@phdthesis{Schulz2006,
  author    = {Schulz, Franziska},
  title     = {Synthese und Testung von Aziridin-2-carboxylaten als Cystein-Protease-Inhibitoren},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-19891},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2006},
  abstract  = {Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, eine neue Struktur abgeleitet von den potenten Aziridin-2,3-dicarboxylaten zu synthetisieren und diese dann an verschiedenen humanen und parasit{\"a}ren Cystein-Proteasen zu testen. Daf{\"u}r wurde als Baustein die Aziridin-2-carbons{\"a}ure gew{\"a}hlt, die an C3-Position unsubstituiert ist und an C2-Position eine Carboxyl-Funktion tr{\"a}gt. Außerdem sollte der Ringstickstoff im Gegensatz zu den bisher bekannten N-acylierten Aziridin-2,3-dicarboxylaten basische Eigenschaften besitzten. Die Struktur der synthetisierten Azridin-2-carboxylate ist daher wie folgt gew{\"a}hlt worden: Die durch Cromwell-Synthese erhaltenen Verbindungen wurden als Racemate oder als Diastereomerengemische erhalten. Dabei wurden die Diastereomeren-Verh{\"a}ltnisse der einzelnen Verbindungen {\"u}ber die Integrale in den 1H-NMR-Spektren bestimmt. Die an Position R3 mit einer Aminos{\"a}ure substituierten Aziridin-2-carboxylate wurden durch eine Modifikation der Cromwell-Synthese erhalten. Es wurden insgesamt 27 Azridin-2-carboxylate synthetisiert, die dann an verschiedenen Proteasen getestet wurden. Zu den getesteten Cystein-Proteasen geh{\"o}ren die parasit{\"a}ren Enzyme Falcipain 2, 3 und Rhodesain, die virale SARS-CoV Mpro und die humanen Proteasen Cathepsin B und L. Es wurde jeweils ein Screening der Substanzen an den Proteasen durchgef{\"u}hrt. Bei den wirksamen Verbindungen wurden dann die Ki-, ki-, k2nd- oder IC50-Werte bestimmt. Außerdem wurden die Substanzen auch an der SAP2, einer Aspartat-Protease aus Candida albicans, getestet, an der sie allerdings kaum eine Hemmwirkung zeigten. Bei den nicht-selektiven Inhibitoren stellte sich die Verbindung 9.1a, die auch an Rhodesain eine gute Aktivit{\"a}t besitzt, als ein noch potenterer Inhibitor heraus. Haupts{\"a}chlich zeigten an Rhodesain Verbindungen eine gute Hemmwirkung, die N\&\#949;- oder N\&\#945;-gesch{\"u}tztes Lysin-, Phenylalanin- oder Asparagins{\"a}ureester als Substituenten enthalten. Dabei waren die Verbindungen 9.1a/b, 4.9b und 4.8a/b die potentesten Inhibitoren am Rhodesain und 9.1b, 9.2, 4.4b und 4.8b an Falcipain 2 und 3. An der SARS-CoV Mpro hemmte die Verbindung 9.1b am besten. Es wurde weiterhin die Abh{\"a}ngigkeit der Aktivit{\"a}t der parasit{\"a}ren Cystein-Protease Rhodesain vom pH-Wert bestimmt, indem die Fluoreszenzzunahme durch die hydrolytische Spaltung des Substrates durch das Enzym bei pH-Werten zwischen 2.5 und 8.0 {\"u}ber 30 min vermessen wurde. Dabei zeigte sich, dass das Rhodesain in einem sehr weiten pH-Bereich von 3.0 - 8.0 eine sehr hohe Aktivit{\"a}t aufweist (80 - 100 \%) und erst im relativ sauren Bereich bei pH 2.5 die Aktivit{\"a}t nachl{\"a}sst (~ 60 \%). Außerdem wurde auch die Hemmung von Rhodesain durch 9.1b in Abh{\"a}ngigkeit vom pH-Wert analysiert, wobei die Hemmst{\"a}rke im sauren pH-Bereich durch die Protonierung des Stickstoffes des Aziridinringes sehr stark zunahm. Im Rahmen des SFB630 („Erkennung, Gewinnung und funktionale Analyse von Wirkstoffen gegen Infektionskrankheiten") konnten viele der synthetisierten Verbindungen an verschiedenen Krankheitserregern, wie Trypanosoma brucei brucei, Leishmania major, sowie an sog. Problemkeimen, zu denen die gram-negativen Erreger Pseudomonas aeruginosa und