@phdthesis{Jeworutzki2009,
  author    = {Jeworutzki, Elena},
  title     = {Elektrophysiologische Untersuchungen zur fr{\"u}hen Erkennungsphase zwischen Pflanzen und Mikroorganismen},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-47489},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2009},
  abstract  = {An der pflanzlichen Plasmamembran geschieht die erste Wahrnehmung von mikrobiellen Molek{\"u}len, die MAMPs genannt werden. MAMP/PAMP Rezeptoren leiten fr{\"u}he Abwehrantworten, wie die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), externe Alkalisierung oder Ethylen, ein. Die Arabidopsis FLS2 rezeptorartige Kinase (RLK) stellt einen plasmamembran-lokalisierten MAMP Rezeptor dar, der {\"u}ber die Detektion des Flagellum von Pseudomonas species, eine basale Immunit{\"a}t in Arabidopsis thaliana vermittelt. Flg22, der k{\"u}rzeste aktive Teil des bakteriellen Flagellins besteht aus 22 Aminos{\"a}uren und ist der bestuntersuchte bakterielle Elizitor. In der vorliegenden Arbeit zeigen wir eine starke Beteiligung von Ionenfl{\"u}ssen in der Initiationsphase der basalen Immunit{\"a}t. Unsere Messungen an intakten Arabidopsis Pflanzen und Pflanzengeweben sind in h{\"o}chstem Masse reproduzierbar und {\"o}ffnen eine neue Sicht, {\"u}ber die Natur von Ionentransporten in der Pflanzen - Mikroben Interaktion. Als Antwort auf die Applikation von flg22, haben wir nach einer Verz{\"o}gerungsphase von etwa 2 Minuten eine transiente, dosis-abh{\"a}ngige Depolarisation (EC50=0,2 nM) in Mesophyll- und Wurzelhaarzellen von A. thaliana messen k{\"o}nnen. Das um 2 Amins{\"a}uren k{\"u}rzere Peptid flg22 \&\#916;2 oder das Flagellin anderer Bakterien (Agrobacterium or Azospirillum) f{\"u}hrten zu keiner Membrandepolarisation. Ebenso konnten keine Membranspannungs{\"a}nderungen in dem Arabidopsis {\"O}kotypen Ws-0, dem der funktionelle FLS2 Rezeptor fehlt, detektiert werden. Die Komplementation von Ws-0 Pflanzen mit dem intakten FLS2 Rezeptorgen rief eine Resensibilisierung f{\"u}r flg22 hervor. Mit dem EF-Tu Elizitor Peptid aus E.coli, welches durch den Arabidopsis MAMP Rezeptor EFR detektiert wird, wurden {\"a}hnliche Ergebnisse erzielt. Auf der Basis von Aequorin wurden Kalzium-induzierte Lumineszenzmessungen durchgef{\"u}hrt, in denen ein transienter Anstieg der zytosolischen Kalziumkonzentration als Antwort auf die Applikation von flg22 gemessen werden konnte. Dosis-Abh{\"a}ngigkeitsmessungen von flg22 und [Ca2+]cyt wiesen zwei unterschiedliche EC50 Werte, von 43 ± 2 pM und 67 ± 42 nM, auf. M{\"o}glicherweise wird auf zwei verschiedene Kalziumpools zugegriffen oder es werden zwei verschiedene Kalziumleitf{\"a}higkeiten aktiviert. Die Ionenkanalaktivierung und folgende Depolarisation ben{\"o}tigt die aktive Rezeptorkinase. In bak1-4 Arabidopsis Pflanzen, in denen die FLS2 Untereinheit BAK1 - eine weitverbreitete RLK, die auch mit dem Brassinosteroid Rezeptor assoziiert ist - fehlt, konnte keine Depolarisation als Antwort auf flg22 gemessen werden. Arabidopsis Mesophyllzellen zeigten die typische Alkalisierung des Apoplasten als Antwort auf flg22. Nicht-invasive MIFETM Experimente mit Ionen-selektiven Elektroden ergaben, dass der pH-Anstieg durch einen Einstrom von Protonen hervorgerufen wurde. Zus{\"a}tzlich wurde ein Ausstrom von Chlorid und Kalium aufgezeichnet. {\"A}hnlich wie das Kalziumsignal waren alle detektierten Ionenstr{\"o}me von transienter Natur. Im zweiten Ansatz wurden Membranpotential-Messungen durchgef{\"u}hrt, w{\"a}hrend in der externen L{\"o}sung die Konzentrationen von Protonen, Kalzium, Kalium oder Anionen variiert wurden. Nur eine {\"A}nderung des Anionengradienten hatte einen entscheidenden Einfluss auf die flg22-induzierte Depolarisation, was die Wichtigkeit der Anionenkanalaktivierung unterstreicht. Exudat Analysen ergaben, dass Nitrat das bevorzugt transportierte Ion ist. Unter zahlreichen getesteten Ionenkanalblockern erwies sich lediglich Lanthan als effektiver Blocker des flg22-induzierten zytosolichen Kalziumanstiegs, des Protoneneinstroms und der Membrandepolarisation. Da Lanthan bekanntlich unspezifische Kationenkan{\"a}le blockt, kann man an diesem Punkt davon ausgehen, dass Kalzium-aktivierte Anionenkan{\"a}le die Membrandepolarisation vermitteln und darauf eine Aktivierung von ausw{\"a}rtsgerichteten Kaliumkan{\"a}len folgt. Zuk{\"u}nftige Studien mit Doppell{\"a}ufigen-Mikroelektroden Spannungsklemmexperimenten oder externen ionenselektiven Elektroden an intakten Schliesszellen werden helfen weitere Informationen {\"u}ber die Natur der Ionenkan{\"a}le in der basalen Immunit{\"a}t oder generell in der Pflanzen-Mikroben Interaktion zu erhalten. {\"U}ber die elektrophysiologische Charakterisierung der multiplen Ionenstr{\"o}me in der basalen Immunit{\"a}t hinaus, ist nat{\"u}rlich der n{\"a}chste wichtige Schritt das oder die Gene zu finden, die f{\"u}r die Ionenkan{\"a}le oder Transporter kodieren, die durch nicht nekrotisierende Elizitoren wie flg22 in der basalen Immunantwort in Pflanzen aktiviert werden.},
  subject      = {Calcium},
  language  = {de}
}