angesehen werden. Obwohl mittels Immunfluoreszenz zu diesem Zeitpunkt keine Unterschiede detektierbar sind, weisen die pmn-mutierten Motoneurone nach sieben Tagen in Kultur einige axonale Pathologien auf, wenn sie in Gegenwart des neurotrophen Faktors BDNF kultiviert werden: Das L{\"a}ngenwachstum der Axone ist deutlich reduziert und entlang der Axone finden sich zahlreiche axonale Schwellungen mit Proteinaggregaten. Elektronenmikroskopisch findet sich eine Reduktion der Mikrotubulianzahl im proximalen Axonabschnitt, w{\"a}hrend die medialen und distalen Teile eine unver{\"a}nderte Anzahl an Mikrotubuli aufweisen. Parallel findet sich in allen Axonabschnitten der pmn-mutierten Motoneurone eine deutliche Zunahme an Neurofilamenten. Neben den morphologischen Ver{\"a}nderungen weisen die Motoneurone aus pmn-M{\"a}usen zu diesem Zeitpunkt auch eine St{\"o}rung im axonalen Transport der Mitochondrien auf, die in den Axonen saltatorisch und bidirektional entlang von Mikrotubuli transportiert werden, auf. So ist die Anzahl station{\"a}rer Mitochondrien in pmn-mutierten Motoneuronen signifikant erh{\"o}ht, w{\"a}hrend die Anzahl an transportierten Mitochondrien und deren maximale Transportgeschwindigkeit reduziert ist. Die morphologischen Ver{\"a}nderungen und die St{\"o}rungen im axonalen Transport k{\"o}nnen kompensiert werden, wenn die pmn-mutierten Motoneurone statt mit BDNF mit dem neurotrophen Faktor CNTF kultiviert werden. Die Effekte von CNTF auf das L{\"a}ngenwachstum der Axone ist STAT3 vermittelt, da pmn-mutierte Motoneurone mit einer STAT3-Defizienz keine Reaktion mehr auf die Gabe von CNTF zeigen. Da STAT3 direkt mit Stathmin interagieren kann und dessen destabilisierende Wirkung auf Mikrotubuli dadurch verhindert, wurde angenommen, dass die STAT3 vermittelten CNTF Effekte auf eine lokale Wirkung von STAT3 in Axonen zur{\"u}ckzuf{\"u}hren ist. Diese Hypothese wird dadurch gest{\"u}tzt, dass die Herunterregulation der Stathmin Expression in pmn-mutierten Motoneuronen den gleichen Effekt auf das L{\"a}ngenwachstum zeigt, wie eine CNTF Gabe w{\"a}hrend der Kultivierung.},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Frank2015,
  author    = {Frank, Nicolas Clemens},
  title     = {Lokale axonale Wirkungen der CNTF-STAT3 Signalkaskade in Motoneuronen der pmn Maus - einem Mausmodel f{\"u}r die Amyotrophe Lateralsklerose},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-121065},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2015},
  abstract  = {1. Zusammenfassung W{\"a}hrend der Embryogenese und nach Verletzungen von Nerven regulieren neurotrophe Faktoren Signalwege f{\"u}r Apoptose, Differenzierung, Wachstum und Regeneration von Neuronen. In vivo Experimente an neugeborenen Nagern haben gezeigt, dass der Verlust von Motoneuronen nach peripherer Nervenl{\"a}sion durch die Behandlung mit GDNF, BDNF, und CNTF reduziert werden kann In der pmn-Mausmutante, einem Modell f{\"u}r die Amyotrophe Lateralsklerose, f{\"u}hrt die Gabe von CNTF, nicht aber von GDNF zu einem verz{\"o}gerten Krankheitsbeginn und einem verlangsamten Fortschreiten der Motoneuronendegeneration. Ausl{\"o}ser der Motoneuronendegeneration in der pmn-Maus ist eine Mutation im Tubulin spezifischen Chaperon E (Tbce) Gen, das f{\"u}r eines von f{\"u}nf Tubulin spezifischen Chaperonen (TBCA-TBCE) kodiert und an der Bildung von -Tubulinheterodimeren beteiligt ist. Diese Arbeit sollte dazu beitragen, die CNTF-induzierten Signalwege zu entschl{\"u}sseln, die sich lindernd auf den progredienten Verlauf der Motoneuronendegeneration in der pmn-Maus auswirken. Prim{\"a}re pmn mutierte Motoneurone zeigen ein reduziertes Axonwachstum und eine erh{\"o}hte Anzahl