@phdthesis{Leibold2003,
  author    = {Leibold, Christian},
  title     = {Das Cystein String Protein von Drosophila melanogaster - Invivo-Funktionsanalyse verschiedener Proteindom{\"a}nen am Modellsystem der larvalen neuromuskul{\"a}ren Synapse},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-7481},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2003},
  abstract  = {Cystein String Proteine (CSPs) wurden als synaptische Vesikelproteine entdeckt. In Drosophila werden sie in den funktionellen Synapsen und sekretorischen Organellen aller Entwicklungsstufen exprimiert. Es konnte gezeigt werden, dass CSPs an der regulierten Neurotransmitteraussch{\"u}ttung beteiligt sind und mehrere, von Insekten bis zum Menschen konservierte Dom{\"a}nen besitzen: eine N-terminale Phosphorylierungsstelle der Protein Kinase A (PKA), eine J-Dom{\"a}ne mit 50\%iger Homologie zum bakteriellen Chaperone-Protein DnaJ, eine Linker-Dom{\"a}ne, einen Cystein String aus elf aufeinander folgenden Cysteinen, die durch zwei Cystein-Paare flankiert werden und einen variableren C-Terminus. Es wurden Interaktionen mit den Proteinen HSC70, SGT, Syntaxin, Synaptobrevin/VAMP, verschiedenen Untereinheiten von G-Proteinen, Synaptotagmin, sowie spannungsabh{\"a}ngigen Ca2+-Kan{\"a}len beschrieben. csp-Nullmutanten CspU1 von Drosophila melanogaster zeigen einen temperatursensitiven Ph{\"a}notyp, in dem adulte Fliegen von CspU1 reversibel bei 37°C innerhalb von drei Minuten paralysieren. An der neuromuskul{\"a}ren Synapse dritter Larven von CspU1 kann bei nicht-permissiver Temperatur von 32°C eine reversible Blockade der synaptischen Transmission beobachtet werden. In der vorliegenden Arbeit sollten mit Hilfe des larvalen Nerv-Muskel-Pr{\"a}parats dritter Larven elektrophysiologische Untersuchungen an verschiedenen csp-Mutanten durchgef{\"u}hrt werden. Hierdurch sollte die Bedeutung der einzelnen Dom{\"a}nen f{\"u}r die Funktion von csp weiter aufgekl{\"a}rt werden. Am larvalen Nerv-Muskel-Pr{\"a}parat von Drosophila ist eine Arbeit auf Einzel-Zell-Niveau m{\"o}glich. Die Segmentierung, die wiederkehrende Anordnung von Muskeln und innervierenden Motoneuronen, sowie das Vorkommen vieler auch im Gehirn von Drosophila lokalisierter synaptischer Proteine machen die larvale neuromuskul{\"a}re Synapse f{\"u}r die vorliegenden Fragestellungen. Wie in vielen anderen Arbeiten, wurden elektrophysiologische Messungen an dem Longitudinalmuskel 6 durchgef{\"u}hrt. Alle Messungen evozierter Muskelpotentiale (EJP) wurden, wenn nicht anders erw{\"a}hnt, mit 0,2Hz Stimulusfrequenz durchgef{\"u}hrt. Die Reiz-Intensit{\"a}t wurde an jedes Pr{\"a}parat individuell angepasst und betrug das 2 ½ -fache des Initial-Schwellenwertes, bei dem ein vollst{\"a}ndiges EJP ausgel{\"o}st wurde. Zun{\"a}chst konnte der in der Literatur beschriebene larvale Block der synaptischen Transmitteraussch{\"u}ttung bei erh{\"o}hter Temperatur nicht reproduziert, jedoch durch R{\"u}ckkreuzungen der Nullmutante CspU1 gegen den Wildtyp w1118 wiederhergestellt werden. Das „Rescue"-Konstrukt scDNA1, welches die Grundlage f{\"u}r alle weiteren mutierten Formen von csp darstellt, rettete den larvalen temperatursensitiven Ph{\"a}notyp im csp-Nullmutantenhintergrund von CspU1 vollst{\"a}ndig. Larvale Mutanten der Linie SSP, bei denen der Cystein String durch einen Serin String ausgetauscht worden war (Serine-string protein), zeigten in {\"U}bereinstimmung mit den adulten Fliegen den bekannten temperatursensitiven Ph{\"a}notyp. Larvale Mutanten der Linie CLP (Cysteine-less protein) zeigten im Gegensatz zu adulten Tieren dieser Linie keinen temperatursensitiven Ph{\"a}notyp, sondern ein wildtypisches Verhalten. F{\"u}r die Mutante L\&\#8710;8, die im Nullmutantenhintergrund von CspU1 roc ein in der Linker-Dom{\"a}ne um acht Aminos{\"a}uren verk{\"u}rztes CSP-Protein exprimiert, wurden verschiedene elektrophysiologische Ph{\"a}notypen beobachtet: Larven der X-chromosomalen Linie zeigten den bekannten temperaturabh{\"a}ngigen Block der synaptischen Transmission. Larven der