Escheria coli, sowie die gram-positiven Staphylococcus-Arten S. aureus (Linie 325, 8325) und S. epidermidis (Linie RP62) geh{\"o}ren, untersucht werden. Dabei stellten sich die Verbindungen 9.1a/b an Trypanosoma brucei brucei als wirksame Inhibitoren gegen den Erreger heraus. Dies korreliert auch sehr gut mit der hohen Aktivit{\"a}t der beiden Verbindungen gegen Rhodesain (9.1a: Ki: 15.41 µM; 9.1b: Ki: 2.99 µM), wobei die Verbindung 9.1b allerdings an Makrophagen toxisch wirkte (9.1b: IC50: 80 µM). Außerdem war 9.1b auch ein Inhibitor des Wachstumes und der Biofilmbildung von S. aureus. Gegen{\"u}ber Plasmodium falciparum zeigten die Verbindungen 4.9a/b (4.9a: IC50: 0.5 µM; 4.9b: IC50: 2.2 µM) und 9.4 (9.4: IC50: 1.7 µM) die gr{\"o}ßte Aktivit{\"a}t, wobei allerdings diese Verbindungen keine Hemmung an den Falcipainen aufwiesen und somit das Target der Inhibition noch ungekl{\"a}rt ist. Im Rahmen eines Auslandsaufenthaltes in der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Philip Rosenthal, San Francisco, California, wurde außerdem ein Screening verschiedener im Arbeitskreis synthetisierter Substanzklassen an Falcipain 2, 3 und an Plasmodium falciparum durchgef{\"u}hrt. Die dabei getesteten Substanzklassen sind in Abb. 6.1 aufgezeigt. Die Aziridin-2,3-dicarboxylate II-c, I-v und I-j zeigten dabei die beste Aktivit{\"a}t, sowohl an den Falcipainen als auch an dem Parasiten. Unter den Epoxiden und an Position C3 substituierten Aziridin-2-carboxylaten ist die Verbindung IV-2 die einzige, die eine Hemmwirkung aufweist. Unter den anderen getesten Verbindungen zeigten nur die Ethacryns{\"a}ure-Derivate VII-b und VII-f eine antiplasmodiale Aktivit{\"a}t.},
  subject      = {Aziridine},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Schust2006,
  author    = {Schust, Jochen},
  title     = {Neue Ans{\"a}tze zur Identifizierung niedermolekularer Inhibitoren der STAT3-Aktivierung und -Homodimerisierung},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-19952},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2006},
  abstract  = {Die STATs (signal transducers and activators of transcription) sind eine Familie latent zytoplasmatischer Transkriptionsfaktoren, die Signale von der Zellmembran in den Zellkern weiterleiten. Ein Mitglied der Proteinfamilie, STAT3, ist aufgrund {\"u}berm{\"a}ßiger Tyrosinkinase-Aktivit{\"a}t in einer breiten Vielzahl von Krebszelllinien und menschlichen Tumoren konstitutiv-aktiv. Um kleine organische Molek{\"u}le zu identifizieren, die die Funktion der SH2-Dom{\"a}ne von STAT3 blockieren und dadurch die Aktivit{\"a}t und die Dimerisierung des Proteins inhibieren, wurde ein Hochdurchsatz-Verfahren entwickelt, welches auf Fluoreszenzpolarisation beruht. Das Prinzip dieses Verfahrens war die Bindung eines Fluorescein-markierten Phosphotyrosin-Peptids, welches von gp130, einer Untereinheit des Interleukin-6-Rezeptors, abgeleitet war, an nicht phosphoryliertes STAT3-Protein. Der Kd Wert dieser Bindung betrug 150 nM und der Assay war stabil im Hinblick auf die Salzkonzentration, der Konzentration an Dimethylsulfoxid und der Zeit. Der Assay wurde auf ein 384-Lochplattenformat angepasst und wies einen Z'-Wert von 0,87 auf. Das Fluorscein-markierte Phosphotyrosin-Peptid band spezifisch an die SH2-Dom{\"a}ne von STAT3 und die Bindung konnte durch Phosphotyrosin-Peptide unterschiedlich stark inhibiert werden. Die Hochdurchsatz-Analyse mehrerer Substanzbibliotheken f{\"u}hrte schließlich zur Identifikation eines spezifischen STAT3-Inhibitors, Stattic (STAT three inhibitory compound). Stattic ist das erste