axonaler Schwellungen mit einer anomalen H{\"a}ufung von Mitochondrien - ein fr{\"u}hes Erkennungsmerkmal bei ALS-Patienten. Die Applikation von CNTF nicht aber von BDNF oder GDNF, kann in vitro die beobachteten Wachstumsdefekte und das bidirektionale axonale Transportdefizit in pmn mutierten Motoneurone verhindern. Aus {\"a}lteren Untersuchungen war bekannt, dass CNTF {\"u}ber den dreiteiligen transmembranen Rezeptorkomplex, bestehend aus CNTFR, LIFR und gp130, Januskinasen aktiviert, die STAT3 an Tyrosin 705 phosphorylieren (pSTAT3Y705). Ich konnte beobachten, dass axonales fluoreszenzmarkiertes pSTAT3Y705 nach CNTF-Gabe nicht retrograd in den Nukleus transportiert wird. Stattdessen f{\"u}hrt die CNTF-induzierte Phosphorylierung von STAT3 an Tyrosin 705 zu einer transkriptionsunabh{\"a}ngigen lokalen Reaktion im Axon. Diese pSTAT3Y705 abh{\"a}ngige Reaktion ist notwendig und ausreichend, um das reduzierte Axonwachstum pmn mutierter Motoneurone zu beheben. Wie die Kombination einer CNTF Behandlung mit dem shRNA vermittelten knock-down von Stathmin in pmn mutierten Motoneuronen zeigt, zielt die CNTF-STAT3 Signalkaskade auf die Stabilisierung axonaler Mikrotubuli ab und wirkt sich positiv auf die anterograde und retrograde Mobilit{\"a}t von axonalen Mitochondrien aus. Interessanter Weise konnte ich außerdem feststellen, dass eine akute Gabe von CNTF das mitochondriale Membranpotential in Axonen prim{\"a}rer pmn mutierter und wildtypischer Motoneurone erh{\"o}ht und einen Anstieg von ATP ausl{\"o}st. Meine Beobachtungen legen nahe, dass CNTF unerwarteter Weise auch eine transiente Phosphorylierung an STAT3 Serin 727 (pSTAT3S727) ausl{\"o}st, die zur anschließenden Translokation von pSTAT3S727 in Mitochondrien f{\"u}hrt. Diese Ergebnisse zeigen, dass STAT3 mehrere lokale Ziele im Axon besitzt, n{\"a}mlich axonale Mikrotubuli und Mitochondrien.},
  subject      = {Motoneuron},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Schust2006,
  author    = {Schust, Jochen},
  title     = {Neue Ans{\"a}tze zur Identifizierung niedermolekularer Inhibitoren der STAT3-Aktivierung und -Homodimerisierung},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-19952},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2006},
  abstract  = {Die STATs (signal transducers and activators of transcription) sind eine Familie latent zytoplasmatischer Transkriptionsfaktoren, die Signale von der Zellmembran in den Zellkern weiterleiten. Ein Mitglied der Proteinfamilie, STAT3, ist aufgrund {\"u}berm{\"a}ßiger Tyrosinkinase-Aktivit{\"a}t in einer breiten Vielzahl von Krebszelllinien und menschlichen Tumoren konstitutiv-aktiv. Um kleine organische Molek{\"u}le zu identifizieren, die die Funktion der SH2-Dom{\"a}ne von STAT3 blockieren und dadurch die Aktivit{\"a}t und die Dimerisierung des Proteins inhibieren, wurde ein Hochdurchsatz-Verfahren entwickelt, welches auf Fluoreszenzpolarisation beruht. Das Prinzip dieses Verfahrens war die Bindung eines Fluorescein-markierten Phosphotyrosin-Peptids, welches von gp130, einer Untereinheit des Interleukin-6-Rezeptors, abgeleitet war, an nicht phosphoryliertes STAT3-Protein. Der Kd Wert dieser Bindung betrug 150 nM und der Assay war stabil im Hinblick auf die Salzkonzentration, der Konzentration an Dimethylsulfoxid und der Zeit. Der Assay wurde auf ein 384-Lochplattenformat angepasst und wies einen Z'-Wert von 0,87 auf. Das Fluorscein-markierte Phosphotyrosin-Peptid band spezifisch an die SH2-Dom{\"a}ne von STAT3 und die Bindung konnte durch Phosphotyrosin-Peptide unterschiedlich stark inhibiert werden. Die Hochdurchsatz-Analyse mehrerer Substanzbibliotheken f{\"u}hrte schließlich zur Identifikation eines