Insertionslinie f{\"u}r das 3. Chromosom zeigten keine Temperatursensitivit{\"a}t, sondern wildtypisches Verhalten. In immunhistochemischen Untersuchungen konnte f{\"u}r die X-chromosomale Linie eine deutlich schw{\"a}chere Expression des L\&\#8710;8-Proteins beobachtet werden. Larven der Linie C\&\#8710;27, die ein im C-terminalen Bereich von CSP um 27 Aminos{\"a}uren verk{\"u}rztes CSP-Protein exprimieren, im Nullmutantenhintergrund CspU1 roc konnten anhand des Ph{\"a}notyps in zwei Gruppen unterteilt werden. Unabh{\"a}ngig vom Insertionsort zeigte eine Gruppe den bekannten larvalen temperatursensitiven Ph{\"a}notyp. Die zweite Gruppe zeigte auch bei erh{\"o}hter Temperatur wildtypisches Verhalten. Im zweiten Teil der Arbeit wurde versucht, eine neue Deletionsmutante f{\"u}r csp durch Remobilisierung einer P-Insertion (P\#1617, flybase, Bloomington) im ersten Exon zu erzeugen, da in der Nullmutante CspU1 m{\"o}glicherweise auch benachbarte Gene betroffen sind. Nach {\"U}berpr{\"u}fung der erzeugten Mutanten durch Western und Southern Blot, immunhistochemische Experimente und elektrophysiologische Untersuchungen am Nerv-Muskel-Pr{\"a}parat 3. Larven konnte keine Deletionsmutante mit temperaturabh{\"a}ngigem Ph{\"a}notyp isoliert werden, die ausschließlich csp betraf.},
  subject      = {Taufliege},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Jauch2010,
  author    = {Jauch, Mandy},
  title     = {Die Serin/Arginin Proteinkinase 79D (SRPK79D) von Drosophila melanogaster und ihre Rolle bei der Bildung Aktiver Zonen von Synapsen},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-53974},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2010},
  abstract  = {Synapsen als Stellen der Kommunikation zwischen Neuronen besitzen spezialisierte Bereiche - Aktive Zonen (AZs) genannt -, die aus einem hoch komplexen Netzwerk von Proteinen aufgebaut sind und die Maschinerie f{\"u}r den Prozess der Neurotransmitter-Aussch{\"u}ttung und das Vesikel-Recycling beinhalten. In Drosophila ist das Protein Bruchpilot (BRP) ein wichtiger Baustein f{\"u}r die T-f{\"o}rmigen B{\"a}nder („T-Bars") der pr{\"a}synaptischen Aktiven Zonen. BRP ist notwendig f{\"u}r eine intakte Struktur der Aktiven Zone und eine normale Exocytose von Neurotransmitter-Vesikeln. Auf der Suche nach Mutationen, welche die Verteilung von Bruchpilot im Gewebe beeintr{\"a}chtigen, wurde eine P-Element-Insertion im Gen CG11489 an der Position 79D identifiziert, welches eine Kinase kodiert, die einen hohen Grad an Homologie zur Familie der SR Proteinkinasen (SRPKs) von S{\"a}ugern aufweist. Die Mitglieder dieser Familie zeichnen sich durch eine evolution{\"a}r hoch konservierte zweigeteilte Kinasedom{\"a}ne aus, die durch eine nicht konservierte Spacer-Sequenz unterbrochen ist. SRPKs phosphorylieren SR-Proteine, die zu einer evolution{\"a}r hoch konservierten Familie Serin/Arginin-reicher Spleißfaktoren geh{\"o}ren und konstitutive sowie alternative Spleißprozesse steuern und damit auf post-transkriptioneller Ebene die Genexpression regulieren. Mutation des Srpk79D-Gens durch die P-Element-Insertion (Srpk79DP1) oder eine Deletion im Gen (Srpk79DVN Nullmutante) f{\"u}hrt zu auff{\"a}lligen BRP-Akkumulationen in larvalen und adulten Nerven. In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, dass diese BRP-Akkumulationen auf Ultrastruktur-Ebene ausgedehnten axonalen Agglomeraten elektronendichter B{\"a}nder entsprechen und von klaren Vesikeln umgeben sind. Charakterisierung durch Immuno-Elektronenmikroskopie ergab, dass diese Strukturen BRP-immunoreaktiv sind. Um die Bildung BRP-enthaltender Agglomerate in Axonen zu verhindern und damit eine intakte Gehirnfunktion zu gew{\"a}hrleisten, scheint die SRPK79D nur auf niedrigem Niveau exprimiert zu werden, da die endogene Kinase mit verschiedenen Antik{\"o}rpern nicht nachweisbar war. Wie in anderen Arbeiten gezeigt werden konnte, ist die Expression der PB-, PC- oder PF-Isoform der vier m{\"o}glichen SRPK79D-Varianten, die durch alternativen Transkriptionsstart in Exon eins