@phdthesis{Froelich2012,
  author    = {Fr{\"o}lich, Nadine},
  title     = {Analyse der µ-Opiatrezeptoraktivierung und Signaltransduktion in lebenden Zellen mittels FRET-Mikroskopie},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-71009},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2012},
  abstract  = {Der Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer ist ein Ph{\"a}nomen, welches erstmals 1948 von Theodor F{\"o}rster beschrieben wurde. Mit der Entwicklung von Fluoreszenzproteinen konnten in Kombination mit Mikroskopietechniken Einblicke in zellbiologische Vorg{\"a}nge gewonnen werden, die durch biochemische oder physiologische Experimente nicht m{\"o}glich sind. Dabei spielt die hohe zeitliche und r{\"a}umliche Aufl{\"o}sung eine wichtige Rolle. Auf dem Forschungsgebiet der GPCR, welche die gr{\"o}ßte Gruppe von Membranproteinen bei den S{\"a}ugetieren darstellen, wurden insbesondere Erkenntnisse {\"u}ber Konformations{\"a}nderungen der Rezeptoren, die Kinetik der Rezeptoraktivierung und die Interaktion mit intrazellul{\"a}ren Signalproteinen gewonnen. Der µ-Opioidrezeptor geh{\"o}rt zur Familie der GPCR und stellt aufgrund seiner analgetischen Wirkungen eine wichtige pharmakologische Zielstruktur dar. Das Ziel dieser Arbeit war sowohl den Rezeptor als auch seine Signalwege mittels FRET-Mikroskopie zu untersuchen. Zun{\"a}chst sollte ein intramolekularer FRET-Sensor des µ-Opioidrezeptors entwickelt werden, dazu wurden basierend auf den Kenntnissen {\"u}ber die Terti{\"a}rstruktur und dem Aufbau bereits bekannter GPCR-Sensoren verschiedene Rezeptorkonstrukte kloniert. Bei den Konstrukten wurden entweder zwei Fluoreszenzproteine oder ein Fluoreszenzprotein und ein Fluorophor-bindendes Tetracysteinmotiv kombiniert. Auch die Positionen der eingef{\"u}gten Sequenzen wurden in den intrazellul{\"a}ren Dom{\"a}nen variiert, da der Rezeptor auf die Modifikationen mit beeintr{\"a}chtigter Membranlokalisation reagierte. Durch die Optimierung wurden Rezeptoren konstruiert, die an der Zellmembran lokalisiert waren. Jedoch zeigte keines der Rezeptorkonstrukte Funktionalit{\"a}t im Hinblick auf die Rezeptoraktivierung. Im zweiten Teil wurden die pharmakologischen Effekte der Metabolite von Morphin am humanen µ-Opioidrezeptor systematisch analysiert. Dazu wurde die F{\"a}higkeit der Metabolite, Gi-Proteine zu aktivieren und β-Arrestin2 zu rekrutieren, mittels FRET-basierter Messungen an lebenden Zellen untersucht. Außerdem wurde die Affinit{\"a}t der Metabolite zum humanen µ Opioidrezeptor anhand der Verdr{\"a}ngung eines radioaktiven Liganden analysiert. Meine Experimente identifizierten eine Gruppe mit stark agonistischen und eine mit schwach agonistischen Eigenschaften. Die starken Partialagonisten aktivieren den Rezeptor bereits bei nanomolaren Konzentrationen, w{\"a}hrend die schwachen Metabolite den Rezeptor erst bei Konzentrationen im mikromolaren Bereich aktivieren. Die Metabolite Normorphin, Morphin-6-Glucuronid und 6-Acetylmorphin zeigen geringere Potenz als Morphin bei der Gi-Aktivierung aber {\"u}berraschenderweise h{\"o}here Potenz und Effizienz f{\"u}r die β-Arrestin-Rekrutierung. Dies deutet auf eine bevorzugte Aktivierung von β-Arrestin2 hin. Die aus diesen Studien gewonnenen Ergebnisse liefern Hinweise darauf, welche Metabolite bei der Signalverarbeitung am µ Opioidrezeptor in vivo beteiligt sind.},