spezifischen STAT3-Inhibitors, Stattic (STAT three inhibitory compound). Stattic ist das erste nicht-peptidische kleine Molek{\"u}l, welches selektiv die Funktion der STAT3-SH2-Dom{\"a}ne beeintr{\"a}chtigte. Dabei spielte der Aktivierungszustand von STAT3 in vitro keine Rolle. Die gleichzeitige Inkubation mit Stattic f{\"u}hrte im Fluoreszenzpolarisations-Assay zur Inhibition der Bindung des Fluorescein-markierten Phosphotyrosin-Peptids an die SH2-Dom{\"a}ne von STAT3. Diese antagonistische Reaktion stellte sich als stark temperaturabh{\"a}ngig heraus und hatte in vitro bei der physiologisch relevanten Temperatur von 37°C nach 60 Minuten einen IC50 Wert von 5,1 µM. Zusammen mit einer Abh{\"a}ngigkeit von der Zeit wiesen die Ergebnisse auf eine irreversibel ablaufende Reaktion unter Kn{\"u}pfung einer kovalenten Bindung zwischen Stattic und STAT3 hin. Die Inhibition war spezifisch gegen{\"u}ber der Bindung verschiedener Fluorescein-markierten Phosphotyrosin-Peptide an die jeweiligen Proteine STAT1, STAT5b und Lck und Stattic hatte ebenfalls nur einen sehr geringen Effekt auf die Proteindimerisierung von c-Myc/Max und Jun/Jun. Die genauere Betrachtung der Kinetik der antagonistischen Reaktion zeigte eine signifikante Verlangsamung der Reaktionsgeschwindigkeit beim Vergleich zwischen STAT3 und STAT1 bzw. STAT3 und STAT5b. Die Inhibierung der Bindung des entsprechenden Fluorescein-markierten Phosphotyrosin-Peptids an das Protein Lck durch Stattic war hingegen nicht zeitabh{\"a}ngig. Diese Versuche zeigten eine deutliche Pr{\"a}ferenz der Bindung von Stattic an das Protein STAT3. Die Verdr{\"a}ngung des Fluorescein-markierten Phosphoytrosin-Peptids von der STAT3-SH2-Dom{\"a}ne durch Stattic verlief kompetitiv zur Inhibition mit einem Phophotyrosin-Peptid, welches an die SH2-Dom{\"a}ne von STAT3 bindet. In Verbindung mit den vorherigen Experimenten wies dies auf eine kovalente Bindung von Stattic innerhalb des STAT3-Proteins hin. Eine abschließende Struktur-Wirkungs-Beziehung in vitro zeigte die Notwendigkeit sowohl von der Nitrogruppe als auch von der Doppelbindung der Vinylsulfongruppe in Stattic f{\"u}r die Bindung an STAT3 und untermauerte die These, dass Stattic kovalent innerhalb des STAT3-Proteins bindet. In zellbiologischen Systemen wurde die Wirksamkeit von Stattic anhand verschiedener molekularbiologischer Assays best{\"a}tigt. Stattic inhibierte selektiv die Tyrosinphosphorylierung von STAT3 in HepG2 Zellen, in NIH3T3/v-Src Zellen und in den Brustkrebszelllinien MDA-MB-231 und MDA-MB-435S. Aber auch bereits phosphorylierte STAT3-Proteine wurden durch Stattic in vitro an der Homodimerisierung gehindert, was in einer EMSA-Analyse gezeigt wurde. Somit inhibierte Stattic in vitro selektiv die Signalkette von STAT3 unabh{\"a}ngig von dessen Aktivierungszustand. Andere Signalketten oder die Funktion der in der Signalkette {\"u}ber STAT3 liegenden Tyrosinkinasen wurden in Zellen nicht beeinflusst. Im Folgenden konnte demonstriert werden, dass Stattic als direkter STAT3-Inhibitor dessen Lokalisierung in den Zellkern inhibierte, nicht jedoch die Lokalisierung des Gegenspielers STAT1. Weiterhin reduzierte der Einsatz von Stattic selektiv das von v-Src in NIH3T3 Zellen induzierte und von STAT3-abh{\"a}ngige Wachstum von Kolonien in Weichagar. Dass Stattic schließlich selektiv die Apoptoserate in Zellen mit konstitutiver STAT3-Aktivt{\"a}t erh{\"o}hte, best{\"a}tigte die bisherigen Daten. Mit Stattic konnte daher ein neues biologisches Werkzeug generiert werden, um selektiv STAT3 in Zelllinien oder Tumoren in Tiermodellen auszuschalten, die eine konstitutive STAT3-Aktivit{\"a}t aufweisen.},
  subject      = {STAT},
  language  = {de}
}