beziehungsweise drei und alternatives Spleißen von Exon sieben zustande kommen, zur Rettung des Ph{\"a}notyps der BRP-Akkumulation im Srpk79DVN Nullmutanten-Hintergrund ausreichend. Zur Charakterisierung der Rescue-Eigenschaften der SRPK79D-PE-Isoform wurde mit der Klonierung der cDNA in einen UAS-Vektor begonnen. Offenbar beruht die Bildung der axonalen BRP-Agglomerate nicht auf einer {\"U}berexpression von BRP in den betroffenen Neuronen, denn auch bei reduzierter Expression des BRP-Proteins im Srpk79DVN Nullmutanten-Hintergrund entstehen die BRP-Agglomerate. In K{\"o}pfen der Srpk79DVN Nullmutante ist die Gesamtmenge an Bruchpilot-Protein im Vergleich zum Wildtyp nicht deutlich ver{\"a}ndert. Auch die auf Protein-Ebene untersuchte Expression der verschiedenen Isoformen der pr{\"a}synaptischen Proteine Synapsin, Sap47 und CSP weicht in der Srpk79DVN Nullmutante nicht wesentlich von der Wildtyp-Situation ab, sodass sich keine Hinweise auf ver{\"a}ndertes Spleißen der entsprechenden pr{\"a}-mRNAs ergeben. Jedes der sieben bekannten SR-Proteine von Drosophila ist ein potentielles Zielprotein der SRPK79D. Knock-down-Experimente f{\"u}r die drei hier untersuchten SR-Proteine SC35, X16/9G8 und B52/SRp55 im gesamten Nervensystem durch RNA-Interferenz zeigten allerdings keinen Effekt auf die Verteilung von BRP im Gewebe. Hinsichtlich der Flugf{\"a}higkeit der Tiere hat die Srpk79DVN Nullmutation keinen additiven Effekt zum Knock-down des BRP-Proteins, denn die Doppelmutanten zeigten bei der Bestimmung des Anteils an flugunf{\"a}higen Tieren vergleichbare Werte wie die Einzelmutanten, die entweder die Nullmutation im Srpk79D-Gen trugen, oder BRP reduziert exprimierten. Vermutlich sind Bruchpilot und die SR Proteinkinase 79D somit Teil desselben Signalwegs. Durch Doppelf{\"a}rbungen mit Antik{\"o}rpern gegen BRP und CAPA-Peptide wurde abschließend entdeckt, dass Bruchpilot auch im Median- und Transvers-Nervensystem (MeN/TVN) von Drosophila zu finden ist, welche die Neuroh{\"a}mal-Organe beherbergen. Aufgabe dieser Organe ist die Speicherung und Aussch{\"u}ttung von Neuropeptid-Hormonen. Daher ist zu vermuten, dass das BRP-Protein neben Funktionen bei der Neurotransmitter-Exocytose m{\"o}glicherweise eine Rolle bei der Aussch{\"u}ttung von Neuropeptiden spielt. Anders als in den Axonen der larvalen Segmental- und Intersegmentalnerven der Srpk79DVN Nullmutante, die charakteristische BRP-Agglomerate aufweisen, hat die Mutation des Srpk79D-Gens in den Axonen der Va-Neurone, die das MeN/TVN-System bilden, keinen sichtbaren Effekt auf die Verteilung von Brp, denn das Muster bei F{\"a}rbung gegen BRP weist keine deutlichen Ver{\"a}nderungen zum Wildtyp auf.},
  subject      = {Taufliege},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Huber2003,
  author    = {Huber, Saskia},
  title     = {Charakterisierung von SAP47 in Drosophila melanogaster und der dazugeh{\"o}rigen Proteinfamilie},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-7777},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2003},
  abstract  = {In der Arbeit wird ein synapsenassoziiertes Protein, das SAP47 und seine zugeh{\"o}rige Proteinfamilie charakterisiert.},
  subject      = {Taufliege},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Funk2003,
  author    = {Funk, Natalja},
  title     = {Das Sap47-Gen aus Drosophila melanogaster : Gezielte Mutagenisierung und Suche nach Interaktionspartnern},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-7667},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2003},
  abstract  = {SAP47 ist ein Synapsenassoziiertes Protein von 47 kDa aus Drosophila melanogaster, das zu einer neuen Proteinfamilie geh{\"o}rt. Um eine Sap47 Mutante zu erzeugen wurden drei Methoden eingesetzt: Gezielte Mutagenese durch homologe Rekombination, RNA interference (RNAi) und Transposon Remobilisierung. Um einen Interaktionspartner f{\"u}r das SAP47 Protein zu identifizieren wurden ein Yeast-Two-Hybrid System und das "CytoTrap" Verfahren eingesetzt.},
  subject      = {Taufliege},
  language  = {de}
}