nicht-peptidische kleine Molek{\"u}l, welches selektiv die Funktion der STAT3-SH2-Dom{\"a}ne beeintr{\"a}chtigte. Dabei spielte der Aktivierungszustand von STAT3 in vitro keine Rolle. Die gleichzeitige Inkubation mit Stattic f{\"u}hrte im Fluoreszenzpolarisations-Assay zur Inhibition der Bindung des Fluorescein-markierten Phosphotyrosin-Peptids an die SH2-Dom{\"a}ne von STAT3. Diese antagonistische Reaktion stellte sich als stark temperaturabh{\"a}ngig heraus und hatte in vitro bei der physiologisch relevanten Temperatur von 37°C nach 60 Minuten einen IC50 Wert von 5,1 µM. Zusammen mit einer Abh{\"a}ngigkeit von der Zeit wiesen die Ergebnisse auf eine irreversibel ablaufende Reaktion unter Kn{\"u}pfung einer kovalenten Bindung zwischen Stattic und STAT3 hin. Die Inhibition war spezifisch gegen{\"u}ber der Bindung verschiedener Fluorescein-markierten Phosphotyrosin-Peptide an die jeweiligen Proteine STAT1, STAT5b und Lck und Stattic hatte ebenfalls nur einen sehr geringen Effekt auf die Proteindimerisierung von c-Myc/Max und Jun/Jun. Die genauere Betrachtung der Kinetik der antagonistischen Reaktion zeigte eine signifikante Verlangsamung der Reaktionsgeschwindigkeit beim Vergleich zwischen STAT3 und STAT1 bzw. STAT3 und STAT5b. Die Inhibierung der Bindung des entsprechenden Fluorescein-markierten Phosphotyrosin-Peptids an das Protein Lck durch Stattic war hingegen nicht zeitabh{\"a}ngig. Diese Versuche zeigten eine deutliche Pr{\"a}ferenz der Bindung von Stattic an das Protein STAT3. Die Verdr{\"a}ngung des Fluorescein-markierten Phosphoytrosin-Peptids von der STAT3-SH2-Dom{\"a}ne durch Stattic verlief kompetitiv zur Inhibition mit einem Phophotyrosin-Peptid, welches an die SH2-Dom{\"a}ne von STAT3 bindet. In Verbindung mit den vorherigen Experimenten wies dies auf eine kovalente Bindung von Stattic innerhalb des STAT3-Proteins hin. Eine abschließende Struktur-Wirkungs-Beziehung in vitro zeigte die Notwendigkeit sowohl von der Nitrogruppe als auch von der Doppelbindung der Vinylsulfongruppe in Stattic f{\"u}r die Bindung an STAT3 und untermauerte die These, dass Stattic kovalent innerhalb des STAT3-Proteins bindet. In zellbiologischen Systemen wurde die Wirksamkeit von Stattic anhand verschiedener molekularbiologischer Assays best{\"a}tigt. Stattic inhibierte selektiv die Tyrosinphosphorylierung von STAT3 in HepG2 Zellen, in NIH3T3/v-Src Zellen und in den Brustkrebszelllinien MDA-MB-231 und MDA-MB-435S. Aber auch bereits phosphorylierte STAT3-Proteine wurden durch Stattic in vitro an der Homodimerisierung gehindert, was in einer EMSA-Analyse gezeigt wurde. Somit inhibierte Stattic in vitro selektiv die Signalkette von STAT3 unabh{\"a}ngig von dessen Aktivierungszustand. Andere Signalketten oder die Funktion der in der Signalkette {\"u}ber STAT3 liegenden Tyrosinkinasen wurden in Zellen nicht beeinflusst. Im Folgenden konnte demonstriert werden, dass Stattic als direkter STAT3-Inhibitor dessen Lokalisierung in den Zellkern inhibierte, nicht jedoch die Lokalisierung des Gegenspielers STAT1. Weiterhin reduzierte der Einsatz von Stattic selektiv das von v-Src in NIH3T3 Zellen induzierte und von STAT3-abh{\"a}ngige Wachstum von Kolonien in Weichagar. Dass Stattic schließlich selektiv die Apoptoserate in Zellen mit konstitutiver STAT3-Aktivt{\"a}t erh{\"o}hte, best{\"a}tigte die bisherigen Daten. Mit Stattic konnte daher ein neues biologisches Werkzeug generiert werden, um selektiv STAT3 in Zelllinien oder Tumoren in Tiermodellen auszuschalten, die eine konstitutive STAT3-Aktivit{\"a}t aufweisen.},
  subject      = {STAT},
  language  = {de}
}