  subject      = {Opiatrezeptor},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Mayer2021,
  author    = {Mayer, Stefanie},
  title     = {Differenzierte β-Arrestin2 Rekrutierung am μ-Opioid Rezeptor durch klinisch eingesetzte Opioide},
  doi       = {10.25972/OPUS-24094},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-240949},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2021},
  abstract  = {Opioide geh{\"o}ren zu den potentesten Analgetika f{\"u}r die Behandlung akuter und chronischer Schmerzen, werden jedoch in ihrer Anwendung durch analgetische Toleranz aber auch Nebenwirkungen wie Abh{\"a}ngigkeit, Atemdepression und Obstipation limitiert. Opioid-Analgetika vermitteln dabei nahezu alle klinisch relevanten Wirkungen durch Stimulation des μ-Opioidrezeptors, einem G- Protein-gekoppelten Rezeptor. Die „klassische" Signaltransduktion durch Aktivierung inhibitorischer Gi/0-Proteine kann durch G-Protein gekoppelte Rezeptorkinasen (GRKs) und β-Arrestine negativ reguliert werden. Zus{\"a}tzlich k{\"o}nnen durch β-Arrestin-Bindung an den Rezeptor G-Protein-unabh{\"a}ngige Signalwege aktiviert werden. Die genauen Mechanismen wie β-Arrestin- assoziierte Rezeptordesensibilisierung, -internalisierung und G-Protein- unabh{\"a}ngige Signalwege an der physiologischen Antwort und insbesondere an Toleranzentwicklung und Abh{\"a}ngigkeit von Opioid-Analgetika beteiligt sind, k{\"o}nnen bislang nicht ausreichend erkl{\"a}rt werden. In dieser Arbeit konnte in HEK293-Zellen mit Lebendzell-Konfokalmikroskopie und Luciferase-Komplementierung f{\"u}r 17 Opioide eine differenzierte β-Arrestin2- Rekrutierung zum μ-Opioidrezeptor gezeigt werden. Von den untersuchten Opioiden sind 13 h{\"a}ufig eingesetzte Opioid-Analgetika. Durch die Erstellung detaillierter pharmakologischer Profile ließen sich die Opioide bez{\"u}glich ihres β- Arrestin2-Rekrutierungsverm{\"o}gens in Voll-, Partial und Antagonisten eingruppieren. Bemerkenswert war die fehlende β-Arrestin2-Rekrutierung f{\"u}r Buprenorphin, Tramadol und Tilidin, sodass diese interessante Substanzen f{\"u}r weitere Untersuchungen in physiologischerem Kontext sind. Durch {\"U}berexpression von GRK2 konnte die β-Arrestin2-Rekrutierung insbesondere f{\"u}r Partialagonisten gesteigert werden, was die Abh{\"a}ngigkeit der β-Arrestin- Rekrutierung vom GRK-Expressionslevel, das in verschiedenen Assays und Gewebetypen variieren kann, zeigt. Außerdem konnte ein heterogenes Bild der Rezeptorregulierung demonstriert werden, welches indirekt durch Endozytosehemmung unter Verwendung von Dynamin-Inhibitoren erfasst wurde. Die erhobenen Daten dienen als Ankn{\"u}pfungspunkt f{\"u}r weiteren Arbeiten auf dem Gebiet der μ-Opioidrezeptorregulation. Ein besseres Verst{\"a}ndnis der molekularen Mechanismen ist n{\"o}tig, um sichere und nebenwirkungs{\"a}rmere Opioid-Analgetika entwickeln zu k{\"o}nnen.},
  subject      = {Opiatrezeptor},
  language  = {de}
}